应用滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法快速筛选克隆甜橙细胞壁酸性转化酶基因(CS-CWI)

根据GenBank中已知的植物细胞壁转化酶基因的保守区序列设计一对PCR引物,分别以滤纸(吸附有甜橙基因组噬茵体文库LB平板的噬菌体)和Top agarose(滤纸吸附后的LB平板)的SM洗脱液为模板,仅通过7次PCR就快速、准确、经济地筛选出CSCWI阳性克隆。提取该阳性克隆的DNA并进行BamH Ⅰ和Hind Ⅲ双酶切,通过PCR方法鉴定阳性酶切条带并回收,利用Taq DNA聚合酶的聚合活性和3’末端转移酶活性,改变该片段使其含有3’腺苷酸(A)突出末端,与pUCm-T载体实现了高效连接。阳性噬菌斑克隆及阳性条带的正确性得到测序的验证,表明滤纸吸附-PCR法和改进的亚克隆方法可正确和高效地应用于PCR筛选文库和亚克隆。

木薯细胞壁酸性转化酶基因MeCWINV1启动子的克隆及其在烟草中的瞬时表达分析

为了解木薯细胞壁酸性转化酶基因Me CWINV1胁迫诱导模式及调控机制,本研究利用PCR的方法,从木薯基因组中分离到一段Me CWINV1基因启动子序列(Gen Bank登录号:KC465190)。分析结果显示,该启动子长度865 bp,含有TATA box和CAAT box保守元件,以及MBS、HSE、AT1等多个与植物逆境胁迫相关的元件。通过构建GUS基因融合表达载体,对该启动子在烟草中的瞬时表达进行分析。结果表明,GUS基因主要在烟草叶脉中表达。研究结果为进一步研究该启动子的功能奠定了基础。

木薯细胞壁酸性转化酶MeCWINCV5基因启动子的克隆和序列分析

[目的]了解MeCWINCV5在植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答中的功能。[方法]采用PCR方法从木薯基因组中分离MeCWINCV5基因启动子序列,考察MeCWINCV5对植物生长发育、激素调节和逆境胁迫应答的影响。[结果]分析显示启动子的长度为1 170 bp,含有TATA box和CAAT box等多个典型的真核生物启动子基本元件元件,还存在大量逆境胁迫诱导相关的顺式调控元件,如HSE、MBS、SARE、GARE-motif和TATC-box等多个与植物逆境胁迫相关的元件。[结论]MeCWINCV5基因启动子与逆境胁迫有关,在木薯抵御逆境胁迫的生理过程中具有重要作用。

细胞壁转化酶调控番茄响应灰霉菌侵染的转录组分析

由死体营养型病菌(necrotrophic pathogen)灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)侵染引起的灰霉病是番茄生产上的常见病害,可导致番茄大面积减产甚至绝收。蔗糖分解代谢在植物抗病中发挥着重要作用,不仅可为植物防御反应提供碳骨架和能量,还可通过信号途径调控抗病基因的表达。研究表明,分解蔗糖的细胞壁转化酶(cell wall invertase,CWIN)可增强植物对死体营养型病害的抗性。然而,目前尚无CWIN对番茄灰霉病抗性影响的相关研究。本研究以CWIN活性上调的转基因番茄(RNAi/R)及野生型番茄(WT/W)为材料,对其叶片进行灰霉菌(Bc)离体接种,研究CWIN对番茄灰霉病抗性的影响,同时对接种后12、60 h的叶片进行取样,通过转录组测序初步阐明CWIN调控番茄灰霉病抗性的分子机制。结果表明:(1)提高番茄CWIN活性可增强番茄叶片对灰霉病菌的抗性。(2)KEGG注释表明,接种12 h的DEGs(W-Bc-12 h-vs-R-Bc-12 h)共获得5个显著性富集通路,包括次生代谢物生物合成(biosynthesis of secondary metabolites)、代谢途径(metabolic pathways)、DNA复制(DNA replication)、淀粉和蔗糖代谢(starch and sucrose metabolism)以及甾族化合物生物合成(steroid biosynthesis);接种60 h的DEGs(W-Bc-60 h-vs-R-Bc-60 h)则未发现显著性富集通路,表明接种早期是CWIN调控番茄抗病性的关键时期。(3)植物-病原菌互作图分析表明,参与超敏反应和防御相关基因诱导的富含亮氨酸重复(LRR)受体类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶基因FLS2和热激蛋白基因HSP90在接种后的RNAi叶片中上调,其可能是CWIN增强番茄抗病性机制中的重要基因。(4)植物激素信号通路和MapMan作图分析表明,接种后RNAi番茄的抗病激素茉莉酸(JA)和乙烯(ET)信号途径上调,同时水杨酸(SA)信号途径减弱,表明其可能共同作用提高RNAi番茄的抗病性。此外,接种后RNAi番茄叶片的生长促进激素生长素(IAA)和细胞分裂素(CTK)信号途径增强,而衰老促进激素脱落酸(ABA)信号途径减弱,这样可以抑制病菌侵染期间细胞的死亡,从而阻止死体营养型病菌灰霉病菌从死亡寄主细胞上获得必要的养分用于侵染。此外,MapMan作图还揭示接种后RNAi番茄叶片在细胞壁增厚、蛋白水解、活性氧(氧化还原状态和过氧化物酶)、次生代谢物方面也得到极大的加强,这些途径均有助于提高番茄的抗病性。综上,提高CWIN活性可增强番茄灰霉病抗性,转录组分析不仅验证已有的CWIN抗病分子机制,如细胞壁加厚、活性氧积累和超敏反应(HR)、抗病激素积累(SA和JA/ET)、病程相关蛋白(如HSP和PR)和次生代谢物的合成(如植物毒素和多酚等)等,而且还挖掘出一些新的CWIN抗病机制,包括生长促进激素(IAA和CTK)和衰老促进激素(ABA)信号途径和蛋白水解途径。研究结果可为下一步利用基因工程、分子育种等现代生物技术手段提高番茄灰霉病抗性提供理论指导。

甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员鉴定及表达分析

甘薯是重要的粮食、饲料、工业原料作物和新型的生物能源作物,细胞壁蔗糖转化酶是植物源、库组织蔗糖代谢的关键酶,但关于甘薯细胞壁蔗糖转化酶基因IbCWIN家族成员的研究尚未见报道。本研究测定供试品种不同组织部位的蔗糖淀粉含量,利用生物信息学方法对IbCWIN基因家族的理化性质、保守结构域、系统进化关系、启动子作用元件、组织特异性表达模式进行分析。结果表明,甘薯茎中蔗糖含量最高,须根和叶次之,块根最低;块根淀粉含量最高,极显著高于其他部位。甘薯中含有10个IbCWIN基因,编码氨基酸442~1115个,蛋白质分子量范围49.56~124.44kD,等电点为5.0~9.1。分布在8条染色体上,都含有Glyco_32保守结构域及相同或相似的保守基序motif,属于糖基水解酶基因家族GH32。IbCWIN与木薯MeCWINV同源性高,IbCWIN基因家族启动子区域含有多种类型的顺式作用元件。qRT-PCR结果表明,IbCWIN基因家族在甘薯不同组织中均有表达且有多种表达模式,其中IbCWIN2和IbCWIN9在块根中表达量显著高于其他组织部位。本研究为下一步探索甘薯IbCWIN基因家族的功能及调控甘薯源、库关系机制提供理论指导。

甘蔗细胞壁转化酶基因(SoCIN1)克隆及其在转基因烟草中的表达特性分析

【目的】克隆甘蔗细胞壁转化酶基因(So CIN1)并分析其在转基因烟草植株中的表达特性,为研究CIN1基因功能提供参考。【方法】克隆So CIN1基因,利用基因重组技术构建植物正义表达载体p BI121-So CIN1,采用叶盘法经农杆菌EHA105介导将其转化烟草品种K346。经抗性筛选和PCR扩增验证后获得转So CIN1基因烟草植株,采用半定量PCR检测叶片So CIN1基因的表达量,并测定叶片可溶性糖含量、CIN活性及株高(以野生型烟草为对照)。【结果】克隆获得的So CIN1基因长度为1731 bp,与Gen Bank已公布的So CIN1基因(JQ312298)核苷酸序列同源性达100%,并通过构建其植物正义表达载体转化烟草。PCR扩增鉴定结果表明,So CIN1基因已整合至烟草基因组DNA。对F0和F1代进行转基因烟草连续筛选,获得4个转So CIN1基因烟草株系(T-1、T-2、T-3和T-4)。在4个株系的叶片中均检测到So CIN1基因的表达,其中以在T-1株系叶片中So CIN1基因表达量最高,其次是T-3株系,最低的是T-4株系。4个株系叶片的可溶性糖含量、CIN活性及株高均高于野生型烟草,其中CIN活性显著高于野生型烟草(P<0.05,下同),且T-1株系CIN活性高于其他3株系;T-1、T-2和T-3株系叶片可溶性糖含量分别显著高于野生型烟草39.68%、19.95%和31.15%;T-1、T-2、T-3和T-4株系的株高较野生型烟草分别提高了15.57%、2.90%、5.74%和5.22%,但仅T-1株系与野生型烟草存在极显著差异(P<0.01)。【结论】转So CIN1基因烟草叶片过表达So CIN1基因,能提高烟草的CIN活性和可溶性糖含量,促进植株生长,由此推测该基因在甘蔗生长发育和蔗糖积累过程发挥作用。

甘蔗可溶性酸性转化酶(SoSAI1)基因的克隆及表达分析

【目的】克隆甘蔗可溶性酸性转化酶基因(SoSAI1)全长cDNA序列和5侧翼启动子序列,并分析其序列特征和基因表达模式。【方法】利用RACE技术克隆SoSAI1的全长cDNA序列,应用生物信息学软件分析SoSAI1预期编码蛋白特征;采用Genome Walking技术克隆SoSAI1的启动子序列;采用实时荧光定量PCR分析不同生长期SoSAI1在甘蔗叶和茎中的表达,以及PEG 6000、100 mmol·L-1NaCl和6℃胁迫下,SoSAI1在甘蔗苗期根和叶中表达模式。【结果】SoSAI1的cDNA序列全长为2 387 bp,ORF长2 058 bp,编码685个氨基酸,预测其分子量和等电点分别为74.44 kD和5.6,GenBank登录号为JQ406875。5侧翼启动子序列长417 bp,含有胚乳特异表达顺式作用元件和参与干旱诱导的MYB结合位点,GenBank登录号为KC862314。SoSAI1表达在生理成熟期的花序和花序轴中较高,而在成熟茎和老茎中较低。15%PEG和6℃能诱导叶中SoSAI1表达,而15%PEG和NaCl能诱导根中SoSAI1表达。【结论】获得SoSAI1全长cDNA序列和部分启动子序列,SoSAI1在甘蔗生长发育和蔗糖积累,并在应对环境胁迫中发挥作用。

柑橘酸性转化酶基因片段的克隆

分析植物液泡和细胞壁转化酶基因的保守区序列，分别设计一对PCR引物，以柑橘基因组DNA为模板，采用PCR方法分别扩增出长约740 bp和530 bp的DNA片段，分别克隆入pBS－T 和pMD18－T载体，进行测序，结果表明，获得柑橘酸性转化酶基因家族的两个成员，成员A和B基因片段分别长742 bp和524 bp。其序列已在GenBank中登记（登记号分别为AF014925和AF314197）。在GenBank中进行同源性检索，结果表明，成员A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与拟南芥的最高，达76％，而成员B编码的氨基酸与植物细胞壁酸性转化酶的氨基酸同源性较高，与豌豆的最高，达71％。两成员核苷酸和氨基酸序列同源性分别为55％ 和50％，推测酸性转化酶基因成员A 和B编码的蛋白分别定位于液泡和细胞壁。

甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

根据在GenBank中登录的番茄、胡萝卜和柑桔等酸性转化酶基因的保守序列设计引物 ,采用RT -PCR方法 ,从甜瓜果实总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,克隆到pMD18 T载体中。序列分析表明 ,它与其它植物的酸性转化酶基因的同源性很高 ,与番茄氨基酸序列同源性为 99%,说明已经成功克隆到甜瓜果实酸性转化酶基因cDNA片段 ,在GenBank中登记号AF490 42 5。

甜瓜反义酸性转化酶基因对甜瓜的遗传转化

利用子房注射法将甜瓜反义酸性转化酶基因导入厚皮甜瓜自交系‘01-3’果实,应用PCR和Southern Blot对后代进行分子鉴定。结果表明,330株甜瓜转化植株中,有2株为阳性转基因植株,转化率约为0·6%。进一步研究发现,T0代转基因甜瓜植株生长势减弱,果实比对照小30%左右,但可溶性糖含量比对照提高了52%。PCR和PCR-Southern Blot鉴定表明,T0-1的自交后代没有基因丢失,反义酸性转化酶基因已在转基因植株中稳定遗传。T1代转基因植株生长势也明显减弱,但成熟果实可溶性总糖含量提高了26%,蔗糖含量比对照提高了2·5倍,果糖和葡萄糖含量略有降低,酸性转化酶活性比对照明显降低。这些结果表明,反义酸性转化酶基因通过降低酸性转化酶活性,调控了甜瓜果实蔗糖代谢过程,改变了甜瓜果实糖分组成,同时抑制了植株生长。

杨梅酸性转化酶基因cDNA分离及表达分析

杨梅果实富含蔗糖,酸性转化酶是蔗糖代谢关键酶,根据植物酸性转化酶基因保守区序列设计引物,提取杨梅叶片RNA,逆转录获得cDNA,以此为模板通过PCR技术扩增到长度为516bp的基因片段,克隆入pMD18-T载体中,命名为MrIVR1(GenBank:DQ339699)。测序及同源性检索表明,该基因推导氨基酸序列与君子兰、葡萄、草莓、胡萝卜等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为60%～69%。运用ClustalX软件对植物转化酶基因进行了系统树分析,结果显示,MrIVR1编码的蛋白质属于细胞壁酸性转化酶。半定量RT-PCR表达分析显示,MrIVR1基因在杨梅果实发育早期表达量最高,随着果实的发育表达量下降,在成熟果实中表达水平较低。

铁皮石斛可溶性酸性转化酶基因克隆与表达分析

【目的】克隆铁皮石斛Dendrobium officinale可溶性酸性转化酶基因SAI,分析该基因生物学信息及时空表达特异性。【方法】基于同源序列克隆铁皮石斛SAI基因c DNA全长,采用生物信息学方法进行序列分析,并采用qRTPCR进行组织特异性表达分析。【结果】铁皮石斛SAI基因全长为1 595 bp,c DNA编码区1 368 bp,Genbank登录号为KU598852。该基因编码455个氨基酸,蛋白相对分子质量为50 700。NCBI BLASTx分析表明,该基因氨基酸序列与柑橘Citrus unshiu酸性转化酶基因、甜橙C.sinensis酸性β-呋喃果糖苷酶基因序列相似性最高,达77%,与其他植物酸性转化酶基因的相似性均高于68%。聚类分析表明,铁皮石斛SAI基因与玉米Zea mays液泡转化酶基因、甘蔗Saccharum officinarum SAI基因亲缘关系最近。该基因编码的蛋白质属于非跨膜结构的亲水性热稳定蛋白,定位于液泡中。SAI基因在2年生铁皮石斛的茎中表达量最高,3年生的叶中表达量最低。【结论】成功克隆铁皮石斛液泡酸性转化酶基因,该基因在铁皮石斛不同组织不同生育时期的表达量差异较大。

甘蔗可溶性酸性转化酶基因的克隆及序列分析

可溶性酸性转化酶在植物糖代谢中起着关键作用,为了研究甘蔗中可溶性酸性转化酶,利用电子克隆与RT-PCR方法从甘蔗中分离出1个甘蔗可溶性酸性转化酶基因DNA及cDNA序列,DNA序列长度为3 266 bp,含有3个外显子和2个内含子,cDNA序列长度为1 890 bp,包含1 656 bp的完整开放阅读框,编码551个氨基酸。BLASTX分析显示,该蛋白与其它植物已知的酸性可溶性蔗糖转化酶具有很高的同源性,推测该蛋白为可溶性酸性转化酶。预测甘蔗SAI家族可能只有1个基因,这可能与其大量积累蔗糖的能力有重要关系。

枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析

以“宁杞1号”枸杞为试材，通过RT-PCR及RACE技术进行枸杞酸性转化酶基因的克隆及组织表达分析，并运用MEGA5．0软件对植物转化酶基因进行了系统树分析。结果表明：扩增获得2193bp的枸杞酸性转化酶基因，命名为LbSAJ（GenBank：KC776575），该基因推导氨基酸序列与马铃薯、番茄、梨等酸性转化酶基因氨基酸序列同源性为68％～100％；LbSAJ编码的蛋白质属于液泡酸性转化酶；Real—timePCR表达分析显示，L6SA，基因在枸杞花中表达量最高，在根中表达水平较低。

甜瓜果实酸性转化酶基因反义表达载体的构建(英文)

应用RNA反义技术抑制甜瓜果实发育过程中酸性转化酶活性,促进蔗糖积累,从而为培育优质品种提供了可行的新方法。将已克隆到pMD18-T载体上的甜瓜酸性转化酶基因用BamHⅠ和HincⅡ双酶切,得到该基因编码区1038bp的cDNA片段,将其定向插入到植物表达载体pROK2的BamHⅠ/SmaⅠ克隆位点,构建了甜瓜酸性转化酶cDNA反义表达载体(Anti-MAI1)。采用冻融法将其转入根癌农杆菌LBA4404,得到了完整的Ti质粒表达载体系统。利用叶盘法转化烟草,经PCR和PCR-Southern杂交检测,证明此基因已整合入烟草的核基因组中。

苹果液泡酸性转化酶基因片段的克隆及序列分析

在分析植物可溶性转化酶基因的保守区序列基础上 ,设计了一对PCR引物 ,以苹果(辽伏 )基因组DNA为模板 ,采用PCR方法扩增出长约 743bp的DNA片段 ,克隆入 pUCm T载体 ,测序结果表明 ,所获得的片段推测为苹果酸性转化酶基因的片段 ,该基因片段长度为 743bp ,是开放阅读框的一部分 ,无内含子。其序列已在GenBank中登记 (登记号为AF433644)。在Gen Bank中进行同源性检索 ,结果表明该成员编码的氨基酸与植物可溶性酸性转化酶的氨基酸同源性较高 ,与温州蜜柑 (GenBankAF0 1 4 92 5)、胡萝卜 (X671 63)、甜菜 (GenBankX81 796)和绿豆 (Gen BankD1 0 2 65)液泡酸性转化酶基因编码蛋白质的氨基酸分别具有 80 %、80 %、78%和 77%的同源性。而与定位于细胞壁的酸性转化酶 (不溶性 )同源性较低 ,由此可推测出本研究获得的苹果转化酶基因可能定于液泡。

柑桔酸性转化酶基因家族成员的克隆及特性分析

分析植物液泡和细胞壁酸性转化酶基因的保守区序列 ,设计 2对PCR引物 ,以温州蜜柑基因组DNA为模板 ,采用PCR方法扩增出长分别为 74 1bp(A)和 5 2 4bp(B)的 2个DNA片段 ,克隆入pUCm T载体测序 ,序列已在GenBank中登记 (登记号分别为AY0 2 94 81和AF332 881)。在GenBank中进行同源性检索 ,结果表明片段A编码的氨基酸与植物液泡酸性转化酶同源性较高 ,与胡萝卜、马铃薯和番茄同源性分别为 79%、79%和 78%。片段B编码的氨基酸序列与草莓、拟南芥和豌豆细胞壁转化酶同源性分别为 78%、78%和 77%。推测A和B分别定位于液泡和细胞壁。运用Clustalx和Bioedit软件包对已获得的柑桔转化酶基因家族的 7个基因序列进行分析 ,结果表明 7个基因分属转化酶基因家族的 4种类型。推测A和B为 2个新成员 ,分别属于柑桔液泡酸性转化酶基因Ⅱ型(CUAI2 )和细胞壁酸性转化酶基因Ⅱ型 (CUCWI)。Southern杂交结果表明 ,CUCWI和CSCWI 2个探针有时会出现较弱的杂交干扰信号 ,可采用CSCWI与CUCWI同源性较低的另一段序列制作探针进行杂交 ,也可通过缩短杂交时间、提高杂交和洗膜的温度以及降低洗膜SSC的浓度等措施来降低 ;

番茄果实酸性转化酶基因cDNA片段的克隆

根据酸性转化酶基因的保守序列设计引物 ,采用RT PCR方法 ,从番茄果实总RNA中扩增出目标cDNA片段 ,克隆到pMD18 T载体中。在所测的 10 38个核苷酸中 ,与GenBank中登记号为M810 81的番茄果实酸性转化酶基因高度同源 ,同源性为 99%。该基因片段在GenBank中已登记 ,登记号为AF4 90 5 30。

反义酸性转化酶基因对低温贮藏马铃薯块茎还原糖和淀粉含量的影响

对2个含有酸性转化酶(AcInv)反义基因的转基因马铃薯品系及对照品种进行低温贮藏(4℃)及室温还暖处理。随低温贮藏时间的延长,供试材料均表现出还原糖含量升高,总淀粉含量下降的趋势。低温处理40d时,“Ac转Atlantic”和“Ac转甘农薯2号”的还原糖含量比未转基因品种低23%和18%。总淀粉含量分别比未处理前下降约1.0%和1.3%,支链淀粉含量分别下降约1.4%和1.7%,淀粉直/支比明显低于对照,分别为0.29和0.38。块茎的石蜡切片显示,转基因块茎中深蓝色淀粉颗粒明显少于未转基因对照。另外,对低温贮藏的块茎室温还暖后,2个转基因品系的还原糖含量仍低于对照品种。实验结果证明反义AcInv基因对低温贮藏下块茎还原糖和淀粉含量具有下向调节作用。

植物酸性转化酶基因及其表达调控

酸性转化酶是蔗糖代谢的关键酶,在植物体中具有重要的生理作用。近十几年来,许多植物酸性转化酶基因已经克隆,其基因表达调控的研究也取得了很大的进展。本文综述了植物酸性转化酶基因及其蛋白结构、基因表达的器官和发育特异性以及糖、受伤、病原﹑胁迫和激素对基因表达的调节和蛋白抑制因子对酶活性的影响,并讨论了当前在该研究领域存在的问题。