稳定同位素标记氨基酸细胞培养联合质谱绝对定量技术在5、7、55型腺病毒鉴定中的应用

利用稳定同位素标记肽段的质谱绝对定量(AQUA)技术,实现了对5、7和55型人腺病毒的准确鉴定。采用细胞培养条件下稳定同位素代谢标记(SILAC)技术培养细胞至大肠杆菌生长至对数生长期,1 mmol/L异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)低温诱导蛋白表达,提取并利用谷胱甘肽S转移酶(GST)纯化富集相应标记的腺病毒六邻体蛋白。通过胶消化分别消化三种不同标记策略(非标记、中度标记和重度标记)的纯化蛋白,消化肽段等量混合脱盐后经纳流液相色谱-串联质谱(Nano HPLC-MS/MS)进行定量蛋白分析。通过SILAC实现大肠杆菌的完整代谢标记,诱导表达腺病毒六邻体蛋白,通过AQUA技术实现对非标记、中度标记、重度标记六邻体蛋白标志性肽段鉴定。成功实现SILAC三种不同标记策略条件下大肠杆菌中5、7、55型人腺病毒六邻体蛋白的完整标记,为5、7、55型人腺病毒感染的快速分型检测提供了新的鉴定策略。

细胞培养稳定同位素标记技术与肿瘤标志分子研究

以质谱为基础的定量蛋白质组学分析技术的发展,大大加快了肿瘤标志分子的研究进程。细胞培养稳定同位素标记技术,已成为目前定量蛋白质组学的主要策略之一,它将不同来源或不同状态的细胞分别培养于含轻/重型稳定同位素标记必需氨基酸的培养基中,经过若干次细胞倍增后,稳定同位素按照序列特异的方式,完全掺入到新合成的蛋白质中。通过比较标记前后同一肽段的质谱峰值变化,可以实现对蛋白质的精确定量。它具有样本需求量少、简单、直接、高效及定量准确等特点,不仅可以定性和定量地分析差异表达蛋白质,而且可以分析蛋白质翻译后修饰和蛋白质相互作用,已逐渐成为研究差异蛋白质组的重要工具之一,在肿瘤分子标志研究中发挥重要作用。

细胞培养稳定同位素标记技术在蛋白质组学中的应用与进展

细胞培养稳定同位素标记技术(SILAC)是在细胞培养过程中,利用稳定同位素标记的氨基酸结合质谱技术,对蛋白表达进行定量分析的一种新技术。它不仅可以对蛋白质进行定性分析,还可通过质谱图上一对轻-重稳定同位素峰的比例来反映对应蛋白在不同状态下的表达水平,实现对蛋白质的精确定量。SILAC结合质谱技术在定量蛋白质组学中发挥了巨大的作用,其应用范围从细胞系扩展到亚细胞器、组织与动物整体水平,具体的应用策略也在不断完善发展。我们总结评述了SILAC技术在差异表达蛋白质组、蛋白质翻译后修饰、药物蛋白质组和蛋白质相互作用等方面的应用与进展。

细胞培养氨基酸稳定同位素标记-质谱技术测定槲皮素对人肝癌细胞热休克蛋白表达的影响

目的观察槲皮素对人肝癌细胞HepG2中热休克蛋白（HSP）发达的影响，为其抗肿瘤活性探寻可能的靶点。方法经过连续传代，充分氚化HepG2细胞中的亮氨酸，并鉴定其标记率。采用四早基偶氮唑蓝（MTT）法检测槲皮素对HepG2细胞中的亮氨酸,并鉴定其标记率。采用四早基偶氮唑蓝（MTT）法检测槲素对HepG2细胞生长的抑制活性及有效浓度。以50μmol/L槲皮素作用氚化HepG2细胞45h后，与正常HepG2细胞按1：1等量混合电泳，提肽后时行质谱鉴定，将获得的肽片段数据进行Mascot检索。结论SILAC-MS成熟可靠，能全面定量分析外因作用前后HepG2细胞中全系列蛋白谱的变化，槲皮素对HepG2细胞中HSP表现出强烈的抑制能力，并且这种作用可能是其发挥肿瘤活性的途径之一。

细胞培养稳定同位素标记定量分析食管癌顺铂耐药相关蛋白

多药耐药性(multidrug resistance,MDR)是临床肿瘤化疗失败的主要原因之一,定量分析与鉴定食管鳞癌顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)耐药相关蛋白对阐明食管癌耐药的分子机制具有重要理论意义。本研究采用浓度递增法建立食管癌CDDP耐药细胞系EC9706/CDDP,细胞培养稳定同位素标记(stable isotope labeling with amino acids in cell culture,SILAC)和高效液相-电喷雾串联质谱检测、生物信息学定量分析并鉴定EC9706/CDDP及其母细胞系EC9706的差异蛋白表达谱。EC9706/CDDP细胞呈贴壁性生长但增殖缓慢,多形性、异形性明显,耐药指数为3.23。74种差异表达的蛋白质分子主要包括细胞骨架相关蛋白(20%)、能量代谢相关蛋白(11%)、转录调控及DNA修复相关蛋白(11%)、氧化还原内稳态维持类蛋白(9.5%)、蛋白合成及参与mRNA处理类蛋白(12%)、核糖体结构类蛋白(8.1%)、分子伴侣蛋白(8.1%)、免疫/炎症反应相关蛋白(5.4%)、细胞内转运功能相关蛋白(5.4%)、核组装相关蛋白(2.7%)等。表明食管癌顺铂耐药的发生是多分子参与、多代谢通路失调的复杂过程,差异表达的蛋白分子将有助于深入理解MDR发生的分子机制,并为MDR表型逆转的新型药物设计提供有价值的分子靶点。

用SILAC技术研究感染H5N1禽流感病毒后A549肺癌细胞蛋白质组的表达变化

目的:鉴定高致病性H5N1禽流感病毒感染A549肺癌细胞后,细胞蛋白质组的表达变化,并鉴定特异分子通路的改变及其涉及的关键蛋白质分子。方法:利用稳定同位素标记氨基酸技术(SILAC)标记A549细胞,得到"重标"或"轻标"的A549细胞;"重标"细胞感染高致病性H5N1禽流感病毒24 h后提取细胞总蛋白,与从未感染病毒的"轻标"细胞中提取的总蛋白等量混合,酶解肽段,经正交反相色谱分离后用质谱鉴定,对数据进行定性和定量分析。结果:共鉴定到3504个蛋白质,有定量信息的蛋白质为2469个,病毒感染后表达量升高的蛋白质为72个,表达量降低的蛋白质为66个,其中包括参与多个分子调控途径如RNA剪接体、干扰素诱导通路、泛素化通路、胰岛素通路等的蛋白质。结论:建立了利用SILAC技术研究宿主细胞-病毒相互作用的方法,发现了高致病性H5N1禽流感病毒感染宿主细胞相关的关键蛋白质,为探索H5N1病毒致病的分子机理提供了理论基础。

应用氨基酸稳定同位素标记-质谱技术构建肺癌细胞14—3—3sigma相互作用的分子网络

目的筛选14—3—3sigma在非小细胞肺癌细胞中的功能相关蛋白，构建相互作用的分子网络。方法构建稳定过表达14—3—3sigma蛋白的非小细胞肺癌细胞株（PG细胞，大细胞肺癌），采用四甲基偶氮唑蓝（MTT）方法检测PG细胞的生长速度。利用稳定同位素标记氨基酸（stableisotopelabelingbyaminoacidsincellculture，SILAC）技术，联合线性离子阱回旋共振质谱仪（LC-LTQ—n’）鉴定由14-3-3sigma过表达引起的差异表达蛋白，将质谱鉴定为表达〉2倍或〈0．5倍的蛋白作为差异蛋白。通过检索人类蛋白参考数据库（Humanproteinreferencedatabase，HPRD）和蛋白质交互作用网络数据库（Kyotoencyclopediaofgenesandgenomes，KEGG）构建分子网络。结果显示C4克隆中外源14—3—3sigma表达量最高（命名为PGSC4），后续实验用PGSCA细胞进行。转染14—3-3sigma后，PG细胞生长速度明显减慢。建立了包含147个蛋白差异蛋白的数据库。构建的分子网络中含有26个蛋白，其中参与了多个细胞活动（细胞周期调控、细胞分化、凋亡等）的重要激酶——酪蛋白激酶Ⅱ0t亚基（caseinkinaseIIsubunitalpha，CSNK2A1）是表达升高最明显的蛋白质，与DNA损伤调节机制相关的转录调节因子MENl（Menin）则是表达降低幅度最大的蛋白质。结论14．3—3sigma可以抑制非小细胞肺癌PG细胞的生长速度，与细胞周期、DNA损伤修复等机制相关的蛋白质发生了变化，并构成了相互作用的分子网络。

人上皮性卵巢癌细胞系侧群细胞的肿瘤干细胞样细胞生物学特性及膜蛋白差异表达的鉴定

目的鉴定上皮性卵巢癌细胞侧群细胞(SP细胞)肿瘤干细胞样细胞生物学特性,并检测侧群细胞内差异蛋白质的表达。方法流式分选上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和A2780具有外泌Hochest33342染料生物学特性的侧群细胞,鉴定其肿瘤干细胞样细胞相关生物学特性。运用细胞培养稳定同位素标记(SILAC)的定量蛋白质组学技术,检测SP细胞中差异表达膜蛋白。结果运用流式分选技术,成功分选出上皮性卵巢癌细胞系SKOV3和A2780细胞占比0.5%的SP细胞,经过多次分选,SP细胞比例逐步升高,并能够逐步分化成非SP细胞,说明SP细胞具有一定的增殖与分化能力。体外实验证实SP细胞具有更强的细胞克隆形成能力,且对紫杉醇、顺铂等化疗药物敏感性差;反转录PCR实验显示SP细胞内干细胞相关基因(如Oct-4、β-catenin、ABCG2)表达水平升高。此外,SP细胞具有较强的小鼠体内成瘤能力。运用SILAC技术,以非SP(NSP)细胞作为对照,检测出SKVO3和A2780细胞SP细胞内差异表达膜蛋白分别1561和1989个,以SKOV3为基准,两种SP细胞共同差异表达上调蛋白12种,共同差异表达下调蛋白13种。结论上皮性卵巢癌细胞系SP细胞具有肿瘤干细胞样细胞生物学特性,并检测出SP细胞差异表达膜蛋白,为后续深入探索上皮性卵巢癌肿瘤干细胞样细胞表面标记蛋白提供基础。

应用蛋白质组技术筛选人食管癌细胞系9706顺铂耐药相关蛋白

目的应用蛋白质组技术筛选人食管癌(esophageal cancer,EC)顺铂耐药相关蛋白。方法采用顺铂(cis-diamminedichloroplatinum,CDDP)浓度递增法、间歇作用方式建立EC9706顺铂耐药细胞系(EC9706/CDDP),应用细胞培养稳定同位素标记(cell culture and stable isotope labeling,SILAC)、质谱(mass spectrometry,MS)筛选和鉴定食管癌耐药相关的蛋白。结果共鉴定出耐药相关的74种差异表达蛋白,其中53种在EC9706/CDDP中表达显著升高和21种表达明显降低。结论筛选的EC9706/CDDP耐药相关蛋白对进一步阐明肿瘤多药耐药分子机制具有重要理论意义和应用价值,并为逆转多药耐药表型的药物设计提供了新的分子靶点。

利用ChIP-seq/SILAC技术筛选KLF15的靶向基因SUMO1

目的利用ChIP-seq和SILAC-LC/MS技术寻找Krupple样因子(KLF15)的靶向基因及其结合位点。方法 (1)利用染色质免疫沉淀技术(ChIP)特异性富集并纯化人原代肾系膜细胞(HRMC)中可与KLF15结合的DNA片段,通过高通量测序技术(Hi Seq)检测和分析,得到直接与KLF15结合的基因;(2)利用稳定同位素标记细胞培养技术(SILAC),重链和轻链同位素标记的培养HRMC,分别对重链实验组(HK)转染KLF15质粒,轻链对照组(LC)转染空载体对照,收集蛋白进行液质谱(LC/MS)检测,得到过表达KLF15后的差异蛋白;(3)对ChIP-seq及SILAC结果进行GO和Pathway分析,同时将二者进行交集筛选出KLF15的靶向基因,而后利用http://meme.edi.edu.au/网站获得靶基因的Modifs并对候选基因小泛素样修饰因子1(SUMO1)进行ChIP-PCR及双荧光素酶验证。以SPSS 17.0统计软件进行统计学分析。结果 ChIP-seq获取了2 478个KLF15直接调控的可能靶向基因,SILAC-LC/MS检测到KLF15过表达后有1 357个差异蛋白,综合ChIP和SILAC结果,我们分析得到52个共同差异表达的基因和(或)蛋白及其3个modifs,其中5个蛋白参与细胞增殖相关进程;结合GO和Pathway分析结果,最终筛选出SUMO1作为KLF15调控系膜细胞增殖的靶向基因。Motif分析发现SUMO1启动子区存在KLF15的结合序列;利用ChIP-PCR和双荧光素酶报告基因验证KLF15转录因子可以直接结合SUMO1的启动子区并发挥作用。结论 KLF15通过结合SUMO1的启动子区,调节SUMO1的表达。

胚胎干细胞蛋白质组

胚胎干细胞（ES细胞）是由哺乳动物着床前胚胎分离出来的全能细胞、能分化出所有类型的细胞，因此在再生医学中具有极为诱人的前景。在MCP这篇文章中，作者从ES细胞中鉴定出五千多种蛋白质。这是迄今所报道的数量最大的蛋白质组。此实验室应用一种称作SILAC的技术（细胞培养物中氨基酸稳定同位素标记技术），