白藜芦醇激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖

背景:细胞外信号调节激酶5信号蛋白对生物体的存活不可或缺,白藜芦醇能通过多种途径促进成骨细胞增殖,但其是否能通过细胞外信号调节激酶5信号蛋白调控成骨细胞功能还需进一步验证。目的:探究细胞外信号调节激酶5对MC3T3-E1细胞增殖以及相关分泌蛋白的调控作用,进一步验证白藜芦醇通过激活细胞外信号调节激酶5完成上述过程。方法:小鼠MC3T3-E1前成骨细胞分别用完全培养基、XMD8-92(细胞外信号调节激酶5抑制剂)、表皮生长因子(细胞外信号调节激酶5激活剂)和白藜芦醇单独干预及XMD8-92+表皮生长因子、白藜芦醇+XMD8-92干预后,通过Western blot检测各组细胞内细胞外信号调节激酶5、磷酸化细胞外信号调节激酶5蛋白,增殖相关蛋白Cyclin D1、CDK4、PCNA,以及成骨细胞分泌蛋白骨保护素、核因子κB受体活化因子配体的表达情况,使用细胞免疫荧光染色检测各组细胞外信号调节激酶5、骨保护素和核因子κB受体活化因子配体荧光强度,使用EdU染色检测各组细胞增殖情况。白藜芦醇干预MC3T3-E1细胞的适宜浓度及时间由细胞形态学观察和CCK-8实验确定。结果与结论:①细胞外信号调节激酶5信号蛋白的激活能有效促进MC3T3-E1细胞增殖、上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值;②白藜芦醇干预MC3T3-E1细胞的适宜浓度及时间为5μmol/L,24 h;③白藜芦醇可以激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白,进而促进成骨细胞增殖,并上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值;④研究结果表明,白藜芦醇可以通过激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白促进MC3T3-E1细胞增殖,并通过激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值。

过氧化物酶体膜蛋白4通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路促进肝细胞癌细胞的上皮间质转化

目的:探讨过氧化物酶体膜蛋白4(PXMP4)对肝细胞癌(HCC)细胞迁移和侵袭及上皮间质转化(EMT)进程的影响。方法:采用生物信息学和免疫组织化学方法分析HCC组织中PXMP4的表达,分析其与患者临床病理特征的相关性。在HCCLM3和MHCC97H细胞中干扰PXMP4,在Huh7和MHCC97L细胞中过表达PXMP4,利用WB和qPCR法验证干扰/过表达效率。利用CCK-8、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测干扰/过表达PXMP4对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,采用WB法检测干扰/过表达PXMP4或0、5、10和20μmol/L U0126处理对HCC细胞中N-cadherin、E-cadherin、vimentin、细胞外信号调节激酶(ERK)、p-ERK表达的影响。结果:生物信息学和免疫组织化学分析显示,HCC组织中PXMP4呈高表达(P<0.05)。临床病理分析发现,PXMP4的表达与肿瘤分化程度有关联(P<0.05)。在HCC细胞中,干扰PXMP4后抑制细胞增殖、侵袭和EMT进程(P<0.05);反之,过表达PXMP4后促进HCC细胞增殖、侵袭及EMT进程(P<0.05)。此外,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程,U0126处理同样能够抑制HCC细胞EMT进程。结论:PXMP4在HCC组织中呈高表达且与HCC细胞分化有关联,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程。

中药通过细胞外信号调节激酶信号通路调控胃癌的研究进展

胃癌在我国发病率和死亡率较高,存在发现晚、5年生存率低的特点,手术切除仍然是临床治疗的主要方法。大鼠肉瘤蛋白(Ras)/迅速加速性纤维肉瘤蛋白(Raf)/丝裂原活化的细胞外信号调节激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在调控细胞增殖、转移、凋亡等方面具有非常重要的作用,与胃癌的发生与发展密切相关。近年来,很多学者探索调控Ras/Raf/MEK/ERK信号通路治疗胃癌的作用机制,在信号转导机制研究、靶向抑制剂筛选、中医药治疗等方面取得大量成果,实验验证在胃癌的治疗中干预其信号传递具有良好的效果和应用前景。

虎杖苷调控Janus激酶1/信号传导和转录激活因子3信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤作用实验研究

目的:探讨研究虎杖苷调控Janus激酶1(JAK1)/信号传导和转录激活因子3(STAT3)信号通路对小鼠宫颈癌细胞凋亡及裸鼠移植瘤的作用。方法:选取人宫颈癌HeLa细胞株,分为对照组(未经任何处理的HeLa细胞)、虎杖苷低、中、高剂量组(加入50、100、150μmol/L虎杖苷),继续培养24、48、72 h, Annexin V双染法检测HeLa细胞凋亡,MTT检测HeLa细胞增殖能力,Transwell小室检测HeLa细胞侵袭能力,qRT-PCR检测JAK1、STAT3 mRNA表达,Western blot检测JAK1/STAT3信号通路相关蛋白表达,并进行细胞形态学观察。结果:与对照组比较,虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞凋亡率升高,高剂量组凋亡率高于中剂量组,中剂量组高于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞增殖和侵袭能力显著下降,虎杖苷高剂量组增殖率和侵袭细胞数最低(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组HeLa细胞中JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达显著下降,高剂量组JAK1、STAT3 mRNA和蛋白表达低于中剂量组,中剂量组低于低剂量组(均P<0.05)。虎杖苷低、中、高剂量组小鼠肿瘤体积缩小,肿瘤质量降低(均P<0.05)。结论:虎杖苷可诱导宫颈癌HeLa细胞凋亡,抑制其增殖、迁移、侵袭及裸鼠皮下成瘤,其作用机制可能与调控JAK1/STAT3通路信号通路有关。

基于磷脂酰肌醇3激酶与苏氨酸蛋白激酶1信号通路小檗碱调节巨噬细胞极化机制研究

目的探究小檗碱对氧化型低密度脂蛋白(ox-LDL)诱导的人髓系白血病单核细胞(THP-1)巨噬细胞极化的影响和可能作用机制。方法采用佛波酯(PMA)将THP-1细胞诱导成巨噬细胞,加入不同浓度的小檗碱,分别为对照组、小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组,干预24 h或48 h。采用细胞计数8试剂盒检测细胞活力,筛选小檗碱最佳浓度和时间。将PMA诱导的THP-1巨噬细胞分为空白组、模型组、小檗碱组、抑制剂组、小檗碱+抑制剂组。酶联免疫吸附测定检测诱导型一氧化氮合酶(iNOS)和转化生长因子β_(1)(TGF-β_(1))的含量;定量聚合酶链反应检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、精氨酸酶1(Arg1)、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)、苏氨酸蛋白激酶1(Akt1)mRNA表达情况;Western blot检测Akt1和磷酸化Akt1(p-Akt1)抗体蛋白含量。结果干预24 h时,与对照组比较,小檗碱40μmol/L组和50μmol/L组巨噬细胞活性降低(P<0.05);干预48 h时,小檗碱5μmol/L组、小檗碱10μmol/L组、小檗碱20μmol/L组、小檗碱40μmol/L组、小檗碱50μmol/L组巨噬细胞活性均低于对照组[(0.89±0.02)%、(0.82±0.03)%、(0.71±0.02)%、(0.62±0.03)%、(0.53±0.02)%vs(1.01±0.01)%,P<0.05]。小檗碱20μmol/L组处理24 h时对细胞活力影响不大,作为最佳浓度和时间。与空白组比较,模型组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05);与模型组比较,小檗碱组iNOS含量和TNF-αmRNA水平降低,TGF-β_(1)含量、Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平升高(P<0.05);与小檗碱组比较,小檗碱+抑制剂组iNOS含量和TNF-αmRNA水平升高,Arg1 mRNA、PI3K mRNA、Akt1 mRNA及p-Akt1/Akt1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论小檗碱可通过激活PI3K/Akt1通路,抑制ox-LDL诱导的THP-1巨噬细胞炎性反应,并抑制巨噬细胞向M1型极化,促进其向M2型极化。

细胞外信号调节激酶1/2信号通路调控细胞侵袭性的研究进展

细胞外信号调节激酶(ERK)1/2是一种蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶,参与Ras-Raf有丝分裂原激活蛋白激酶-ERK的信号转导级联,通过影响基因的转录和表达,参与细胞的生长、增殖甚至侵袭作用。肺癌、肝癌、卵巢癌、宫颈癌、子宫内膜异位症及子痫前期等多种疾病的发生,以及其疾病的转移和病情的进展,均与ERK1/2信号通路调控细胞侵袭性密切相关。因此通过探索ERK1/2信号通路侵袭性在相关疾病发病过程中可能发挥的重要作用,从而寻找更加有效的治疗方案。本文根据近些年国内外的最新研究,介绍ERK1/2信号通路侵袭性这一特性在各个疾病中所发挥的相关调控作用,以期为相关疾病的临床治疗研究提供新启示。

内质网应激头颈部鳞状细胞癌细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路促进巨噬细胞PD⁃L1表达

目的探讨内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)的头颈部鳞状细胞癌(head and neck squa⁃mous cell carcinoma,HNSCC)细胞分泌的外泌体miRNA表达变化对巨噬细胞的影响机制。方法本研究已通过单位伦理委员会审查批准。通过蛋白质免疫印迹(Western blot,WB)和实时荧光定量PCR实验(RT⁃qPCR)检测HNSCC肿瘤组织及癌旁组织ERS相关蛋白,包括蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R⁃like endoplas⁃mic reticulum kinase,PERK)和葡萄糖调节蛋白78(glucose⁃regulated protein 78,GRP78)的表达水平;以500 U/mL干扰素⁃γ(interferon⁃γ,IFN⁃γ)处理人喉鳞癌细胞系HN4细胞48 h,诱发HN4细胞产生内质网应激反应,收集HN4细胞分泌的外泌体,通过生物信息学分析鉴定外泌体的miRNA种类,预测miRNA的靶基因,将巨噬细胞转染miRNA、与收集的外泌体共培养、并敲低巨噬细胞PTEN表达,以WB和RT⁃qPCR检测外泌体miRNA调控的下游信号通路蛋白酪氨酸磷酸酶(phosphate and tension homology deleted on chromsome ten,PTEN)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)及程序性死亡受体⁃1配体(programmed death receptor ligand 1,PD⁃L1)表达变化。结果HNSCC肿瘤组织相比癌旁组织ERS相关蛋白表达水平升高(P<0.05);RNA测序及实验验证表明ERS的HN4细胞分泌的外泌体miR⁃26a⁃5p表达上调(P<0.05);PTEN是miR⁃26a⁃5p的靶基因,miR⁃26a⁃5p升高巨噬细胞PD⁃L1表达水平,并下调PTEN表达(P<0.05);巨噬细胞与ERS外泌体共培养,miR⁃26a⁃5p和PD⁃L1表达上升,PTEN表达下降,p⁃AKT表达升高(P<0.05);敲低巨噬细胞PTEN表达,PD⁃L1表达上升(P<0.01)。结论ERS的HNSCC细胞通过外泌体miR⁃26a⁃5p调控PTEN/AKT通路及PD⁃L1的表达。

淫羊藿素通过调控黏着斑激酶及下游细胞外信号调节激酶/细胞周期蛋白D1和蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路抑制肝癌细胞增殖的作用机制研究

目的探究淫羊藿素(icaritin,ICA)抑制肝癌细胞增殖的作用机制。方法以Huh7肝癌细胞为研究对象并在体外培养;设置200、100、50、20、10、5、2、1、0.5μmol/L不同浓度的ICA给药干预72小时之后,采用0.5%结晶紫染色分析ICA对Huh7肝癌细胞生存的影响;将Huh7肝癌细胞给与ICA高(10μmol/L)、中(5μmol/L)、低(2.5μmol/L)三个浓度,每个浓度设置三个复孔,通过克隆形成实验检测ICA对Huh7肝癌细胞增殖能力的影响;Huh7肝癌细胞给与ICA IC 50值浓度,对照孔及ICA给药孔分别在0、6、12、24小时在倒置显微镜下拍照,通过细胞划痕分析ICA对肝癌细胞迁移能力的影响;并且用流式细胞术对细胞周期进行分析。另外,通过蛋白印迹对增殖相关蛋白,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,p-FAK)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)等蛋白的表达水平进行分析。结果ICA可以明显抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力,并且使肝癌细胞的细胞周期在G1期发生阻滞(P<0.05)。另外,研究发现ICA可以下调p-FAK及其下游调节蛋白p-ERK、cyclin D1以及p-Akt、p-mTOR、p-S6的表达水平。结论ICA可能通过调控FAK及下游ERK/cyclin D1和Akt/mTOR信号通路从而抑制肝癌细胞的增殖生长。

雌激素受体β与磷酸化细胞外信号调控蛋白激酶1、2在卵巢癌中的表达及其临床意义

目的:探讨上皮性卵巢癌组织中雌激素受体β(ERβ)与磷酸化细胞外信号调控蛋白激酶1、2(p-ERK1/2)的表达及其与临床病理参数的关系。方法:选取2010年10月至2011年12月青岛大学医学院附属医院经病理证实的上皮性卵巢癌组织标本70例,卵巢良性肿瘤24例,正常卵巢组织24例。采用RT-PCR和免疫组织化学SP法检测上述组织中ERβ和p-ERK1/2的表达。结果:(1)卵巢癌组织中ERβmRNA相对表达水平(0.3764±0.9826)显著低于卵巢良性肿瘤(0.4900±0.3742)及正常卵巢组织(0.4980±0.0434)(P<0.05)。卵巢癌组织中ERβ表达与组织学分型、细胞学分级及淋巴转移有关(P<0.05);ERβ蛋白阳性表达率及其与临床病理特征关系与ERβmRNA一致;(2)ERK1/2 mRNA相对表达水平(0.6007±0.1554、0.6951±1.3694)显著高于卵巢良性肿瘤(0.3575±0.0479、0.5125±0.0411)及正常卵巢组织(0.3027±0.1024、0.5431±0.0811)(P<0.05);ERK1/2表达与细胞学分级、临床分期及腹水有关(P<0.05);p-ERK1/2蛋白阳性表达率及其与临床病理特征与p-ERK1/2 mRNA一致。ERβ蛋白与p-ERK1/2蛋白表达呈负相关(r=-0.282,P<0.05)。结论:ERβ低表达和p-ERK1/2高表达于卵巢癌组织,可能在卵巢癌的发生、发展中有重要作用。

外泌体介导的miR-663a通过调控TGF-β1/Smad信号通路影响结肠癌细胞侵袭和迁移

目的探讨外泌体介导的miR-663a通过调控转化生长因子(TGF)-β1/Smad信号通路对结肠癌细胞侵袭和迁移的影响。方法从人骨髓间充质干细胞(BMSC)培养液上清中分离外泌体,透射电子显微镜观察外泌体结构,Western印迹检测外泌体中CD63、CD81蛋白表达;将miR-NC、miR-663a mimics分别转染于外泌体,并分组为:EXO组(未转染的外泌体)、EXO-miR-NC组、EXO-miR-663a组,实时荧光定量聚合酶链式反应(qRT-PCR)检测各组外泌体中miR-663a的表达;将上述各组外泌体分别与SW480细胞共培养,并分别命名为SW480+EXO组、SW480+EXO-miR-NC组、SW480+EXO-miR-663a组,在SW480+EXO-miR-663a组中加入TGF-β1/Smad信号通路激活剂SRI-011381,命名为SW480+EXO-miR-663a+SRI组,另取SW480细胞记为SW480组作为对照,激光共聚焦显微镜观察SW480细胞内吞外泌体;Transwell实验检测各组细胞的侵袭与迁移;Western印迹检测各组细胞中TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达。结果透射电子显微镜观察到BMSC细胞的外泌体均呈现出直径为30~100 nm的囊泡状结构,Western印迹结果表明,CD63和CD81蛋白在BMSC细胞的外泌体中高表达,而在细胞裂解液中几乎不表达;EXO组中miR-663a的表达水平显著高于BMSC细胞(P<0.05);与EXO组和EXO-miR-NC组比较,EXO-miR-663a组中miR-663a的表达水平显著升高(P<0.05);激光共聚焦显微镜结果显示,PKH26标记红色荧光的外泌体主要位于SW480细胞胞质内,并分布在核周围,大部分SW480细胞可见到红色荧光信号;与SW480组比较,SW480+EXO组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著降低(P<0.05);与SW480+EXO组和SW480+EXO-miR-NC组比较,SW480+EXO-miR-663a组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达进一步显著降低(P<0.05);SW480+EXO-miR-663a+SRI组细胞侵袭数目、迁移数目及TGF-β1、Smad2、Smad3蛋白表达显著高于SW480+EXO-miR-663a组(P<0.05)。结论外泌体介导的miR-663a通过抑制TGF-β1/Smad信号通路来抑制结肠癌细胞的侵袭和迁移。

miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的影响

目的:观察miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法:将大鼠随机数字法分为模型组、miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组。建模后,模型组经尾静脉注射10 mL/kg生理盐水,miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组分别经尾静脉注射7μL miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor与RNAi脂质体转染试剂的混合溶液。各组大鼠苏醒后的24 h进行神经功能评分,测定脑梗死体积、大鼠脑组织含水量,检测缺血侧大脑皮质细胞凋亡率,caspase-3、Bax、Bcl-2和ERK1/2蛋白表达。结果:miR-17-5p mimics组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率明显低于模型组,miR-17-5p inhibitor组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率显著高于其他2组;miR-17-5p mimics组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax蛋白表达明显低于模型组,Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达高于模型组;miR-17-5p inhibitor组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax、p-ERK1/2蛋白表达显著高于其他2组,Bcl-2蛋白表达低于其他2组。结论:miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的脑损伤具有一定的保护作用,miR-17-5p可抑制ERK1/2信号通路激活。

IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制人脐带间充质干细胞CD200表达抑制巨噬细胞M2极化

目的探究白细胞介素1β(IL-1β)调控人脐带间充质干细胞CD200表达及其对巨噬细胞极化的影响及作用机制。方法无血清培养基分离培养获得人脐带间充质干细胞(hUC-MSC),形态学观察及流式细胞术检测CD73、CD90、CD105、CD14、CD34、CD45、人类白细胞抗原DR(HLA-DR)的表达,确定间充质干细胞属性;20 ng/mL IL-1β处理hUC-MSC 24 h,流式细胞术检测CD200阳性细胞率,实时定量PCR和Western blot法检测CD200 mRNA和蛋白表达水平;佛波酯(PMA)诱导THP-1巨噬细胞活化,并与IL-1β处理感染CD200过表达慢病毒的hUC-MSC共培养,流式细胞术检测CD11c和CD206阳性细胞比例;IL-1β联合细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)特异性抑制剂PD98059处理hUC-MSC,Western blot法检测细胞丝裂原激活蛋白激酶(MAPK)信号分子与CD200的表达。结果IL-1β显著下调hUC-MSC CD200蛋白表达与CD200阳性细胞率;过表达CD200显著上调hUC-MSC CD200表达,且CD200过表达hUC-MSC提高巨噬细胞CD206阳性细胞比率;IL-1β激活hUC-MSC的ERK1/2信号通路,PD98059上调IL-1β处理后hUC-MSC中CD200的蛋白表达。结论IL-1β通过激活ERK1/2信号通路抑制CD200的表达,进而抑制hUC-MSC对巨噬细胞向M2型极化的促进作用。

circRNA SIPA1L1修饰牙髓干细胞来源外泌体促血管生成能力的机制

目的 探究环状RNA(circRNA)信号诱导增殖相关蛋白1样蛋白1(SIPA1L1)修饰的人牙髓干细胞(hDPSC)来源外泌体(Exo)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)血管生成能力的影响及机制。方法 从牙髓组织分离培养hDPSC,将circSIPA1L1过表达质粒载体转染至hDPSC后,分离Exo并进行鉴定。将HUVEC分为对照组、hDPSC Exo组、circSIPA1L1-hDPSC Exo组,培养48 h后,Matrigel基质胶血管形成实验检测血管形成能力,qRT-PCR和Western blot测定血管内皮细胞生长因子(VEGF)、血管内皮细胞生长因子受体2(VEGFR2)、胎盘生长因子(PGF)的表达水平。结果 从未转染的hDPSC与转染circSIPA1L1的hDPSC中成功分离出Exo,且相较于h DPSC来源的Exo,转染circSIPA1L1的hDPSC来源的Exo中circSIPA1L1相对表达量显著上调(P <0.05)。与hDPSC Exo组比较,circSIPA1L1-hDPSC Exo组HUVEC的管样结构形成数目显著增加(P <0.05),VEGF、VEGFR2、PGF mRNA与蛋白相对表达量也显著上调(P<0.05)。结论 circRNA SIPA1L1修饰hDPSC来源的Exo能够促进血管生成,其机制可能与上调VEGF、VEGFR2、PGF的表达水平有关。

基于JNK-p62/SQSTM1信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病大鼠足细胞的保护作用

目的 基于c-Jun氨基末端激酶(JNK)-p62/螯合体(SQSTM1)信号通路探讨糖肾煎对2型糖尿病肾病(DN)大鼠足细胞的保护作用。方法 SD大鼠随机分成正常组、DN组、糖肾煎低、中、高[生药5、10、20 g/(kg·d)]剂量组(糖肾煎-L、M、H组)、二甲双胍组[100 mg/(kg·d)]。除正常组外,其余各组通过喂养高脂高糖饲料和腹腔注射链脲佐菌素(STZ)进行DN模型构建。药物干预结束后,检测大鼠血生化指标空腹血糖(FBG)、负荷后2 h血糖(P2 h BG)、血肌酐(SCr)、血尿素氮(BUN)水平;苏木素-伊红(HE)、六胺银(PASM)染色观察肾组织病理学变化;透射电镜(TEM)观察肾小球基底膜损伤和足细胞变化情况;Western印迹检测肾组织中微管相关蛋白1A/1B-轻链(LC)3、p-JNK、JNK、p62/SQSTM1、肾病蛋白(Nephrin)蛋白表达。结果 与正常组比较,DN组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显升高,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显降低(P<0.05);光镜下观察到肾小球缩小、管丛系膜明显扩张,并有基底膜增生增厚等现象;TEM下观察到肾小球基底膜增厚、足细胞排列紊乱、形态改变、足突融合等现象。与DN组比较,糖肾煎-L、M、H组和二甲双胍组FBG、P2 h BG、SCr、BUN水平及p62/SQSTM1蛋白表达明显降低,LC3-Ⅱ、Nephrin蛋白表达和p-JNK/JNK明显升高(P<0.05);并且肾小球基底膜增厚、足细胞足突融合等情况均获得一定程度减轻。结论 糖肾煎对2型DN大鼠足细胞具有一定保护作用,可能是通过调控JNK-p62/SQSTM1信号通路,提高足细胞自噬,从而起到肾脏保护功效。

抗纤灵方对单侧输尿管梗阻大鼠肾组织肝细胞生长因子mRNA及细胞外信号调控蛋白激酶1/2和p38磷酸化的影响

目的:研究中药复方抗纤灵方对单侧输尿管梗阻(unilateral ureteral obstruction,UUO)所致肾纤维化大鼠肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)基因表达和丝裂原激活的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)通路的影响,初步探讨其发挥疗效的作用机制。方法:雄性SD大鼠18只随机分为3组,每组6只。用单侧输尿管结扎术建立大鼠肾纤维化模型,抗纤灵灌胃给药2周后检测血肌酐(serum creatinine,Scr)、血尿素氯(blood urea nitrogen,BUN)及梗阻肾羟脯氨酸含量;采用逆转录-多聚酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)检测HGF mRNA表达;采用蛋白免疫印迹法检测其受体c-Met蛋白表达及MAPK通路信号分子细胞外信号调控蛋白激酶1/2(extracellular signal-regulated protein kinase 1/2,ERK1/2)和p38磷酸化情况。结果:与假手术组比较.模型组大鼠Scr、BUN及梗阻肾羟脯氧酸含量均显著增高;肾组织HGF mRNA水平显著下调,c-Met蛋白表达显著上调,且ERK1/2和p38明显磷酸化。中药干预后,BUN及羟脯氨酸含量显著降低,肾组织HGF mRNA水平明显上调,ERK1/2和p38磷酸化被显著抑制。结论:抗纤灵方可通过增加肾纤维化保护性因子HGF mRNA的表达及抑制肾组织MAPK通路分子ERK1/2和p38磷酸化以改善肾间质纤维化大鼠肾功能,减少其胶原含量。

通络熄风汤通过调控Mst1/Sirt3信号通路对自发性高血压大鼠心肌损伤程度的影响

目的:探讨通络熄风汤改善高血压大鼠心肌损伤的作用机制。方法:6只Sprague-Dawley大鼠作为空白组,12只自发性高血压大鼠随机分为模型组和通络熄风汤组。空白组和模型组大鼠给予去离子水灌胃,通络熄风汤组给予中药配方颗粒通络熄风汤悬浮液灌胃治疗,连续干预8周。采用蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测心肌细胞中自噬受体蛋白1(SQSTM1/P62)、磷酸化哺乳动物无菌20样激酶1(p-Mst1)、沉默信息调节因子3(Sirt3)蛋白的含量,运用苏木精-伊红(HE)染色观察大鼠心肌组织结构变化,以评价通络熄风汤对高血压心肌损伤改善的效果及机制。结果:与模型组比较,通络熄风汤组能够显著改善高血压大鼠的收缩压及舒张压(P<0.01)。通络熄风汤治疗后大鼠心肌细胞与模型组比较,排列情况与坏死状态均有明显改善。通络熄风汤组大鼠心肌组织中的p-Mst1、P62蛋白含量较模型组降低(P<0.01),Sirt3蛋白含量升高(P<0.01)。结论:通络熄风汤可以介导Mst1/Sirt3信号通路对心肌组织细胞自噬水平进行调整,并且保护心脏功能。

细胞外信号调节激酶1／2信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞迁移功能变化中的调控作用

本研究旨在探讨细胞外信号调节激酶1／2(extracellular signal-regulated kinase,ERK1/2)信号通路在慢性哮喘模型大鼠支气管平滑肌细胞(bronchial smooth muscle cells,BSMCs)迁移能力改变中的调控作用。应用卵清蛋白致敏和雾化方法制备大鼠慢性哮喘模型,体外培养大鼠BSMCs,采用免疫荧光细胞化学、Western blot和RT-PCR方法检测ERK1／2信号通路的表达,分别用平面迁移实验和跨膜迁移实验来评价BSMCs的活动和趋向迁移能力,并比较用和不用ERK1／2信号通路干预剂的差异。Western blot结果显示慢性哮喘模型大鼠BSMCs中总ERK1／2(9．13±0．87)较对照组(4．68±0．59)明显增加,磷酸化ERK1／2(p-ERK1/2)占总ERK1／2的比值(0．55±0．05)较对照组(0．48±0．04)显著提高(n=10,P<0．01)。慢性哮喘组ERK1和ERK2 mRNA的表达(1．83±0．24和1．07±0．11)较对照组(0．58±0．14和0．51±0．12)明显增高(n=10,P<0．01)。在平面迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的迁移最远距离是对照组的(2．9±0．1)倍,在ERK1／2激动剂表皮生长因子(epidermal growth factor, EGF)刺激下增加到(5．0±0．2)倍,而在30μmol／L PD98059的作用后下降到(1．7±0．2)倍。正常对照大鼠BSMCs平面迁移能力对PD98059的反应较慢性哮喘组弱,仅在100μmol／L PD98059的作用下下降到(0．8±0．1)倍。跨膜迁移实验中,慢性哮喘大鼠BSMCs的跨膜迁移细胞是对照组的(1．9±0．1)倍,在EGF刺激下增加到(3．1±0．2)倍,而在30μmol/L PD98059作用后下降到(1.45±0.2)倍。这些结果表明慢性哮喘模型大鼠BSMCs的迁移能力明显增强,ERK1／2信号通路在该功能变化的调控中可能发挥了重要作用。

外泌体miR-20a-5p调控Sp1/CD147信号通路促进非小细胞肺癌的骨转移

目的探究外泌体miR-20a-5p对非小细胞肺癌(NSCLC)骨转移的调控作用及机制。方法提取并鉴定16HBE、A549、PC9、H1299细胞以及转染miR-20a-5p mimic和miR-NC的A549细胞所分泌的外泌体。qRT-PCR检测各种细胞及外泌体中miR-20a-5p的表达。将A549和RAW264.7细胞分为PBS组、16HBE exo组、A549 exo组、miR-NC exo组和miR-20a-5p exo组。Transwell小室检测A549细胞迁移和侵袭能力,TRAP染色检测破骨细胞分化。Western blot检测各组RAW264.7细胞Sp1和CD147的表达。6周龄的雌性Balb/c裸鼠随机分为5组,分别注射PBS(A组)、16HBE exo(B组)、A549 exo(C组)、miR-NC exo(D组)和miR-20a-5p exo(E组)外泌体4周,构建NSCLC骨转移的小鼠模型;HE染色观察各组小鼠骨转移情况。结果透射电镜下观察到A549 exo、PC9 exo、H1299 exo、16HBE exo为具有双层膜的囊泡样结构,粒径在30~100 nm,且均表达CD9、CD81、HSP70标志蛋白。miR-20a-5p高表达于NSCLC细胞及其外泌体。与PBS组相比,A549 exo组肿瘤细胞迁移和侵袭能力显著增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。与miR-NC exo组相比,miR-20a-5p exo组A549细胞迁移和侵袭能力增加(P<0.001),RAW264.7细胞中miR-20a-5p表达上调(P<0.001),破骨细胞分化显著增加(P<0.001),Sp1和CD147表达显著增加(P<0.001)。在小鼠体内实验中,A组、B组骨组织骨小梁结构完整,组织中有少量肿瘤细胞,骨髓腔相对完整,病变较少;C组小鼠骨组织出现大量肿瘤细胞且细胞紧密排列,骨小梁显著破坏,核浆比例严重失调,病变显著增加;E组小鼠骨组织中出现大量肿瘤细胞,骨小梁破坏严重,病变较D组显著。结论外泌体miR-20a-5p可显著促进NSCLC的体内外转移,其机制可能为激活破骨细胞Sp1/CD147信号通路从而促进破骨细胞的分化。

细胞外信号调节激酶1/2对糖尿病脑缺血再灌注大鼠海马区Bax表达的调控作用

目的探讨细胞外信号调节激酶1/2对糖尿病脑缺血再灌注大鼠海马区Bax表达的调控。方法采用链脲佐菌素诱导联合改良的Pulsineli 4血管阻断(4-VO)法制作糖尿病全脑缺血再灌注模型,并应用ERK1/2抑制剂U0126对糖尿病脑缺血再灌注大鼠预处理。分别在缺血1、6、24和48 h应用光镜观察海马区神经细胞形态变化;免疫组织化学法检测磷酸化ERK1/2和Bax表达水平。结果糖尿病脑缺血组各时间存活神经元密度显著低于血糖正常脑缺血组、磷酸化ERK1/2表达水平低于血糖正常脑缺血组、Bax表达水平高于血糖正常脑缺血组;应用U0126处理后,各时间点海马区神经元细胞存活密度降低、磷酸化ERK1/2表达降低、Bax表达增高。结论 ERK1/2活化通过介导Bax表达参与并介导了糖尿病加重全脑缺血再灌注后神经细胞的丢失。

细胞外调节蛋白激酶信号通路参与机械牵张诱导肺泡上皮细胞高迁移率族蛋白B1的表达调控

目的探讨细胞外调节蛋白激酶(ERK)信号通路在机械牵张诱导肺泡上皮细胞(A549)表达高迁移率族蛋白B1(HMGB1)中的作用。方法肺泡上皮细胞A549分为A、B、C3组,A组为对照组;B组A549细胞施加14%牵张应变,牵张时间为4h;C组细胞的牵张模式与B组相同,只是于施加牵张前用ERK的特异性抑制剂PD98059预处理A549细胞2h。分别用免疫细胞化学染色和RT-PCR检测细胞HMGB1蛋白和mRNA的表达,用Westernblotting检测ERK激酶的活性。结果A549细胞施加14%牵张应变后,HMGB1蛋白和mRNA表达明显增加,ERK激酶活性明显增高(P<0.05);该诱导激活作用可被PD98059阻断。结论机械牵张通过ERK信号通路,调节A549细胞的HMGB1基因和蛋白表达。