原代培养人增生性瘢痕成纤维细胞的生物学行为

背景:增生性瘢痕组织的形成是创面愈合过程中不可避免的,但是增生性瘢痕组织的形成产生很多不良的影响。目的:建立可靠的人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养方法。方法:采用组织贴壁法和消化法分别进行人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养,使用含体积分数10%胎牛血清的DMEM培养基,37℃,体积分数5%CO2,饱和湿度下培养,分别描述其生长曲线、形态及波形蛋白的表达。结果与结论:组织贴壁法人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞培养成功,20-40d可传第1代,以后每7-10d可传1代,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性;消化法培养人皮肤增生性瘢痕成纤维细胞成功,15-20d细胞可融合成片,细胞为长梭形,波形蛋白表达阳性。进一步证实两种方法进行人增生性瘢痕成纤维细胞的原代培养均培养成功。

PPAR-γ在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达及意义

目的探讨核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在增生性瘢痕成纤维细胞中的表达状况及其意义。方法应用免疫细胞化学检测3例增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中PPAR-γ的表达。结果免疫细胞化学显示PPAR-γ蛋白在增生性瘢痕和正常皮肤成纤维细胞中均有表达,但是在增生性瘢痕中表达较正常皮肤低。结论核内受体PPAR-γ在增生性瘢痕成纤维细胞中呈下调表达,提示激活PPAR-γ可能是增生性瘢痕治疗的一种新方法。

PPAR-γ在增生性瘢痕中的表达及意义

目的探讨核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(peroxisome proliferator-activated receptor gamma,PPAR-γ)在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中的表达及其意义。方法原代细胞培养正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞,应用实时定量聚合酶链式反应技术(real-time Q-PCR)检测细胞中PPAR-γm RNA的表达;Western blotting技术检测细胞中PPAR-γ蛋白的表达。结果 Real-time Q-PCR结果显示PPAR-γmRNA在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中均有表达,正常皮肤成纤维细胞中PPAR-γmRNA的表达量明显高于增生性瘢痕成纤维细胞中PPAR-γmRNA的表达量,两者之间的差异有显著性意义(P<0.05);Western blotting结果显示PPAR-γ蛋白在正常皮肤成纤维细胞和增生性瘢痕成纤维细胞中均有表达,增生性瘢痕成纤维细胞中PPAR-γ蛋白明显低于正常皮肤成纤维细胞,两者之间的差异有显著性意义(P<0.05)。结论 PPAR-γ在增生性瘢痕成纤维细胞中表达下降,提示其可能参与了增生性瘢痕的形成过程,调控PPAR-γ有望成为治疗增生性瘢痕的新靶点。

瘢痕成纤维细胞培养及其生物学行为的实验研究

为探讨不同瘢痕在体外培养情况下，其成纤维细胞生物学特性，切取正常皮肤、增生性瘢痕和瘢痕疙瘩分别行体外成纤维细胞原代和传代培养，观察成纤维细胞形态学和生长动力学变化。结果发现，三类细胞的形态学方面没有明显差异，但瘢痕疙瘩成纤维细胞排列更加紊乱，极性消失，有交叉重叠现象。在接种相同的细胞密度和相同的培养条件下，其细胞生长率、分裂指数、克隆形成及ＤＮＡ含量无明显差别。认为，三类细胞在体外培养状态下，其形态学和生长动力学无显著差异，且具有相似的生物学特性。

A型肉毒毒素可抑制人增生性瘢痕成纤维细胞增殖和胶原蛋白的合成

背景:A型肉毒毒素伤口周围局部注射可以减少瘢痕的形成,而且对瘢痕的增生挛缩有抑制作用,可以促进瘢痕的萎缩变平。目的:观察A型肉毒毒素对人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖和胶原蛋白合成的影响。方法:体外分离、培养人增生性瘢痕成纤维细胞,取对数生长期的细胞接种培养,使用稀释浓度为0.1U/LA型肉毒素DMEM细胞培养基对细胞的生长过程进行干扰,对照组以含胎牛血清的DMEM培养基培养。结果与结论:细胞接种第1～15天,对照组可见梭形的增生性瘢痕成纤维细胞分裂增殖,局部融合成细胞单层,细胞生长旺盛,细胞排列呈现高度一致性。A型肉毒毒素组细胞增殖速度慢,细胞数量少,细胞排列方向散乱,A型肉毒毒素组细胞数为对照组细胞数的79.3%,A型肉毒毒素实验组胶原蛋白合成量为正常对照组的48.4%,差异有显著性意义(P<0.05)。提示A型肉毒毒素可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖以及胶原蛋白的合成。

大黄素对人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖抑制及细胞内游离Ca^(2+)的作用

目的对大黄素的防治瘢痕的生物学作用进行初步探索,为瘢痕的防治开辟新的途径。方法采集我科住院患者的增生性瘢痕标本,进行人增生性瘢痕成纤维细胞培养,分别以不同浓度的大黄素作用于细胞,以MTT法测试药物处理后细胞增殖规律,并以激光共聚焦显微镜观察细胞内[Ca2+]i荧光强度的变化。结果在不同浓度组大黄素的处理下,人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖呈现出抑制的趋势(P<0.05);细胞内[Ca2+]i的荧光强度也明显上升,其幅度和药物浓度有一定的关联。结论大黄素对人增生性瘢痕成纤维细胞有显著的抑制作用,其机制可能和细胞内[Ca2+]i水平的改变有关。

A型肉毒毒素引起人增生性瘢痕成纤维细胞的凋亡

背景:A型肉毒毒素临床上可以治疗增生性瘢痕,体外细胞培养研究发现可以抑制增生性瘢痕成纤维细胞的增殖。目的:观察A型肉毒毒素对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的抑制作用,以及对人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡的影响。方法:通过消化法分离培养出人增生性瘢痕成纤维细胞,分别用不同浓度的A型肉毒毒素对细胞的生长增殖过程进行干预,通过MTT染色,于酶联免疫检测仪570nm测定吸光度来研究细胞生长增殖情况,计算抑制率。通过Hoechst33342及PI染色检测人增生性瘢痕成纤维细胞凋亡情况,并计算凋亡率。结果与结论:人增生性瘢痕成纤维细胞生长过程中呈梭形,细胞生长旺盛,细胞融合成单层,细胞排列成高度一致性。经A型肉毒毒素处理后,细胞增殖速度明显减慢,细胞数量减少,细胞排列方向散乱。MTT染色后吸光度减弱,随A型肉毒毒素浓度增加,吸光度明显减弱,与对照细胞比较,差异有显著性意义(P<0.05),半数抑制率出现在0.4IU/L。在荧光显微镜下,人增生性瘢痕成纤维细胞经Hoechst33342和PI染色后细胞核呈现蓝色,细胞核为光滑的圆形或椭圆形外观。A型肉毒毒素干预后细胞核致密浓缩,染色不均匀,折光性增强,核膜皱缩,部分细胞核碎裂,出现碎块,有凋亡小体出现。随着A型肉毒毒素浓度的增加细胞凋亡率逐渐增高,与对照细胞比较差异有显著性意义(P<0.05),半数凋亡率在0.4IU/L。说明A型肉毒毒素可以抑制人增生性瘢痕成纤维细胞的增殖,其主要通过引起细胞凋亡的途径来抑制成纤维细胞的增殖。

细胞因子抑制剂吡非尼酮对体外培养人瘢痕成纤维细胞增殖的影响

背景:有研究表明细胞因子抑制剂吡非尼酮通过调控多种细胞因子,抑制成纤维细胞的生物学活性,其在内脏器官的抗纤维化作用的研究和应用取得了良好的进展,但对于皮肤增生性瘢痕及成纤维细胞是否有影响及其机制尚不清楚。目的:观察细胞因子抑制剂吡非尼酮对人增生性瘢痕成纤维细胞增殖的影响。方法:采用组织块法培养人增生性瘢痕成纤维细胞,实验取第3-6代生长状态良好的对数生长期细胞。根据吡非尼酮不同质量浓度分为对照组(吡非尼酮0 g/L),吡非尼酮0.15,0.3,1 g/L组,共干预12,36,48 h。结果与结论:MTT,反转录-聚合酶链式反应和酶链免疫吸附实验结果显示,与对照组相比,吡非尼酮0.15,0.3,1 g/L组细胞增殖情况、转化生长因子β1 mR NA的表达、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌量均降低(P<0.05),其中吡非尼酮1 g/L组降低最明显(P<0.05)。干预24,48,72 h后,吡非尼酮0.15,0.3,1 g/L组间细胞增殖抑制率、Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白的分泌量均差异有显著性意义(P<0.05)。结果证实,细胞因子抑制剂吡非尼酮对体外培养的人增生性瘢痕成纤维细胞胶原蛋白的分泌、转化生长因子β1的表达及细胞增殖活性有明显的抑制作用。

l5-脱氧-△^(12,14)-前列腺素J2对兔耳增生性瘢痕转化生长因子-β1及微血管的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体-γ的配体l5-脱氧-△12,14-前列腺素J2对兔耳增生性瘢痕CD34及转化生长因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)的影响,探讨15d-PGJ2防治增生性瘢痕的机制和可行性。方法选取新西兰大白兔9只,在兔耳腹侧面制作2cm×2cm全层皮肤缺损创面,每耳2个,共计36个,建立兔耳增生性瘢痕动物模型,随机分为实验组和对照组,分别用15d-PGJ2及生理盐水行瘢痕内注射,1次/d,连续注射7d。停止注射后第3、6、17天取材。应用免疫组织化学方法检测CD34和TGF-β1的表达。结果兔耳创面愈合后均出现不同程度类似人增生性瘢痕组织块,与对照组比较,实验组注射15d-PGJ2后瘢痕逐渐变平变软,颜色变浅。在各时间点CD34及TGF-β1的表达均较对照组低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 PPAR-γ的配体15d-PGJ2可减少瘢痕内CD34、TGF-β1的含量,引起瘢痕萎缩,有一定的防治瘢痕增生的作用,为其治疗增生性瘢痕的临床应用提供了一定的理论依据。

组织块贴壁法成纤维细胞培养的体会

增生性瘢痕疙瘩是整形外科的棘手问题。就此问题的研究,目前尚缺乏理想动物模型,大多数实验研究仍基于成纤维细胞的体外培养。在细胞培养中,如何简化操作步骤、降低耗费,培养出活力及状态良好的细胞显得尤为重要。下面就我们运用组织块贴壁法培养增生性瘢痕及瘢痕疙瘩成纤维细胞工作中的一些成功的体会作一简要介绍。

转化生长因子β、癌基因c-myc和c-fos在瘢痕形成中的作用

目的了解c-myc和c-fos蛋白产物在瘢痕中的表达情况以及转化生长因子β(TGF-β1)对其表达及胶原合成分泌的影响,探讨瘢痕增生机制。方法采用免疫组织化学方法对增生性瘢痕(HS)、非增生性瘢痕(NHS)和正常皮肤各9例标本进行了c-myc和c-fos蛋白产物的检测和比较;通过细胞培养的方法研究了TGF-β1对增生性瘢痕成纤维细胞癌基因c-myc和c-fos的表达及胶原分泌的影响。结果癌基因c-myc和c-fos蛋白产物在增生性瘢痕成纤维细胞中呈强阳性表达,TGF-β1可显著提高HS成纤维细胞c-myc和c-fos的表达及胶原合成分泌的增加。结论c-myc和c-fos蛋白产物可能是TGF-β1引起成纤维细胞内生物学效应的中间信号途径。

声动力疗法对兔耳增生性瘢痕成纤维细胞的抑制效应

声动力疗法一直是近年来研究热点[1].我们前期研究结果证明,血卟啉单甲醚声动力疗法（HMME-SDT）对增生性瘢痕成纤维细胞（FB）有毒杀作用.本实验旨在观察HMME-SDT对增生性瘢痕FB有抑制效应,探讨其机制. 一、材料与方法 1.细胞培养：取兔增生性瘢痕组织,常规处理后将组织块铺设瓶底培养用于实验. 2.实验分组及应用：分为对照组（C）、单纯超声组（U）、HMME组、HMME-SDT组.治疗参数：超声频率1.0 mHz、超声声强0.8 W/cm2,超声辐照时间120 s,每天1次.向培养皿中注射HMME（20 mg/kg）,3h后进行超声辐照,探头在水中与瘢痕相距1.0 cm.

人增生性瘢痕成纤维细胞的间充质干细胞表型及多向分化潜能

目的探讨人增生性瘢痕来源的成纤维细胞的细胞表型及分化潜能，以进一步研究其在增生性瘢痕形成中的作用。方法从手术切除的增生性瘢痕中提取并分离培养成纤维细胞，以倒置显微镜观察其细胞形态及生长特点。待细胞培养传代至第3代，采用Vi—CELL细胞计数仪检测细胞生长情况，流式细胞仪检测成纤维细胞间充质干细胞表型标志CD73、CD44、CD105、CD90、CD34、CD45、CDl4的表达情况；通过免疫细胞化学检测该细胞CKl9、Oct4、Vementin的表达情况及免疫荧光检测a-平滑肌肌动蛋白；诱导分化检测细胞向成骨、成软骨和成脂细胞方向分化能力。结果细胞原代培养初期贴壁散在分布，生长曲线显示细胞1～2d生长较慢，从3～5d左右细胞生长较快，6～7d细胞进入平台期；第2代第5天细胞多为长梭形，呈放射状、漩涡状排列。细胞流式结果显示细胞表型CD90、CD44、CDl05、CD73呈高表达，CD45、CD34、CDl4不表达；免疫细胞化学检测间充质细胞标记物Vementin、多能干细胞标志物Oct4均呈阳性表达，免疫荧光检测OL一平滑肌肌动蛋白呈阳性表达，上皮细胞标志物CKl9呈阴性表达，多向诱导分化实验该细胞可向成骨、成软骨和成脂细胞分化，具有多向分化潜能。结论人增生性瘢痕来源成纤细胞具有间充质干细胞样生物学特性，该生物学特性可能在增生性瘢痕的形成以及创面修复中发挥至关重要的作用。

15-脱氧-△^12,14，-前列腺素J2对兔耳增生性瘢痕Ⅰ型胶原表达的影响

目的观察过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）的配体15-脱氧-△^12,14，-前列腺素J2（15d-PGJ2）对兔耳增生性瘢痕Ⅰ型胶原表达的影响，探讨15d—PGJ2防治增生性瘢痕的可行性。方法选取新西兰大白兔18只，在兔耳腹侧面制作2cm×3cm全层皮肤缺损创面，每耳2个，共计72个，建立兔耳增生性瘢痕动物模型，随机分组，分别用15d—PGJ2及生理盐水行瘢痕内注射，1次／d，共7次。停药后第14、21天两组同时取材；每组每次切取18个组织块。应用免疫组织化学、荧光定量聚合酶链反应（PCR）及Westernblot检测Ⅰ型胶原的表达。结果与对照组比较，15d．PGJ2注射后瘢痕体积缩小，变软变平，色泽轻度变浅。Ⅰ型胶原主要分布于真皮的细胞间质、成纤维细胞胞质中，血管壁上亦见阳性信号，在各个时间点15d—PGJ2组Ⅰ型胶原mRNA和蛋白的表达均较对照组低，且差异有统计学意义（P〈0．05）。结论PPAR-1的配体15d—PGJ2可降低瘢痕内Ⅰ型胶原的含量，引起瘢痕萎缩，从而防治瘢痕。

过氧化物酶体增殖物激活受体-γ在增生性瘢痕中的表达及其意义

目的探讨核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)在增生性瘢痕中的表达状况及其意义。方法术中切取16例增生性瘢痕组织及每位患者手术时取皮修剪后的残余皮片。应用免疫组织化学检测增生性瘢痕和正常皮肤中PPAR-γ蛋白的表达并分析其与瘢痕增生程度的关系。结果免疫组织化学显示PPAR-γ蛋白在增生性瘢痕和正常皮肤中均有表达,但是在增生性瘢痕(32.18±17.84)中表达较正常皮肤(50.80±22.40)低。结论核内受体PPAR-γ在增生性瘢痕中呈下调表达,提示PPAR-γ的激活可能是增生性瘢痕治疗的一种新方法。

15-脱氧-△^12，14-前列腺素J2对兔耳增生性瘢痕结缔组织生长因子及胶原表达的影响

核转录因子过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPAR-γ）作为负调节信号，在组织和器官纤维化中发挥抗纤维化作用，但在增生性瘢痕中的作用尚不清楚。我们采用兔耳增生性瘢痕模型，观察PPAR-γ的配体15-脱氧-△^12,14-前列腺素J2（15d-PGJ2）对增生性瘢痕结缔组织生长因子（CTGF）及胶原表达的影响，

慢病毒介导的血管内皮生长因子干扰对瘢痕成纤维细胞及内皮细胞的影响

增生性瘢痕是创面愈合过程中的病理现象，严重影响患者的容貌、外观，有的甚至引发功能障碍。在临床上，瘢痕进展的过程中皮肤颜色的变化提示瘢痕的形成和成熟与组织中血管的作用有关。抗血管生成可能能够治疗增生性瘢痕。本实验室前期已构建了针对人血管内皮生长因子（VEGF）的干扰慢病毒，本研究拟在体外瘢痕成纤维细胞培养模型上探讨稳定的干扰VEGF对成纤维细胞的影响和内皮细胞的影响。