测定细胞培养上清液中亚硝酸盐的荧光分光光度法

目的 :建立检测细胞培养上清液中亚硝酸盐的方法。方法 :以 2 ,3 -二氨基萘与亚硝酸盐反应生成荧光产物 2 ,3 -二氨基萘三唑或 1-[H] -萘三唑 ,用荧光分光光度法测定。结果 :2 ,3 -二氨基萘浓度为 0 63mmol·L- 1,反应液和终止反应后pH值各为 2 0 0和 12 10 ,2 0℃水浴 15min是较适测定条件。本法的检出限为 61 3 4nmol·L- 1,日内和日间变异系数分别小于 3 %和 5% ,加入NaNO2 0 3 6、1 45、2 54nmol的回收率各为 99 12 %±4 64%、10 3 2 8%± 2 68%、10 5 14 %± 4 3 6%。测定大鼠腹腔巨噬细胞、大鼠胎鼠大脑半球神经细胞培养上清液亚硝酸盐含量分别为 ( 10 9 95± 4 57) μmol·L- 1和 ( 6 52± 1 57) μmol·L- 1,后者的 95%分布范围为 3 44-9 60 μmol·L- 1。核磁共振氢谱显示标准品化学位移δ7 3 3 0 2 7ppm和细胞培养上清液化学位移δ7 3 3 0 2 3ppm。结论 :本法特异、敏感、快速、简便 。

链球菌抗原刺激的银屑病外周血单个核细胞培养上清液对角质形成细胞的作用

目的了解链球菌抗原刺激的银屑病外周血单个核细胞(PBMCs)培养上清液对角质形成细胞的作用以探讨链球菌感染后的银屑病的发病机制。方法3H-TdR掺入法检测PBMCs培养上清液对角质形成细胞DNA合成的影响;免疫组织化学方法检测细胞间黏附因子1(ICAM-1)和人类白细胞抗原DR分子(HLA-DR)表达。结果银屑病患者链球菌抗原刺激的PBMCs培养上清液对角质形成细胞的促增殖作用较对照组显著增强,并能诱导角质形成细胞表达HLA-DR和ICAM-1分子。结论受链球菌抗原刺激的银屑病PBMCs培养上清液可促进角质形成细胞增殖和活化,可能是链球菌感染之后银屑病发病的重要原因。

人肿瘤细胞培养上清对树突状细胞表型和功能的影响

目的 :观察肿瘤细胞分泌的可溶性因子对树突状细胞表型和功能的影响 ,以进一步揭示肿瘤的免疫逃逸机制。 方法 :体外分离单核细胞 ,加入白细胞介素 4 (IL - 4 )、粒 -巨噬细胞集落刺激因子 (GM- CSF)和肿瘤细胞培养上清体外培养树突状细胞 ,采用流式细胞术、同种异体混合淋巴细胞反应等方法观察肿瘤细胞上清对树突状细胞表型和功能的影响 ,并用逆转录 -聚合酶链反应 (RT- PCR)法检测了免疫抑制因子 IL - 10、血管内皮生长因子 (VEGF)和转化生长因子β1 (TGF-β1 )的 m RNA在人结肠、人卵巢和人肝脏肿瘤细胞中的表达。 结果 :当培养体系中加入人肿瘤细胞培养上清后 ,树突状细胞表面 MHC 类分子和 CD80等共刺激分子的表达较低 ,树突状细胞刺激 T细胞增殖能力下降 ,且 IL - 10 m RNA、VEGF m RNA和 TGF-β1 m RNA在 3种肿瘤细胞中均有不同程度的表达。 结论 :提示肿瘤细胞培养上清可能抑制树突状细胞的抗原提呈能力 ,肿瘤细胞分泌的免疫抑制因子可能是导致肿瘤微环境中的树突状细胞功能低下、机体的免疫系统无法有效激活和启动抗肿瘤免疫反应的原因之一。

HepG2．2．15细胞培养上清液中HBVDNA及其抗原的检测

乙型肝炎病毒（HBV）是一种引起急性和慢性坏死炎症性肝病及肝细胞癌的DNA病毒。HBV具有特异嗜肝性、非细胞损伤与裂解、易发展为慢性等特征。HepG2．2．15细胞是能够表达HBV抗原和分泌完整HBV颗粒的肝胚瘤细胞系，也是目前用来研究HBV复制．肝细胞对干扰素（IFN）应答最为合适的细胞模型系统。

PHA、抗CD_3单克隆抗体、LI-2诱导牌细胞培养上清液抗肿瘤效应的研究

本文探讨了PHA、CD_3单克隆抗体、IL-2体外诱导正常人脾细胞培养上清液抗肿瘤效应及其对LAK细胞抗肿瘤效应的增强作用。结果显示，IL-2诱导脾细胞的培养上清液在体外不仅具有直接杀伤肿瘤细胞效应，并且能增强LAK细胞的抗肿瘤作用。PHA、抗CD_3单克隆抗体和IL-2联合刺激可增强脾细胞培养上清液杀伤肿瘤细胞效应。

柱前衍生化HPLC法测定CHO细胞培养上清中氨基酸浓度

以6-氨基喹啉基-N-羟基琥珀酰-亚氨基甲酸酯为柱前衍生化试剂,结合HPLC技术,首次建立了定量分析CHO细胞培养上清中氨基酸浓度的方法。选用Agilent 1260型高效液相色谱仪,AccQ-TagTM柱,以流动相A和流动相B[乙腈-水(60∶40,体积比)]进行梯度洗脱,荧光激发波长为250nm,发射波长为395nm,柱温为42.5℃,进样量为5μL。结果表明:21种氨基酸的线性回归系数均大于0.99,连续6次测定培养上清中氨基酸组分峰面积RSD均小于5%;21种氨基酸9次测定的平均加标回收率为96.8%,RSD为4.93%。该方法快速、简便、重复性好、结果准确,符合动物细胞培养上清中氨基酸分析的要求。

Lewis肺癌细胞培养上清液通过调控糖酵解途径增强小鼠髓源性抑制细胞的免疫抑制功能

目的探讨Lewis肺癌细胞培养上清(TCCM)对髓源性抑制细胞(MDSC)代谢和功能的影响。方法免疫磁珠法分离Lewis肺癌移植瘤小鼠脾脏MDSC,用小鼠TCCM处理MDSC 48 h后,实时荧光定量PCR检测MDSC中乳酸脱氢酶A(LDHA)及葡萄糖转运蛋白1(GLUT1)、缺氧诱导因子1α(HIF-1α)mRNA的水平,己糖激酶(HK)法检测葡萄糖浓度,乳酸检测试剂盒检测糖酵解途径终产物乳酸含量,羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(CFSE)染色结合流式细胞术检测MDSC对CD4^+T细胞增殖的抑制作用,精氨酸酶1(ARG1)检测试剂盒检测MDSC的ARG1活性,一氧化氮试剂盒检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的分泌水平。结果与未处理组相比,TCCM处理过的MDSC糖酵解途径关键酶LDHA的mRNA水平及糖酵解途径相关蛋白GLUT1、HIF-1α的mRNA水平明显上调,MDSC分泌的免疫抑制性效应分子ARG1的活性和iNOS的分泌量显著增加,MDSC对CD4^+T细胞增殖的抑制作用明显增强。结论TCCM能够激活MDSC的糖酵解途径,上调其对CD4^+T细胞增殖的抑制作用及免疫抑制效应分子的释放。

结肠癌LS174细胞培养上清对树突状细胞诱导CTL杀伤效应的影响

目的:观察结肠癌细胞对人单个核细胞源树突状细胞(DC)诱导的CTL杀伤效应的影响,探讨其在人体的免疫逃避机制.方法:人外周血分离单个核细胞以GM-CSF和IL-4培养DC,用结肠癌LS174细胞的提取物诱导DC,并激活T淋巴细胞抗肿瘤效应,在此不同过程中,体系中加入人结肠癌细胞系LS174的培养上清液.以正常培养体系为对照,通过计算细胞毒杀伤率检测不同条件下DC激活同种异体T淋巴细胞杀伤肿瘤细胞的能力.结果:LS174细胞培养上清液作为条件培养的DC,在DC培养的早期阶段对DC激活过程有明显的影响(在DC培养的第1d加入肿瘤培养上清组,第3d加入肿瘤培养上清组vs正常培养的DC组,DC培养第5d加入肿瘤培养上清组,DC激活T淋巴细胞过程加入肿瘤培养上清组,P<0.05).结论:肿瘤细胞分泌的某些物质可在DC培养的早期阶段影响肿瘤的免疫,这可能是肿瘤细胞逃避机体免疫监视的机制之一.

人肺癌PG细胞培养上清液对PBMC凋亡的影响

目的:探讨PG肿瘤上清对外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)的增殖抑制及诱导凋亡方面的影响,并探讨了PG细胞影响PBMC凋亡的作用机制。方法:在PBMC培养体系中分别加入不同条件的PG培养上清。在24、72小时收集PBMC,采用流式细胞术测定其对PBMC细胞周期、凋亡率的影响,另外,通过免疫印迹法、流式细胞术分别测定了Bcl-2、Fas蛋白表达的情况来观察PBMC凋亡相关蛋白的变化。结果:PG肿瘤上清没有抑制PBMC进入细胞周期,在PG上清的作用下,PBMC凋亡率显著增加,并且发现PG上清能够调节PBMC内凋亡相关蛋白Bcl-2、Fas的表达量。结论:PG上清能够调节PBMC凋亡相关蛋白量,进而诱导PBMC凋亡,这可能是导致肿瘤微环境中PBMC数量低下的主要原因。

嗅鞘细胞培养上清液促进大鼠周围神经损伤后的修复与再生

背景:既往研究发现嗅鞘细胞培养上清可以促进脊髓损伤后轴突再生及功能恢复,但应用于周围神经损伤治疗方面鲜有报道。目的:探讨嗅鞘细胞培养上清是否有助于周围神经损伤后的神经修复。方法:分离纯化嗅鞘细胞并鉴定,制备嗅鞘细胞培养上清。在体外环境将嗅鞘细胞培养上清作用于背根神经节组织块,观察背根神经节轴突生长情况;在体内环境将嗅鞘细胞培养上清应用于大鼠坐骨神经缺损模型,观察坐骨神经轴突再生及髓鞘化情况。结果与结论:①嗅鞘细胞纯度高达(94.4±3.1)%;②与空白对照组和低剂量嗅鞘细胞上清组对比,高剂量嗅鞘细胞上清组背根神经节组织块的5根最长神经轴突平均长度显著增加(P<0.05);③免疫荧光显示嗅鞘细胞上清处理组与自体神经移植组类似,再生神经贯通缺损区域,并且再生神经排列有序,神经再生情况显著优于空白对照组;④透射电子显微镜观察显示嗅鞘细胞上清处理组再生神经轴突的数量和髓鞘厚度显著高于空白对照组(P<0.05);⑤结果表明,嗅鞘细胞培养上清能够促进周围神经损伤后轴突再生及再生轴突的髓鞘化,为周围神经损伤提供了一种新的基于嗅鞘细胞的无细胞疗法。

高效提取细胞培养上清外泌体方法的建立

目的建立一种快速、简单且高效提取细胞培养上清中外泌体的方法,以期促进外泌体在临床与疾病治疗中的应用。方法将羟基(OH)修饰磁珠与高分子化合物Buffer EXD结合,建立新的外泌体提取系统,并使用该系统提取细胞培养上清中的外泌体。通过Western blot法检测外泌体标志蛋白的表达变化;纳米颗粒追踪分析(nanoparticles tracking analysis,NTA)技术检测外泌体的粒径大小和浓度;透射电子显微镜(transmission electron microscope,TEM)技术检测外泌体的形态结构。对Buffer EXD系统提取外泌体的方法进行优化(提取pH、Buffer EXD比例、孵育时间、磁珠用量及种类)。结合细胞培养和显微拍照技术分析新系统纯化的外泌体对A549细胞增殖的影响。结果新系统提取的外泌体样品中标志蛋白Alix、CD9和CD81等表达水平较高,而外泌体阴性蛋白Calnexin表达较少;新系统提取的外泌体粒径峰值在100 nm左右,具有茶托状的典型形状。新系统的pH为5.0,Buffer EXD浓度为20%,1.75%的OH磁珠与样品孵育时间为40 min时,提取的外泌体样品中标志蛋白含量最高。新系统提取的外泌体对A549细胞的增殖具有明显的促进作用。结论以OH修饰的磁珠为介质,结合高分子化合物Buffer EXD,成功建立了一种可快速、简单、高效地从细胞上清中提取结构完整、形态特征明显且具有生物学功能外泌体的新体系。

实验性哮喘小鼠脾细胞培养上清液IL-5的测定及其意义

本文欲探讨IL 5在哮喘发病机制中的作用。用卵蛋白 (OVA)造模形成哮喘鼠 ,取其脾T淋巴细胞体外培养。以ELISA法测定细胞培养上清液中IL 5浓度。结果经OVA刺激的哮喘鼠T淋巴细胞培养上清液中IL 5 (4 4 6± 6 2pg/ml)明显增高 ;与健康鼠比较有显著性差别 (P <0 0 1)。认为T淋巴细胞产生的IL 5与哮喘气道炎症可能有关。

黑素瘤细胞培养上清液对人单核细胞体外IL-12产生和CD14、CD1a表达的影响

目的探讨M14黑素瘤细胞培养上清液(MCS)在体外对人外周血单核细胞分泌白介素12 (IL-12)以及单核细胞向树突细胞分化的影响。方法分离并获得人外周血单核细胞,添加不同量的MCS与单核细胞共培养,用酶联免疫吸附法(ELISA)检测单核细胞IL-12的分泌情况;将MCS与单核细胞连续5d共培养,用流式细胞仪分析单核细胞表面CD14、CD1a的表达情况。结果MCS对单核细胞分泌活性的影响呈浓度依赖关系,随MCS添加量的逐渐增加(25-100μL),单核细胞分泌IL-12的量则呈逐渐降低趋势(158.40±21.37 pg/mL-56.90±15.60 pg/mL,P<0.05);同时MCS妨碍单核细胞由CD14表型(5.47%±1.00%-17.87%±2.40%,P<0.01)向树突细胞CD1a表型(41.00%±2.12%-20.00%±4.24%,P<0.01)转化;且MCS抑制单核细胞IL-12分泌和抑制单核细胞向树突细胞表型转化的作用均能被细胞外信号调节激酶(ERK)特异性抑制剂(PD98059)所逆转(分别为:172.63±8.88 pg/mL,P<0.05; 8.67%±0.47%,P<0.05;36.67%±0.71%,P<0.05)。结论MCS可能通过分泌ERK刺激因子对单核细胞分泌IL-12p40和单核细胞分化起到抑制作用。

脾LAK细胞培养上清中BLT酯酶活性的动态观察

脾ＬＡＫ细胞培养上清有前后两个杀伤活性高峰，以第１１ｄ为界，第一个活性高峰与上清中ＢＬＴ酯酶活性呈正相关。含血清和无血清的培养体系产生ＢＬＴ酯酶的机理可能不同。在有高活性ｒＩＬ－２时，ＢＬＴ酯酶的分泌与无血清培养液中有无２－ＭＥ相关。

贴壁细胞培养过程中支原体污染的几种救治方案疗效比较研究

支原体是细胞培养中最常见、不易被察觉和干扰实验结果的污染物，约有30．3％～50．5％的细胞培养物中有支原体污染。培养细胞中支原体污染的来源包括：所使用的动物来源的一些产品如血清或已被支原体污染的细胞株系。细胞培养上清液中支原体的浓度可达10^7个/ml,而培养的细胞看起来很正常．在肉眼观察或普通光学显微镜下观察。受污染的细胞可无明显变化日。

芦荟多糖对体外培养人表皮细胞分泌细胞因子及一氧化氮的影响

目的研究芦荟多糖对体外培养人表皮细胞分泌细胞因子及一氧化氮(NO)的影响。方法测定经25、50、100、200和400mg/L,不同浓度芦荟多糖作用后的人表皮细胞培养上清液中转化生长因子-α(TGF-α)、TGF-β、白细胞介素-1β(IL-1β)、IL-6、IL-8、肿瘤坏死因子(TNF)及NO的水平;对照组则用等体积的细胞培养液处理。结果与对照组比较,经芦荟多糖作用后,培养液中TGF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6、IL-8和TNF水平呈不同程度升高,其差异有显著性(P<0.05或P<0.01);且随着芦荟多糖作用浓度的增加,其效应与剂量明显相关(P<0.01);而NO水平与对照组比较呈显著性下降(P<0.01),量-效关系明显(P<0.01)。结论芦荟多糖促进人表皮细胞分泌TGF-α、TGF-β1、IL-1β、IL-6、IL-8及TNF,而对NO释放则具有抑制作用。

胰岛素样生长因子-I对体外培养的肾小管上皮细胞表型转化的作用

目的探讨胰岛素样生长因子-I(IGF-I)对体外培养的肾小管上皮细胞(HKC)表型转化的作用及IGF-I和TGF-β1之间有无协同作用。方法分为4组:(1)无血清对照组;(2)阳性对照组TGF-β1(8μg/L);(3)IGF-I(1、10、50和250μg/L)组;(4)IGF-I(50μg/L)+TGF-β1(8μg/L)和IGF-I(250μg/L)+TGF-β1(8μg/L)联合作用组。采用免疫荧光和免疫组化双染色法、流式细胞仪和酶联免疫吸附法观察HKC胞质中抗原角蛋白、钙黏蛋白、波形蛋白和-αSMA的表达,检测细胞培养上清液纤连蛋白和Ⅰ型胶原的浓度。结果IGF-I(50、250μg/L)能诱导HKC细胞表达波形蛋白、-αSMA,失去角蛋白和钙黏蛋白的表达;使-αSMA阳性的HKC细胞数显著高于阴性对照组。联合作用组-αSMA阳性的细胞数明显高于IGF-1或TGF-β1单用组,但无协同作用;IGF-I(10、50、250μg/L)组培养上清液纤连蛋白、Ⅰ型胶原的浓度明显升高,有剂量和时间依赖性。结论IGF-I能诱导肾小管上皮细胞发生表型转化;IGF-I和TGF-β1对诱导HKC转化无协同作用。