雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响

目的 探讨雷公藤甲素通过丝氨酸-苏氨酸蛋白激酶/糖原合成酶激酶-3β(AKT/GSK-3β)通路对MGC803细胞增殖、侵袭与迁移的影响。方法 体外培养MGC803细胞,确定雷公藤甲素的干预剂量和干预时间。将细胞分为阴性对照组(A组,不进行处理),阳性对照组(B组,10μmol/L顺铂),雷公藤甲素高、中、低剂量组(C组、D组、E组)。干预48 h,采用Transwell法检测细胞侵袭能力,采用划痕试验法检测迁移能力,采用免疫印迹(Western blot)法检测检测相关蛋白的表达。结果 随着雷公藤甲素浓度的增加,MGC803细胞增殖率降低(P <0.05);48 h时半数抑制浓度(IC50)最小,选择干预时间为48 h,C组、D组、E组的干预剂量分别为80,40,20 nmol/L。与B组比较,C组、D组、E组侵袭细胞数、细胞迁移距离及波形蛋白(vimentin),snail,p-AKT/AKT,p-GSK-3β/GSK-3β表达水平均显著升高(P <0.05),上皮钙黏素(E-cadherin)、β-联蛋白(β-catenin)表达水平均显著降低(P <0.05),且呈剂量依赖关系。结论 雷公藤甲素可通过抑制AKT/GSK-3β信号通路而抑制MGC803细胞增殖、侵袭与迁移。

miR-153-3p靶向下调Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移

目的探究miR-153-3p调节乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法利用生物信息学软件检索预测miR-153-3p的候选靶基因;采用双荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与候选基因的靶向关系;应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测miR-153-3p对MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白质表达水平的影响;通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并以TranswellTM检测细胞的迁移和侵袭能力。结果软件预测显示miR-153-3p与Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)有连续的结合区域;共转染miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)与ROCK1野生型报告载体的细胞相对荧光素酶活性降低;转染hsa-miR-153-3p-mimics后,MDA-MB-231细胞的miR-153-3p表达水平显著增高,且ROCK1蛋白的表达量明显降低。与对照组相比,转染组MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。结论miR-153-3p通过靶向下调ROCK1的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

香烟烟雾提取物对人肺动脉平滑肌细胞增殖的影响及蛋白激酶C的相关作用

目的探讨香烟烟雾提取物(CSE)对人肺动脉平滑肌细胞(PASMC)增殖的影响及蛋白激酶C(PKC)信号转导途径在其中所起的作用。方法①不同浓度的CSE作用于人PASMC24h,四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测PASMC增殖,锥虫蓝排斥法检测活细胞率。②PASMC与PKC激活剂PMA预孵24h或与PKC抑制剂Ro31-8220(简称Ro)预孵30min,然后暴露于5%CSE24h,采用MTT法、流式细胞术、增殖细胞核抗原(PCNA)免疫细胞化学染色等方法观察细胞增殖的变化。③5%CSE作用于PASMC24h,采用RT-PCR和Western blot方法分别检测PKC-α mRNA和蛋白的表达。结果①20%和30%的CSE对PASMC有细胞毒性作用;5%和10%CSE不影响PASMC的活细胞率;MTT检测结果示5%CSE组PASMC的吸光度(A)值较对照组明显增高。②5%CSE组PASMC的MTTA值、增殖指数(PI)、S期细胞分数(SPF)、PCNA阳性表达率增高,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。PMA+5%CSE组和Ro+5%CSE组以上指标均降低,与5%CSE组比较,差异有显著性意义(P<0.05),与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。③5%CSE组PKC-α mRNA和蛋白表达量增加,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.05)。结论高浓度的CSE对PASMC有细胞毒性作用,低浓度(5%)的CSE则能促进PASMC的增殖。PKC特别是PKC-α可能在CSE促人PASMC增殖的信号转导机制中起重要作用。

蛋白激酶Cδ失活对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响

目的探讨短发夹RNA(shRNA)靶向沉默人蛋白激酶Cδ(PKCδ)对骨肉瘤干细胞增殖、凋亡及相关信号通路的影响。方法根据Genbank数据库中PKCδ序列,设计、合成互补并特异性编码其shRNA序列(PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2),克隆至pRNA6.1-Neo质粒载体后采用Western blotting检测PKCδ蛋白水平,筛选抑制效果最好的shRNA片段转染骨肉瘤干细胞(转染组),设阴性对照组(转染shRNA无意义随机阴性对照序列)和空白对照组(不行转染处理)。采用噻唑蓝(MTT)法检测各组转染24、48、72、96 h后的增殖抑制率,流式细胞术检测各组转染后的细胞凋亡和细胞周期情况,实时荧光定量PCR检测凋亡相关基因的表达,采用Western blotting检测各组转染96 h后PI3K/Akt及Wnt/β-catenin信号通路中相关蛋白的水平。结果转染PKCδ-shRNA-1和PKCδ-shRNA-2后PKCδ蛋白水平均降低(P<0.05),且PKCδ-shRNA-1的抑制效果优于PKCδ-shRNA-2,故后续实验选择PKCδ-shRNA-1;与其余两组相比,转染组的增殖抑制率、凋亡率及促凋亡基因Bax、Bad的mRNA水平均升高,而Bcl-2水平降低,且在细胞周期上,G_0/G_1期细胞比例升高,但S期和G_2/M期细胞比例均降低,以上差异均有统计学意义(P<0.05);转染组PI3K/Akt通路中的PTEN水平升高、Akt水平降低,Wnt/β-catenin通路中β-catenin、C-myc和Cyclin D1水平均降低(P<0.05)。结论通过shRNA抑制PKCδ基因表达可抑制骨肉瘤干细胞增殖并诱导凋亡和细胞周期阻滞,对PI3K/Akt和Wnt/β-catenin信号通路激活有一定抑制作用,可能对骨肉瘤的防治有一定价值。

补体因子H相关蛋白1促进巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α调控足细胞增殖和迁移实验研究

目的:探讨补体因子H相关蛋白1(CFHR1)通过巨噬细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)调控足细胞增殖和迁移的作用。方法:体外培养人单核巨噬细胞和人肾足细胞。巨噬细胞分为对照组和CFHR1干预组,分别进行牛血清白蛋白或CFHR1重组蛋白干预24 h,ELISA法测定上清液TNF-α水平。足细胞分为空白组、TNF-α干预组、对照上清液干预组、CFHR1上清液干预组、CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组。CCK8法检测各组细胞增殖。Transwell法检测各组细胞迁移。Wb法检测各组细胞中相关蛋白变化。结果:巨噬细胞的CFHR1干预组上清液中TNF-α含量显著增加(P<0.05)。与空白组比较,TNF-α干预组、CFHR1上清液干预组的细胞增殖比率和迁移数量均显著降低(均P<0.05)。与CFHR1上清液干预组比较,CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组的细胞增殖比率和迁移数量均显著提高(均P<0.05)。与空白组比较,TNF-α干预组、CFHR1上清液干预组的足细胞裂孔膜蛋白(Nephrin)、足突蛋白(Podocin)、纤维状肌动蛋白(F-Actin)、整合素α3β1蛋白(α3β1)表达均显著降低(均P<0.05)。与CFHR1上清液干预组比较,CFHR1上清液+TNF-α中和抗体干预组的Nephrin、Podocin、F-actin、α3β1蛋白表达均显著增多(均P<0.05)。结论:CFHR1促进巨噬细胞分泌的TNF-α可显著抑制足细胞增殖水平和迁移能力,这可能是高浓度CFHR1促进肾病综合征发展的途径。

蛋白激酶与蛋白磷酸酶在细胞增殖分化中的机制研究

细胞生长发育和癌变过程中有众多复杂的信号转导途径以及信号分子参与,其中最基本的生化反应过程是系列蛋白质(信号分子)的磷酸化.

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的 探讨RNA干扰技术(RNAi)沉默肺腺癌转移相关转录本-1(MALAT-1)基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路影响。方法体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax、caspase-3mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、Akt及其磷酸化蛋白(p-Akt)蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果 与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(3.24±1.02)升高(P<0.05);与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(0.47±0.08)及Bcl-2mRNA(0.56±0.09)及蛋白(0.31±0.05)表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[(20.48±3.41)%]均升高,Bax、caspase-3mRNA(3.02±0.50、2.58±0.43)及蛋白表达(0.86±0.14、0.94±0.16)均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达(0.57±0.10、0.51±0.08)均降低(P均<0.05)。结论 MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。

黄色素抑制血管平滑肌细胞增殖与3种蛋白激酶的关系

目的 :研究黄色素 (SY)对血管平滑肌细胞 (VSMC)增殖的作用及机制。方法 :以培养的家兔VSMC为材料 ,用细胞计数和32 P 参入法 ,观察SY对VSMC的增殖及 3种蛋白激酶活性。结果 :SY抑制VSMC的增殖 ,且呈剂量和时间依赖性 ,1 0mg·mL-1作用最强 ,抑制率为 5 4 6% ;SY抑制VSMC的DNA合成 ,1 0mg·mL-1作用 2d ,抑制率为 80 2 % ;在一定浓度范围内 ,随着SY浓度的升高 ,VSMC中 3种蛋白激酶 (TPK ,PKC及MAPK)活性下降。结论 :SY对VSMC的增殖有抑制作用 。

miR-216a通过靶向调控蛋白激酶Cα抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭

背景与目的：MicroRNAs是一类19～25bp内源非编码的小分子RNA，其通过靶向抑制基因的转录和翻译水平。本研究旨在明确miR-216a是否通过靶向调控蛋白激酶Ca（PRKCA）表达而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭能力，从而进一步揭示miR-216a的抑瘤分子机制。方法：首先构建PRKCA3’UTR-荧光素酶报告载体，通过双荧光素酶报告检测观察miR-216a对PRKCA3’UTR-荧光素酶活性的影响；将miR-216amimics转染胶质瘤细胞U251，采用Westernblot检测PRKCA蛋白表达水平；将PRKCAsiRNA转染U251细胞，通过MTS细胞增殖活性检测和transwell侵袭实验观察PRKCA下调对U251细胞增殖和侵袭的影响。结果：双荧光素酶报告检测显示，miR-216a能特异性地与PRKCAmRNA的3’UTR结合，抑制其荧光素酶活性，下调41％。过表达miR-216a的U251细胞PRKCA蛋白表达水平降低。siRNA干扰PRKCA表达能抑制U251细胞的增殖和侵袭，它能部分模拟miR-216a的抑瘤功能。结论：miR-216a通过靶向PRKCAmRNA3’UTR而抑制胶质瘤细胞增殖和侵袭。

下调p21活化蛋白激酶2表达对人乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响

目的:应用RNA干扰技术下调人乳腺癌MCF-7细胞中p21活化蛋白激酶2(PAK2)的表达,观察其对MCF-7细胞增殖和凋亡的影响。方法:构建针对PAK2基因的短发卡RNA(shRNA)慢病毒表达载体并包装病毒颗粒,感染MCF-7细胞,筛选获得稳定细胞株。Western blotting检测细胞中PAK2蛋白表达水平的改变;CellTiter96 AQueous法和软琼脂集落形成实验检测MCF-7细胞体外增殖能力的改变;流式细胞术检测十字孢碱诱导的MCF-7细胞凋亡的变化。结果:MCF-7细胞的PAK2基因被沉默后,PAK2蛋白表达量明显下降(P<0.01),与阴性对照组相比,sh-PAK2组细胞生长明显减缓(P<0.01),克隆形成的数目和大小明显下降(P<0.01),十字孢碱诱导的细胞凋亡率显著增加(P<0.01)。结论:通过RNA干扰技术下调PAK2的表达,可抑制MCF-7细胞的生长和增殖,并增强其对化疗药物诱导的细胞凋亡的敏感性。PAK2可能是潜在的乳腺癌治疗的新靶点。

靶向激活蛋白激酶PKR对白血病K562细胞增殖的影响及机制

背景与目的:由t(9;22)(q34;q11)导致的bcr-abl融合基因在慢性粒细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)发病中起着重要的作用。本研究运用CML特异的bcr/abl融合基因的mRNA与外源重组反义RNA形成双链RNA(double strand RNA,dsRNA)能激活双链RNA依赖性蛋白激酶(double-stranded RNA-dependent protein kinase,PKR)的策略,研究其对白血病K562细胞增殖的影响及可能的机制。方法:将dsRNA类似物聚肌苷酸-聚胞啶酸(Polyriboinosinic Polyribocytidylic Acid,polyIC)、含bcr/abl融合基因序列40bp的逆转录病毒载体RV-40AS、RV-40AS+2-氨基嘌呤(2-aminopurine,2AP)和含绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的逆转录病毒载体RV-GFP作用于K562细胞,并以ECV304细胞作对照细胞株。通过细胞计数、MTT法和半固体集落形成实验检测其对细胞生长增殖的影响,用流式细胞仪检测处理前后细胞周期的变化,用Western blot法检测细胞内PKR、磷酸化PKR(phosphated PKR,p-PKR)、真核翻译启始因子2α(eukaryotic initiation factor-2α,eIF2α)、磷酸化eIF2α(phosphated eIF2α,peIF2α)蛋白表达的变化,用3H-亮氨酸掺入实验检测细胞总蛋白合成水平的变化。结果:polyIC对K562细胞和ECV304细胞生长和增殖均具有非特异性抑制作用,而RV-40AS仅对K562细胞具有特异性的抑制效应。PKR抑制剂能阻断RV-40AS对K562细胞的抑制效应。polyIC和RV-40AS作用K562细胞24h后,S期细胞减少[polyIC组(37.26±2.35)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05;RV-40AS组(31.48±3.65)%,未处理组(58.53±5.42)%,P<0.05],G0/G1期细胞增多[polyIC组(50.97±2.18)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05;RV-40AS组(57.47±3.61)%,未处理组(36.44±4.20)%,P<0.05]。polyIC处理K562细胞组、ECV304细胞组以及RV-40AS处理K562细胞组的p-PKR和p-eIF2α蛋白表达显著上调,且总蛋白合成水平下降[RV-40AS处理的K562细胞组(3.5±1.9)cpm/ng,未处理组(26.8±2.6)cpm/ng,P<0.05]。结论:外源重组反义RNA与bcr/abl融合基因的mRNA形成的dsRNA可通过激活PKR而抑制K562细胞的生长增殖,其机制是通过活化的PKR使蛋白合成启始因子eIF2α磷酸化,从而阻断细胞内蛋白合成的启动,及阻止细胞周期进程来实现。

黄芩抑制脂多糖/三磷酸腺苷诱导的内皮细胞NIMA相关蛋白激酶7(NEK7)表达和Nod样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体激活

【目的】观察黄芩和黄芩苷对脂多糖(LPS)/三磷酸腺苷(ATP)诱导的人脐静脉内皮细胞(HUVECs)NIMA相关蛋白激酶7(NEK7)和Nod样受体蛋白3(NLRP3)小体表达的影响。【方法】将HUVECs随机分为空白对照组、模型组、阿托伐他汀组、黄芩苷组和黄芩血清组,按分组相应药物预处理细胞24 h,然后用1μg/mL LPS刺激细胞24 h,再用5.5 mmol/L ATP刺激细胞4 h后检测各指标。四甲基偶氮唑盐(MTT)法检测细胞活力,均相竞争法测定细胞上清液中内皮素1(ET-1)的含量,硝酸还原酶法测定细胞上清液中总硝酸盐(NOx)水平,蛋白免疫印迹法检测细胞内NEK7、NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白(ASC)、裂解型胱天蛋白酶1(cleaved-Caspase-1)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达。【结果】与模型组比较,黄芩血清组、黄芩苷组、阿托伐他汀组LPS/ATP诱导的细胞活力升高,ET-1水平降低、NOx水平升高,NEK7、NLRP3、ASC、cleaved-Caspase-1、IL-1β的蛋白表达水平降低(P<0.05或P<0.01),且黄芩血清组、黄芩苷组的作用效果优于阿托伐他汀组。【结论】黄芩和黄芩苷可以抑制LPS/ATP诱导HUVECs的NLRP3炎症小体激活引起的细胞焦亡而保护内皮,其机制可能与调控NEK7表达有关。

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶2α过表达通过Wnt/β-Catenin信号通路抑制肝癌细胞株BEL7402增殖

血清和糖皮质激素调节蛋白激酶(SGK)家族参与调节生长因子和激素的信号转导.为了研究SGK家族成员SGK2α在细胞中的功能,构建了真核表达质粒pEGFP-N1-SGK2α并瞬时转染HEK293细胞,通过激光共聚焦显微镜观察发现融合蛋白SGK2α-GFP主要定位于细胞浆,免疫共沉淀实验发现SGK2α与糖原合成激酶3β(GSK3β)存在相互作用.利用PCDNA6-V5-HisB-SGK2α质粒转染肝癌BEL7402细胞,建立稳定表达SGK2α蛋白的细胞系,通过细胞增殖实验发现,SGK2α的过表达使BEL7402细胞生长速度减慢、细胞倍增时间延长.裸鼠成瘤实验发现,与对照组细胞相比表达SGK2α的BEL7402细胞在裸鼠中的成瘤能力明显降低.免疫印迹实验证实,SGK2α的过表达不影响GSK3β的表达,但却使β-catenin和Cyclin D1的表达下调.提示影响Wnt/β-catenin信号通路关键分子的表达可能是外源性SGK2α蛋白过表达抑制BEL7402细胞增殖的分子机制.

极低密度脂蛋白对大鼠系膜细胞增殖及P42活化蛋白激酶活性的影响

目的:研究极低密度脂蛋白(VLDL)对SD大鼠系膜细胞(MCs)的促增生作用以及VLDL对MCs P42有丝分裂原活化的蛋白激酶(P42 MAPK)活性的影响.探讨P42 MAPK介导的细胞内信号转导途径在上述系膜细胞增生中的作用.方法:采用XTT法测定不同时间、不同浓度VLDL对MCs的促增生作用,借助流式细胞术观察细胞凋亡情况以了解VLDL对MCs是否具有毒性作用;通过同位素标记法测定MCs P42 MAPK活性;观察P42 MAPK抑制剂PD98059抑制该激酶后MCs的增生情况以及激酶活性变化.结果:①不同浓度VLDL(10～500μg/m1)、不同时间(6～48h)与XTT光密度(AD)值呈线性关系[r分别为0.911(P＜.01、0.651 P＜0.05)].当VLDL浓度达1000μg/ml时,MCs出现凋亡;②VLDL可以以剂量关系(10～1000μg/ml)促进MCs的P42 MAPK活性(r=.872,P＜0.05);随VLDL刺激时间延长,P42 MAPK活性增加,但不呈线性关系,分别在30 min、6h、48 h出现波峰[分别为(118.67±6.43)cpm/k、(140.50±17.68)cpm/k与(128±5.66)cpm/k];③PD98059抑制了P42 MAPK后,P42 MAPK活性显著降低;不同浓度、不同时间VLDL刺激MCs后的XTTAD值也显著降低.结论:①在一定浓度内(10～500μg/ml)VLDL可以以浓度、剂量依赖性的关系促进MCs的增生,但高浓度则可促进细胞凋亡,具有毒性作用;②VLDL可以活化P42MAPK;③VLDL可以通过P42 MAPK途径介导促进MCs增生,而且可能是仅通过该激酶途径介导促进MCs增生.

人肺癌细胞中蛋白激酶C亚类与cAMP-PKA系统相关性的研究

为了探讨蛋白激酶Ｃα（ＰＫＣα）及其与环腺苷酸－蛋白激酶Ａ（ｃＡＭＰ－ＰＫＡ）信号系统的相关性，用六甲撑双乙酰胺（ｈｅｘａｍｅｔｈｙｌｅｎｅｂｉｓａｃｅｔａｍｉｄｅ，ＨＭＢＡ）和ＰＫＣ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ分别处理人肺癌细胞ＬＴＥＰａ－２，统计细胞生长百分数，测定ｃＡＭＰ水平。用斑点杂交方法检测ＰＫＣα基因表达，并测定表达反义ＰＫＣα的人肺癌ＬＴＥＰａ－２细胞中ＰＫＣ与ＰＫＡ激酶活性。结果显示：５μｍｏｌ／ＬＨＭＢＡ处理人肺癌ＬＴＥＰａ－２细胞３ｄ后，细胞增殖明显被阻抑，ＰＫＣα基因表达下降，ｃＡＭＰ水平升高。０．１５ｍｇ／ＬＰＫＣ抑制剂ＣａｌｐｈｏｓｔｉｎＣ导致人肺癌细胞增殖速度减慢时，ｃＡＭＰ水平也升高。在表达反义ＰＫＣα的人肺癌ＬＴＥＰα－２细胞中，当ＰＫＣα基因和蛋白表达被阻抑、ＰＫＣ活性明显降低的同时，ＰＫＡ活性则显著升高。结果提示：在人肺癌细胞中ＰＫＣα亚类和ｃＡＭＰ－ＰＫＡ通路显示出拮抗关系。ＰＫＣα和ＰＫＡ两套信号系统相互作用。

p38丝裂素活化蛋白激酶介导自发性高血压大鼠血管平滑肌细胞增殖

目的研究p38丝裂素活化蛋白激酶(p38MAPK)信号传导通路在血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的自发性高血压大鼠(SHR)血管平滑肌细胞(VSMC)增殖中的作用。方法本实验采用体外培养SHR胸主动脉平滑肌细胞,用3H-胸腺嘧啶核苷([3H]-TdR)掺入法测定细胞增殖状况。用特异性的Phospho-p38MAPK抗体的蛋白免疫印迹法(Westernblot)检测p38MAPK的活性。结果1)AngⅡ、PDGF成剂量依赖性促进SHR血管平滑肌细胞[3H]-TdR掺入率,当AngⅡ为10-7mol/L、PDGF为10ng/L时,[3H]-TdR掺入率显著增加[AngⅡ组:(11588±1322)比对照组(2546±207)计数/min;PDGF:(5279±391)比对照组(2587±230)计数/min,P<0.05]。p38MAPK选择性阻断剂SB202190(10-9～10-7mol/L)呈浓度依赖性地降低AngⅡ、PDGF诱导的VSMC增殖活度。2)AngⅡ、PDGF对p38MAPK的磷酸化均有显著增强作用,此作用同样被SB202190抑制。3者作用都呈剂量依赖性。结论AngⅡ、PDGF能激活SHR血管平滑肌细胞的p38MAPK发生磷酸化,进而导致血管平滑肌细胞增殖。

磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B信号通路对MC3T3-E1细胞增殖和周期调控的研究

目的近年的研究显示,磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide 3-kinase,PI3K)/蛋白激酶B(protein kenase B,PKB/Akt)信号通路是骨形成和骨重建的关键调控信号,文中研究抑制PI3K/Akt信号通路后对MC3T3-E1细胞增殖和细胞周期的影响。方法用PI3K/Akt信号抑制剂PF-04691502处理MC3T3-E1细胞后,通过MTS法检测细胞增殖的活性,流式细胞仪检测细胞周期的变化,Western blot检测细胞周期相关蛋白的表达。结果应用抑制剂抑制PI3K/Akt信号通路后,与对照组细胞存活率(100±5.6)%比较,30、150、750 nmol/L的MC3T3-E1细胞增殖活性明显降低[(64.7±4.1)%、(42.3±1.1)%、(15.9±0.4)%,P<0.01],且随着药物浓度的增加,细胞增殖活性降低越明显。同时,与对照组比较,1μmol/L PF-04691502处理组sub-G1期细胞比例明显升高[(1.45±0.43)vs(0.27±0.21),P<0.01],且细胞周期蛋白D1表达降低。结论抑制PI3K/Akt信号通路能将MC3T3-E1细胞阻滞于G1期,能降低细胞的增殖能力。

钙调素依赖性蛋白激酶在平滑肌细胞增殖周期中的变化

在培养的兔主动脉平滑肌细胞(ASMC)中,鉴定了钙调素依赖性蛋白激酶(CaM—PK),并研究了其在ASMC增殖周期中的变化规律。CaCl_2对酶的半激活浓度(AC_(50))为190μmol/L,三氟啦螓(TFP)对酶的半抑制浓度(IC_(50))为560μmol/L。CaM—PK在ASMC增殖周期中的活性变化规律为:从G_0期进入G_1早期,酶活性逐渐下降,并趋向消失;G_1中期(6h)酶活性又开始升高;至G_1晚期(9h)达到高峰,为152％;DNA合成之前又降至9％(以G_0期酶活性为100％)。

蛋白激酶Cα对人正常肝和肝癌细胞周期及G_1期相关调控因子cyclinD1、cyclinE的影响

目的 探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对人正常肝和肝癌细胞周期的作用和对G1 期相关调控因子的影响。 方法 通过细胞转染技术将PKCαcDNA正向插入的真核表达质粒PXJ4 1 PKCα导入正常肝细胞 (L 0 2 ) ,并利用本室已构建的表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )检测细胞的生长曲线 ,细胞周期以及细胞对G1 期相关调控因子cylinD1和cyclinE的影响。 结果 构建了稳定过表达PKCα的人正常肝细胞模型 (LT3) ,过表达PKCα可促进L 0 2细胞增殖 ,促进细胞由G1 期向S期的过渡 ;cyclinD1和cyclinE的蛋白水平上升 ,反之表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )增殖被抑制 ,阻抑细胞由G1 期向S期的过渡 ,cyclinD1和cyclinE的蛋白水平下降。 结论 从正反两个方面表明 ,PKCα可通过作用于G1 期相关周期蛋白的水平影响G1 S期的进程。

5-羟色胺对心肌细胞增殖及蛋白激酶C活性的影响

目的 :观察 5 -羟色胺 (5 -HT)对新生大鼠心肌细胞增殖及蛋白激酶C(PKC)活性的影响 ,探讨 5 -HT在心肌肥大发病中的作用。方法 :培养乳鼠心肌细胞 ,应用BCA法测定细胞总蛋白 ;流式细胞仪测定DNA含量 ;同位素底物掺入检测PKC活性。结果 :5 -HT在 1 μmol·L- 1 、1 0 μmol·L- 1 和 1 0 0 μmol·L- 1 时均显著促进心肌细胞蛋白质和DNA合成 ,以 1 0 μmol·L- 1 剂量时作用最强。 5 -HT在 1 μmol·L- 1 和 1 0mol·L- 1 剂量时可加强心肌细胞PKC活性 ,并促使PKC从胞浆移位到细胞膜 ,5 -HT2 受体拮抗剂mianserin可逆转此作用。结论 :5 -HT可促进新生大鼠心肌细胞总蛋白和DNA合成 ,并通过心肌细胞 5 -HT2 受体激活PKC活性 ,促使PKC从胞浆移位到细胞膜 ,提示 5