CRISPR/Cas9方法失活白念珠菌CaMIT1基因及其突变株表型分析

目的构建白念珠菌CaMIT1基因突变株,研究CaMIT1基因在白念珠菌中的功能。方法本文采用CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeat)/Cas9这种新的方法构建CaMIT1失活突变株,并通过倍比稀释的方法初步研究CaMIT1的功能。结果成功获得了CaMIT1基因的纯合子失活突变株,表型实验结果显示该基因突变株对钙离子、锂离子、十二烷基磺酸钠、克霉唑、酮康唑、Anidualafungin敏感,对刚果红耐受。结论 CaMIT1与白念珠菌的细胞质膜和细胞壁完整性以及钙离子的稳态相关。

白念珠菌CaSPO75基因的敲除与功能研究

酿酒酵母中ScCsc1是一个最近鉴定的钙离子通透性压力门控阳离子通道蛋白,参与调控胞内离子稳态。ScSpo75是ScCsc1的一个同源蛋白,可能参与孢子壁的装配过程。在白念珠菌中存在一个与ScSPO75同源的基因CaSPO75,其功能尚不清楚,因此采用SAT1-flipper方法敲除CaSPO75的两个等位基因以研究其功能。通过表型筛选,发现该基因的缺失导致白念珠菌对特比萘芬(Teb)、荧光增白剂(CFW)、氯化锰和氯化锌耐受,对酮康唑(KCZ)敏感。因此,CaSPO75基因可能参与白念珠菌耐药性和细胞壁压力反应的调控,以及胞内锰离子和锌离子稳态的调控。

通过CRISPR/Cas9基因编辑手段构建白念珠菌CaHSL1基因的失活突变体及其表型分析

钙离子稳态和钙离子信号途径对白念珠菌的形态发生、耐药性以及毒力都十分重要。白念珠菌和酿酒酵母菌的细胞质膜蛋白质Rch1p均富集在母细胞和子细胞之间的芽颈部位,负向调控胞外钙离子的内流。与细胞周期调控相关的蛋白激酶Hsl1p也存在于白念珠菌和酿酒酵母菌的芽颈部位。该研究发现,抑制CaHSL1基因的表达或者通过CRISPR(clustered regularly interspaced short palindromic repeat)/Cas9新方法失活CaHSL1基因,均可导致白念珠菌对钙离子敏感,这种钙离子敏感性可以被钙调磷酸酯酶的专一性抑制剂环孢霉素抑制。这个结果表明,钙离子稳态和钙信号转导途径可能与细胞周期调控有关。此外,CaHSL1基因失活突变体对十二烷基磺酸钠、氟康唑、酮康唑、刚果红、潮霉素B、卡泊芬净和Anidualafungin敏感,表明CaHsl1p与细胞质膜和细胞壁胁迫的应答相关。