带有绿色荧光蛋白外源DNA转染绵羊成纤维细胞的研究

为了优化建立转染绵羊成纤维细胞系的外源基因转染体系,本研究利用带有绿色荧光蛋白（GFP）的外源基因,采用阳离子脂质体法,探讨了DNA用量、脂质体用量和转染时间等因素对转染绵羊成纤维细胞的影响。结果表明,在500μL转染培养基中成纤维细胞达到85%汇合时,添加由50μL DMEM中含有0.2μg DNA和50μL DMEM中含有2.0μL Lipo-fectamineTM2000的两种溶液混合构成的转染液并转染12 h,可获得最高的转染效率。当转染12 h后,用基础培养液培养至第24小时,细胞核周区出现强绿色荧光,而当转染后48～64 h观察时,细胞核周区的荧光强度明显弱,而远离核周区的胞质中的荧光强度增加。

胶质瘤U251细胞外源基因瞬时转染方法的选择

目的选择一种将外源基因瞬时转入胶质瘤细胞的高效转染方法。方法以去内毒素真核表达载体DsRed2为外源基因,分别采用脂质体Lipofectamine2000转染法、脂质体Viafect转染法以及电转染法,将不同浓度的DsRed2质粒(0.25、0.5、1.0μg)转染入胶质瘤U251细胞(以下称胶质瘤细胞,细胞数量均为1.0×105个)。荧光显微镜下采用可见光、红色荧光滤镜观察细胞形态及红色荧光蛋白表达,紫外光滤镜下观察细胞核Hocest33342染色情况,计算转染效率。结果三种方法均能将质粒转染至胶质瘤细胞中,红色荧光蛋白表达效果均良好。转染后的细胞形态基本正常,但表达红色荧光蛋白与未表达红色荧光蛋白的细胞形态差异较大。相同质粒浓度下,电转染法转染后表达红色荧光蛋白的细胞数量多于脂质体Lipofectamine2000转染法、脂质体Viafect转染法。随着质粒浓度的升高,脂质体Viafect转染法和电转染法对胶质瘤细胞的转染效率逐渐升高。相同质粒浓度下,电转染法对胶质瘤细胞的转染效率均高于脂质体Lipofectamine2000转染法和脂质体Viafect转染法(P均<0.01)。结论电转染法对外源基因瞬时转染胶质瘤细胞的转染效率较高,并呈质粒浓度依赖性。

脂质体介导质粒DNA法转染藏鸡成纤维细胞的研究

采用Lipofectin阳离子脂质体介导质粒DNA转染藏鸡成纤维细胞，通过优化重组质粒转染细胞的各种参数以寻求最佳的转染条件。结果表明：6孔培养板中细胞汇合度迭70％～80％时，用2μL脂质体介导1．5μg重组质粒转染10h即可获得较满意的转染效率。说明Lipofectin能有效介导质粒pEGFP-N3转染藏鸡成纤维细胞，转染率与细胞生长汇合程度、脂质体包被质粒的浓度比例及转染时间直接相关。

不同转染方法应用于体细胞转基因效率的研究

试验旨在比较不同转染方法介导绿色荧光蛋白(EGFP)基因转染猪不同体细胞的效果。原代分离培养来源于猪脂肪和骨髓的两种间充质干细及成纤维细胞,含有EGFP的质粒分别通过脂质体、罗氏转染试剂和电穿孔法转入猪3种体细胞中,使用倒置荧光显微镜观察EGFP的表达,并通过血细胞计数法分析细胞相对存活率,流式细胞仪检测细胞转染效率。结果表明,3种方法转染不同体细胞48 h均有绿色荧光蛋白的表达。在不同方法转染相同体细胞的比较中,细胞存活率从高到低依次为罗氏转染试剂>脂质体>电穿孔法,罗氏转染试剂和脂质体转染后的细胞存活率显著高于电穿孔法(P<0.05),转染效率从高到低依次为电穿孔法>罗氏转染试剂>脂质体,电穿孔法的转染效率明显高于罗氏和脂质体转染试剂,同时罗氏转染试剂的转染效率显著高于脂质体(P<0.05)。采用相同方法转染不同体细胞的比较中,3种体细胞在相同方法转染后的存活率无显著性差异(P>0.05),电穿孔法转染间充质干细胞的效率均显著高于成纤维细胞(P<0.05);罗氏转染试剂和脂质体分别转染3种体细胞的效率无显著性差异(P>0.05)。3种方法均可用于转染猪体细胞,综合考虑转染效率和细胞存活率,电穿孔法的转染效果最好,可用于转染细胞状态较佳的细胞,其次为罗氏转染试剂。

用DNA转染法研究小菜蛾颗粒体病毒在草地贪夜蛾细胞内复制

采用钙一磷沉淀技术将小菜蛾颗粒体病毒DNA转染草地贪夜蛾细胞,经转染120小时后的病变细胞核膨大,核内可见病毒粒子。回收转染5天后的细胞悬液,经破细胞处理,添食感染2龄小菜蛾幼虫,患病幼虫为典型颗粒体病毒病症状,感染率为37.8%。

阳离子脂质体介导的外源基因转染小鼠脾细胞的方法学探讨

【目的】探讨高效阳离子脂质体介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的方法。【方法】用新型阳离子脂质体DOSPER包裹携带lacZ报告基因的质粒 pCAGGS lacZ按 3种方法转染小鼠脾细胞 ,①常规方法直接转染 ;②脾细胞经刀豆球蛋白A(ConA)活化后再按常规方法转染 ;③用黏附辅助脂质体法 (adhesion assistedlipofection ,AAL)转染脾细胞。转染效率用X gal染色法测定。【结果】上述 3种方法的转染效率依次为 <0 0 10 ,0 0 5 7及 0 199,经方差分析 ,3种方法转染效率的差异有显著性 (P <0 0 1,n =3)。【结论】AAL法介导外源基因转染体外生长的小鼠脾细胞的转染效率最高。

脂质体载体法将外源性野生型p53转染SHG_(44)细胞及验证

目的验证脂质体法将wtp53有效转染SHG44细胞。方法G418筛选,DNA分子班点杂交。结果用脂质体法将wtp53质粒转染SHG44细胞,G418筛选,24d形成新生细胞克隆,呈集落状;以wtp53cDNA为探针进行斑点杂交,放射自显影,wtp53pLXSN/SHG44细胞为阳性杂交信号,而亲代SHG44细胞及转染pLXSN的SHG44细胞为阴性信号,说明wtp53基因已成功地转导入SHG44细胞中。结论斑点分子杂交显示,基因转染成功,初步证实脂质体介导法能有效地将外源性p53基因转导入SHG44细胞。

脂质体介导外源基因体外转染牛胎儿成纤维细胞条件的优化

通过脂质体(FuGENE-6)介导,将真核表达载体pEGFP-C1成功导入体外培养的牛胎儿成纤维细胞,探讨影响外源基因转染效率的参数,如DNA和脂质体的用量、转染的细胞数量以及细胞暴露于DNA与脂质体复合物的时间长度。通过实验发现,绿色荧光蛋白(greenfluorescentprotein,GFP)基因的表达随DNA、脂质体量的增加而增加,延长细胞暴露时间反而使转染效率下降,转染细胞数适当才能得到较高的转化率。

药物诱导与耐药基因转染两种方法建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的比较

目的比较药物诱导和耐药基因转染两种方法所建立的人食管癌顺铂耐药细胞系的不同特点。方法顺铂(cDDP)中等浓度、间歇作用法历时9个月建立食管癌耐药细胞系Ec9706/cDDP;同时采用脂质体转染法将人野生型DNA聚合酶β(polβ)的重组绿色荧光蛋白表达载体pEGFP-AC3转染入食管癌细胞Ec9706,经G418筛选得到稳定转染细胞系Ec9706-AC3。荧光显微镜观察转染效果,普通倒置显微镜观察细胞形态变化。绘制生长曲线,计算群体倍增时间。RT-PCR方法检测细胞中polβmRNA的表达水平,MTT法测细胞对顺铂的敏感性,并观察冻存复苏、撤药培养对耐药性的影响。结果两种方法所获耐药细胞与亲本细胞相比形态无明显变化,polβmRNA表达均增加。Ec9706/cDDP耐药指数为15.70±1.16,冻存复苏对耐药指数影响不大,而撤药培养可使耐药性降低,细胞群体倍增时间延长;Ec9706-AC3细胞耐药指数为1.78±0.67,不受冻存复苏、撤药培养的影响,细胞群体倍增时间不变。结论用不同方法成功建立两种人食管癌顺铂耐药细胞,不同方法获得的耐药细胞生物学特性有所不同。

HBV DNA重组质粒转染小鼠卵母细胞的研究

背景与目的:乙型肝炎是危害人类健康的全球性疾病。为了探索乙肝病毒通过卵母细胞垂直传递的可能性,对HBV DNA重组质粒能否转染小鼠卵母细胞进行了研究。 材料与方法:将小鼠卵母细胞与pBR322-HBV DNA重组质粒进行共培养后,分别提取卵母细胞DNA及制备小鼠卵母细胞中期染色体。用PCR、Southern、斑点杂交及FISH技术证实HBV DNA能否转染小鼠卵母细胞。结果:PCR试验在受检样本中观察到HBV DNA阳性条带。Southern试验在受检PCR产物中观察到明显的阳性杂交信号。用每次实验的最后3次洗液进行斑点杂交未发现HBV DNA阳性信号,排除了PCR和Southern阳性结果来自洗液污染的可能性。荧光原位杂交在1000个卵母细胞中的36个中期相内发现HBV DNA杂交信号。结论:HBV DNA序列能够通过卵母细胞的透明带和细胞膜,进入卵母细胞内并整合到卵母细胞染色体上。此类卵母细胞与正常精子受精时,有可能作为载体将HBVDNA带进胚胎。

精子干细胞转染法制备转基因兔的研究

采用直接注射的方法 ,将脂质体包裹的含人乳铁蛋白基因重组质粒 pLNCXHLF注入兔睾丸组织中 ,一个月后与正常雌兔交配。所产仔兔经PCR、Southern检测证明获得了转基因兔 ,转基因阳性率平均为 35 %。实验结果表明 ,通过注射可将外源基因导入到曲细精管中 ,进而完成对精子干细胞的转染 ,获得携带外源基因的成熟精子 ,受精后可得到转基因动物。该方法是一种简捷、有效的新途径 ,既节省时间又降低了成本 ,为利用精子载体制备转基因动物的研究提供了很有价值的参考。

治疗型HBV DNA疫苗肌注电转染法免疫恒河猴的效果及安全性观察

为观察肌注 电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗对恒河猴的免疫效果 ,对健康恒河猴采用肌注 电转染法接种治疗型HBVDNA疫苗 ,剂量分别为 0 2mg/只、1mg/只和 2mg/只 ;前 3次给药时间间隔 1个月 ,主要观察免疫效果 ;此后 6次给药为每天 1次 ,观察重复给药的安全性。结果显示肌注 电转染法接种疫苗后 ,不同剂量组均可有效诱导恒河猴产生HBsAg特异性抗体 (抗 HBs) ;重复给药未见明显的各系统毒副反应及血液学和血生化异常 ,血清抗核抗体 (ANA)阴性。表明治疗型HBVDNA疫苗用肌注 电转染法免疫可显著增强恒河猴的免疫效果 ;多次重复接种该疫苗未见恒河猴的毒性反应 。

PEG化壳聚糖/DNA自组装复合物的制备、表征和体外Hela细胞转染研究

通过有机合成和高分子聚合等方法将亲水性的聚乙二醇接枝到壳聚糖的氨基侧链上 ,得到了改性的壳聚糖 -聚乙二醇接枝共聚物 ,应用现代波谱等技术对中间产物和最终产物进行了表征 .采用绿色荧光蛋白基因质粒 p EGFP-N1为 DNA模型 ,在溶液中通过自动 (静电 )吸附得到 PEG化的壳聚糖 /DNA自组装复合物 .初步研究了该自组装复合物对 Hela细胞的体外转染效率 .结果表明 ,活化的聚乙二醇被成功地接枝到壳聚糖上 ,使不溶于水的壳聚糖改性为水溶性的 PEG化的壳聚糖 . PEG化壳聚糖 /DNA自组装复合物在Hela细胞体外转染率达到 81 % .因此 ,PEG化的壳聚糖有可能成为基因转染的非病毒载体 .

山羊精子介导转染外源DNA的研究

目的:建立山羊精子介导转染外源DNA的方法,并探索精液离心与否与添加异种精清对转染效率的影响.方法:将采集的山羊精液经过离心处理与标记的线形化pEGFP-N1质粒共育转染,分别用免疫组化的方法检测转染效率、PCR和Southern blotting检测转染外源DNA在精子的结合部位和结合率;同时将实验分为3组,分别为鲜精直接转染、离心后转染和离心山羊精液添加猪精清转染,用免疫组化方法检测转染外源DNA效率.结果:精子核后帽区是结合转染外源DNA的主要部位;3种处理的阳性转染率分别为(26.19±3.25)%、(62.04±7.87)%和(17.04±9.34)%;DNaseⅠ消化后的阳性转染率分别为(11.50±5.05)%、(34.00±5.87)%和(10.00±4.24)%.离心组与未离心组和添加猪精清组差异极显著(p<0.01).结论:山羊精子具有自发性结合外源DNA的能力;羊精清和异种精清明显降低精子结合外源基因的效率.

脂质化可改善外源DNA转染鸡精子细胞效率

印度中央家禽研究所研究人员将鸡精子细胞和3种外源DNA,完整的线性pVIVO2-GFP/LacZ载体（9620bp）、LacZ基因（5317bp）和GFP基因（2152bp）共孵育,使外源DNA转染精子细胞。PCR试验、DotBlot和Southern杂交试验显示,鸡精子细胞成功内化外源DNA。

3种脂质体介导法转染大鼠小胶质细胞的比较研究

目的以LipofectamineTM2000为对照,研究GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ在大鼠小胶质细胞中的转染效率及毒性。方法分别采用LipofectamineTM2000、GenEscortTMⅠ和GenEscortTMⅢ为载体,转染绿色荧光蛋白(GFP)标记的siRNA进入大鼠小胶质细胞。计算转染效率。采用磺基罗丹明B法(SRB)分析转染试剂对细胞的毒性,并研究细胞传代次数、接种密度、脂质体与siRNA的比例及脂质体-siRNA复合物形成时间等对脂质体转染效率的影响。结果 2～3次细胞传代,接种密度为1×105(24孔板)、脂质体与siRNA比例为1∶2.5、脂质体-siRNA复合物形成时间分别为30 min或15 min,转染效率最高。3种不同脂质体介导的GFP-siRNA转染的大鼠小胶质细胞内均有GFP表达,其最佳转染比例下转染效率比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01);3种转染剂的细胞毒性比较为LipofectamineTM2000组>GenEscortTMⅠ组>GenEscortTMⅢ组(P<0.01)。结论阳离子脂质体GenEscortTMⅠ比LipofectamineTM2000细胞毒性低,转染效率可,是一种更为理想的小胶质细胞基因转染载体。

不同处理对山羊精子转染外源DNA效率的影响

将采集的山羊精液去除精清,分为鲜精组、冻精组、反复冻融致死组3组进行处理后,与地高辛标记的线性化PCS2EGFP质粒共育转染,用免疫组化的方法检测精子转染外源DNA的效率.结果显示鲜精、冻精和反复冻融致死3种处理组的阳性转染效率分别为(36.61±7.91)%,(32.68±3.38)%,(69.36±4.79)%.反复冻融致死组转染率极显著高于鲜精组和冻精组(p<0.01),鲜精组和冻精组转染效率差异不显著(p>0.05).

磷酸钙法转染瘤细胞效率的优化

为了探索磷酸钙法转染瘤细胞的最佳转染条件,以磷酸钙法将ANXA2特异性重组干扰质粒pU6H1-GFP-siANXA2导入人肝癌细胞SMMC-7721并优化了以下转染参数：转染前细胞汇合率、质粒剂量、质粒复合物形成时间、孵育时间、血清、抗生素有无及细胞传代次数等.以荧光显微镜观察GFP表达、半定量RT-PCR和western blotting评估转染效率.结果显示,转染前细胞50%~60%汇合率、8μg质粒用量（直径30 mm培养皿）、20~30 min沉淀形成时间及6 h孵育时间转染效率较高;细胞传代次数及抗生素有无对转染效率影响不显著,但血清在实验条件下是必不可少的.转染48 h后,GFP表达进入高峰期、ANXA2 mRNA和蛋白水平下调（P〈0.05）.

影响小鼠体细胞脂质体法转染效率的因素

本实验主要研究脂质体量、质粒量、细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间、细胞传代次数以及细胞种类对转基因效率的影响.首先研究了脂质体量、质粒量和细胞在脂质体-质粒复合物中暴露时间对小鼠胎儿成纤维细胞(MFFC)的绿色荧光蛋白(GFP)转染效率的影响.结果表明,在本实验条件下,用传至3代的MFFC,24孔培养板中每孔接种4-10×104个细胞,70%-90%贴满程度,当脂质体(LipofectAMINE)4μg、质粒(pEGFP-N1)0.3μg,复合物作用时间为6h时获得的转染效率最高,为30.7%.用此方案比较不同传代次数的MFFC转染效率结果表明,原代细胞的转染效率为10.0%,3代为28.9%,到15代降到7.2%.说明随着传代次数的增加,转染效率逐渐降低.将MFFC、小鼠输卵管上皮细胞(MOEC)和小鼠颗粒细胞(MGC)分别传至3代,采用上述方案进行转染,转染效率分别是27.8%、13.7%和14.2%.可见不同种类细胞的转染效率不同.细胞周期检测表明,无论是不同代次的细胞还是不同种类的细胞,其转染效率高低与M期所占比例的多少有关.这为如何提高转染效率提供了有利的依据.