白藜芦醇激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白促进小鼠MC3T3-E1细胞增殖

背景:细胞外信号调节激酶5信号蛋白对生物体的存活不可或缺,白藜芦醇能通过多种途径促进成骨细胞增殖,但其是否能通过细胞外信号调节激酶5信号蛋白调控成骨细胞功能还需进一步验证。目的:探究细胞外信号调节激酶5对MC3T3-E1细胞增殖以及相关分泌蛋白的调控作用,进一步验证白藜芦醇通过激活细胞外信号调节激酶5完成上述过程。方法:小鼠MC3T3-E1前成骨细胞分别用完全培养基、XMD8-92(细胞外信号调节激酶5抑制剂)、表皮生长因子(细胞外信号调节激酶5激活剂)和白藜芦醇单独干预及XMD8-92+表皮生长因子、白藜芦醇+XMD8-92干预后,通过Western blot检测各组细胞内细胞外信号调节激酶5、磷酸化细胞外信号调节激酶5蛋白,增殖相关蛋白Cyclin D1、CDK4、PCNA,以及成骨细胞分泌蛋白骨保护素、核因子κB受体活化因子配体的表达情况,使用细胞免疫荧光染色检测各组细胞外信号调节激酶5、骨保护素和核因子κB受体活化因子配体荧光强度,使用EdU染色检测各组细胞增殖情况。白藜芦醇干预MC3T3-E1细胞的适宜浓度及时间由细胞形态学观察和CCK-8实验确定。结果与结论:①细胞外信号调节激酶5信号蛋白的激活能有效促进MC3T3-E1细胞增殖、上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值;②白藜芦醇干预MC3T3-E1细胞的适宜浓度及时间为5μmol/L,24 h;③白藜芦醇可以激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白,进而促进成骨细胞增殖,并上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值;④研究结果表明,白藜芦醇可以通过激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白促进MC3T3-E1细胞增殖,并通过激活细胞外信号调节激酶5信号蛋白上调骨保护素/核因子κB受体活化因子配体比值。

温阳振衰颗粒对阿霉素诱导慢性心衰兔心肌细胞外信号调节激酶5表达的影响

目的观察温阳振衰颗粒对阿霉素诱导慢性心衰模型兔心肌细胞外信号调节激酶5表达的影响。方法健康新西兰兔60只,随机抽取15只为正常对照组,余45只兔耳缘静脉注射阿霉素4周后,先从中随机抽取13只为模型4周组,余下实验兔按心功能分层,随机分组,再随机分为模型8周组及各治疗组,各组用对应药物灌胃,连续4周。分别检测4、8周末兔心肌细胞外信号调节激酶5(ERK5)的总蛋白及蛋白磷酸化(P-ERK5)水平。结果阿霉素造模后,模型4、8周组心肌P-ERK5水平均下调,两者较正常对照组差异有统计学意义(P<0.05),且模型8周组较模型4周组下调更为明显(P<0.05);各组经药物干预4周后心肌P-ERK5水平较正常对照组仍明显下调(P<0.05),但均高于模型8周组(P<0.05),其中以阳性对照组和温阳高剂量组心肌P-ERK5水平升高最为明显(P<0.05);各组心肌ERK5水平相比差异无统计学意义。结论温阳振衰颗粒能上调ERK5蛋白磷酸化的水平,从而激活ERK5信号转导通路,其中以高剂量温阳振衰颗粒最为明显,这可能是其调控慢性心衰时心室重构和心肌细胞凋亡的重要机制之一。

细胞外信号调节蛋白激酶5/凋亡调节蛋白信号途径在低温诱导心肌细胞损伤及凋亡中的调控作用

目的:探讨低温刺激诱导心肌细胞损伤及凋亡,以及细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)/凋亡调节蛋白Bim途径的调控作用。方法:基于乳鼠原代心肌细胞,低温培养箱施加低温刺激;使用特异性小干扰RNA(siRNA)下调ERK5或Bim的表达;细胞凋亡使用流式细胞仪检测;各蛋白表达水平通过Western blot检测;细胞内钙离子、活性氧簇(ROS)水平、线粒体膜电位(ΔΨm)通过荧光标记及流式细胞仪检测。结果:在低温刺激下的心肌细胞中,ERK5 siRNA可加剧Bim蛋白表达;Bim siRNA不影响ERK5,但减轻p-ERK5表达;ERK5 siRNA导致更高的细胞凋亡率,Bim siRNA则可减弱ERK5 siRNA的促凋亡作用;ERK5 siRNA加重了细胞内钙离子超载、ROS激活、线粒体膜电位破坏,Bim siRNA则可对抗上述损伤性作用。结论:在低温干预下的心肌细胞中,下调ERK5可释放对Bim的表达抑制,加重凋亡、细胞内钙离子超载、ROS爆发,造成更严重的线粒体膜电位破坏,而下调Bim则产生反向的保护作用。结果显示ERK5/Bim途径在低温诱导心肌细胞损伤中的重要调控作用。

拮抗触液核细胞外信号调节蛋白激酶5对吗啡依赖大鼠戒断行为的影响

目的探讨触液核磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶5（ERK5）在吗啡依赖大鼠戒断行为中的作用。方法成年♂sD大鼠48只，体质量230-270g，采用随机数字法，将大鼠随机分为两组（n=24）：吗啡-纳洛酮-DMSO组（A组）和吗啡-纳洛酮-BIX02188组（B组）。采用剂量递增法皮下注射吗啡以建立大鼠吗啡依赖模型，d 6上午经腹腔注射纳洛酮，催促戒断症状出现，即建立吗啡戒断模型。采用行为药理学方法结合免疫荧光技术，侧脑室内注射ERK5特异性抑制剂BIX02188，观察其对吗啡依赖大鼠戒断行为、戒断所致痛觉过敏及触液核p-ERK5表达的影响。结果与吗啡-纳洛酮-DMSO组相比，吗啡一纳洛酮．BIX02188组大鼠跳跃、咬牙、湿狗样抖动、腹泻及体重减轻等戒断症状明显缓解（P〈0．05），而扭体、流涎无改善（P〉0．05）；戒断所致痛觉过敏明显减轻（P〈0．05）。与吗啡一纳洛酮-DMSO组相比，吗啡一纳洛酮-BIX02188组大鼠触液核p-ERK5阳性神经元数量明显减少（P〈0．05）。结论拮抗触液核ERK5可减轻吗啡依赖大鼠戒断症状，提示触液核ERK5参与吗啡依赖大鼠戒断症状的表达。

不同胎龄胎儿皮肤和增生性瘢痕中细胞外信号调节激酶5及其mapkk基因表达的变化

目的:探讨细胞外信号调节激酶5(extracellular-signal regulated protein kinase 5,erk5)及其上游信号分子 mapkk(mek5)在不同胎龄的胎儿皮肤和不同形成时期的增生性瘢痕中的基因表达变化规律及其可能的生物学意义。方法:用病理学技术检测不同发育时期的皮肤和增生性瘢痕的结构特征后,提取18例不同胎龄(13～32周)的胎儿皮肤、6例少儿皮肤、16例不同发生时期的增生性瘢痕(4个月-11年)和8例正常皮肤组织的总 RNA 后,分离 mRNA,用 RT-PCR 方法检测这2种基因在不同组织中的表达变化特征。结果:erk5和 mek5基因在不同发育阶段的皮肤和增生性瘢痕中都有表达。在早期妊娠胎儿的皮肤中,这2种基因表达较强,随着胎龄的增加,基因表达水平逐渐降低,在少儿皮肤组织中,这两种基因的转录本含量明显减少(P<0.05)。在正常皮肤和不同形成时期的增生性瘢痕中,mek5基因表达水平相近,相互间差异不显著,而 erk5基因在正常皮肤中的表达水平较低,在增殖期和成熟期增生性瘢痕中表达水平明显增强(P<0.01)。结论:erk5与mek5基因在不同发育时期的皮肤组织内都有表达,显示 erk5介导的信号通路可能对皮肤的发生、结构功能的维持以及伤后修复十分重要。在早期妊娠胎儿皮肤中 erk5和 mek5基因的高表达可能是胎儿皮肤组织细胞快速增殖,创面无瘢痕愈合的机制之一,而增生性瘢痕发生和形成也可能与 erks基因表达增强有关。

细胞外信号调节激酶5信号转导通道研究的最新进展

作为一个开放系统,细胞具有极其复杂的生命活动,而这些生命活动又受细胞本身严密的调控机制所调节。为了与细胞外的环境和其他细胞之间进行信息交流,生物体在长期的自然选择和进化发展当中逐渐形成了一个复杂的信号转导网络。促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activatedprotein kinases,MAPK）链是自然界生物体内普遍存在的信号转导系统之一,它在细胞的生存、增殖、分化和凋亡等生命活动周期的调控中发挥着极其重要的作用。真核细胞的MAPK信号转导通路可分为4个亚族：

大鼠脊髓小胶质细胞细胞外信号调节蛋白激酶5/核因子κB信号通路在神经病理性疼痛中的作用

目的探讨脊髓细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)信号通路在炎性痛中的作用。方法 24只Sprague-Dawley大鼠随机分入两组,脊神经结扎(SNL)组大鼠行L5SNL建立神经病理性疼痛模型,假手术(Sham)组大鼠仅暴露脊神经不结扎,观察两组大鼠脊髓磷酸化ERK5(p-ERK5)的表达情况。另取大鼠随机分别鞘内注射ERK5反义寡核苷酸(AS组)、ERK5错义寡核苷酸(MM组)和0.9%氯化钠溶液(NS组),观察对SNL术后大鼠机械缩足反射阈值(PWMT)、热缩足反射潜伏期(PWTL)及核因子κB(NF-κB)的影响。结果术后1、3d,SNL组的p-ERK5阳性细胞数量均显著高于术前(P值均<0.05),Sham组的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。术前AS组、MM组、NS组间大鼠脊髓NF-κB含量、PWTL、PWMT的差异均无统计学意义(P值均>0.05)。SNL术后1dAS组大鼠脊髓NF-κB含量显著低于NS组、MM组(P值均<0.05),但3组均显著高于同组术前(P值均<0.05)。SNL术后1、3d3组的PWTL和PWMT均显著低于同组术前(P值均<0.05),AS组均显著高于MM组同时间点(P值均<0.05)。结论脊髓小胶质细胞ERK5参与了神经病理性疼痛的信号转导过程,其部分作用是通过激活转录因子NF-κB实现的。

细胞外信号调节激酶激酶5在肝癌细胞株中的异常表达及其临床意义

目的:分析细胞外信号调节激酶激酶5(MEK5)在肝癌细胞株中的表达水平及其临床意义。方法:使用实时荧光定量PCR和蛋白印迹法等方法,分别检测肝癌细胞株(HepG2、Huh7)和正常肝细胞株(LO2)中的MEK5表达水平;shRNA转染肝癌细胞致MEK5基因沉默后,检测其对MEK5蛋白表达和细胞增值率的影响。通过t检验对各组进行评估。结果:与MEK5在正常肝细胞株中的蛋白表达(0.8765±0.0031)相比,MEK5在肝癌细胞株中过度表达(HepG2:1.7206±0.0031;HuH7:1.1676±0.0053,P<0.01);与MEK5在非特异性shRNA转染的细胞株中的蛋白表达(HepG2:1.5508±0.0029;HuH7:1.2167±0.0033)相比,MEK5特异性shRNA转染后细胞株中的蛋白表达(HepG2:0.5339±0.0031;HuH7:0.4639±0.0013)受到显著抑制(P<0.01)。结论:MEK5在肝癌细胞中过度表达;抑制MEK5的表达后,肝癌细胞生长也受到抑制。

痹肿消汤干预胶原诱导关节炎模型大鼠关节滑膜组织细胞外信号调节激酶1/2及细胞外信号调节激酶5的表达

背景:滑膜细胞信号转导异常是类风湿性关节炎的重要发病机制之一。中药复方痹肿消汤治疗类风湿性关节炎具有较好的临床疗效,但在细胞信号转导水平探讨痹肿消汤治疗类风湿性关节炎的作用机制是十分必要的。目的:观察中药复方痹肿消汤对胶原诱导关节炎模型大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5表达的影响。方法:SD大鼠45只随机数字表法分为对照组、模型组、痹肿消汤组。胶原诱导关节炎模型大鼠,用痹肿消汤药液3.0～3.5mL灌胃,1次/d,连续14d。检测造模后第14,21,28天大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5的磷酸化水平。结果与结论:造模后,大鼠滑膜细胞外信号调节激酶1/2,5的磷酸化表达随时间而增加(P<0.05)。痹肿消汤治疗后,细胞外信号调节激酶1/2,5磷酸化表达水平则明显下降(P<0.05)。提示痹肿消汤能抑制细胞外信号调节激酶1/2,5蛋白激酶的激活,从而抑制细胞外信号调节激酶1/2,5信号转导通路的活化,这可能是其阻抑类风湿性关节炎滑膜异常增殖、关节骨质侵蚀的重要机制之一。

BMSCs外泌体miR-181通过靶向调控ERK5促进股骨骨折小鼠的成骨分化

目的:探讨BMSCs外泌体(BMSCs-Exos)对其体外成骨分化的调控作用,以及miR-181通过靶向ERK5实现的机制,并研究BMSCs-Exos和过表达miR-181对小鼠股骨骨折愈合的影响。方法:通过动态光散射(DLS)技术和Western blot法表征BMSCs-Exos,qRT-PCR和Western blot检测miR-181和ERK5表达,双荧光素酶报告基因实验验证miR-181对ERK5的调控。使用Western blot和ELISA检测蛋白表达和ALP活性。在小鼠股骨骨折模型中注射miR-181 mimic或BMSCs-Exos,通过骨痂体积(CV)、骨体积分数(BV/TV)和相关蛋白评估骨折愈合效果。结果:BMSCs-Exos的粒径范围为50~150nm,Zeta电势为-25.69±2.88mV,表面标志物CD9、CD63、CD81显著表达。BMSCs-Exos组中miR-181表达上调(P<0.05),ERK5表达下调(P<0.05);mimic上调了miR-181表达并降低ERK5蛋白表达(P<0.05)。BMSCs-Exos转运miR-181通过靶向调控ERK5促进BMSCs体外成骨分化(P<0.05),且BMSCs-Exos和过表达miR-181均促进小鼠股骨骨折愈合(P<0.05)。结论:BMSCs-Exos通过转运miR-181、靶向调控ERK5促进BMSCs体外成骨分化,并有助于小鼠股骨骨折愈合。

促凋亡蛋白Bad和细胞外调节蛋白激酶对膀胱癌多重耐药细胞的作用机制研究

目的检测人膀胱癌耐药细胞T24/Ifex和亲本细胞T24中细胞外调节蛋白激酶(ERK)1、ERK2、ERK5和Bad的表达,探讨其对膀胱癌细胞多药耐药(MDR)的影响。方法人膀胱癌耐药细胞株T24/Ifex用小剂量缓慢诱导法诱导;CCK-8法检测T24/Ifex对多种化疗药物的敏感性;Western blot检测MRP-1、P-gp、ERK1、ERK2、ERK5和Bad蛋白的表达;荧光定量PCR检测Bad m RNA的表达。结果成功建立膀胱癌耐药细胞株T24/Ifex,其对Ifex、DOC和CDDP的耐药指数分别为7.359、3.892和4.297,且高表达MRP-1和P-gp蛋白。与亲本细胞T24比较,T24/Ifex中ERK1、ERK2和ERK5的表达升高,ERK1蛋白磷酸化水平无显著变化,ERK2磷酸化水平下降,且p-ERK1/2与ERK1/2的比值下降。Bad的m RNA和蛋白表达下降。结论 ERKs和Bcl-2家族促凋亡蛋白Bad表达与人膀胱癌MDR的发生密切相关。

苦参碱对骨肉瘤细胞凋亡的影响

目的探讨苦参碱在MG-63细胞中促凋亡的作用及机制。方法实验分为0浓度组和10%苦参碱组,分别灌胃生理盐水和10%苦参碱制备大鼠含药血清,干预人成骨肉瘤细胞株MG-63。采用CCK-8法检测细胞增殖,流式细胞术检测细胞凋亡,荧光定量聚合酶链式反应(PCR)检测c-myc、胱天蛋白酶9(caspase-9)基因的表达,采用免疫印迹(Western blot)法检测细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路中相关蛋白Nur77、丝裂原激活蛋白激酶5(MEK5)及凋亡相关蛋白c-myc,caspase-9的表达水平。结果与0浓度组相比,10%苦参碱组能显著抑制MG-63细胞增殖,并促进其凋亡;荧光定量PCR实验结果表明,10%苦参碱组能抑制c-myc转录,并促进caspase-9转录;Western blot实验结果表明,在ERK5信号通路中,10%苦参碱组Nur77、MEK5及c-myc蛋白表达下调,而caspase-9蛋白表达上调。结论苦参碱可能通过干扰ERK5信号通路,调控c-myc,caspase-9等蛋白的表达,从而抑制MG-63细胞增殖,并促进其凋亡。

BMPs-ERK5信号通路调控人牙周膜干细胞成骨分化的研究

目的比较骨形态发生蛋白(bone morphogenetic proteins,BMP)2、7、9对人牙周膜干细胞﹙human periodontal ligament stem cells,h PDLSCs﹚成骨分化的诱导作用,探讨BMPs-ERK5信号通路在成骨分化中的作用。方法首先采用组织块酶消化法分离培养原代h PDLSCs并鉴定,利用腺病毒载体介导的GFP、BMP2、BMP7和BMP9(Ad-GFP、Ad-BMP2、Ad-BMP7、Ad-BMP9)分别感染h PDLSCs,通过早期成骨分化指标碱性磷酸酶活性定性和定量检测、茜素红染色检测晚期成骨分化指标钙盐结节沉积情况、qRT-PCR检测细胞成骨分化相关基因骨钙蛋白和骨桥蛋白mRNA表达,比较发现BMP9对细胞成骨分化的作用最强;采用Ad-BMP9感染h PDLSCs 24 h后,检测BMP9作用PDLSCs后对ERK5磷酸化水平的影响和ERK5信号通路特异性抑制剂BIX02189预处理后BMP9-ERK5通路对h PDLSCs成骨分化的影响。结果 1分离培养的h PDLSCs为成纤维细胞样,呈漩涡状生长,抗波形蛋白表达阳性,抗角蛋白表达阴性,具有间充质属性和克隆形成能力。2BMP2、BMP7和BMP9均有促进细胞成骨分化作用,其中3组的碱性磷酸酶定量结果和成骨分化相关基因相对表达量与GFP组比较,差异具有统计学意义(P<0.05),且BMP9效力最强。3Western blot检测显示BMP9增强p-ERK5的表达。而抑制剂BIX02189呈剂量依赖性地抑制p-ERK5的表达。BIX02189预处理细胞后、感染Ad-BMP9的结果显示,BMP9对细胞的促成骨作用较未处理组明显降低,其中BMP9组的碱性磷酸酶定量分析结果与成骨分化相关基因相对表达量与BIX02189处理组比较,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论 BMP9具有较强的促h PDLSCs成骨分化作用,ERK5信号转导途径在BMP9诱导h PDLSCs成骨分化过程中发挥了正向调节作用。

人肝癌多药耐药细胞中ERK5的表达

目的检测人肝癌多药耐药细胞(hepG2/ADM和BEL-7402/5-FU)及亲本细胞(hepG和BEL-7402)中ERK5的表达,探讨其对肝癌细胞多药耐药的影响。方法MTT法测定人肝癌多药耐药细胞株多种化疗药物的交叉耐药性,实时荧光定量PCR检测ERK5在人肝癌多药耐药细胞及亲本细胞中mRNA水平的表达,western-blotting检测ERK5蛋白水平的表达。结果hepG2/ADM对ADM、5-FU、CDDP的耐药指数分别为12.34、5.74、3.81;BEL-7402/5-FU对5-FU、VCR、OHP、MTX和ADM的耐药指数分别为15.32、10.08、5.85、6.74和3.26。与亲本细胞相比较,在hepG2/ADM细胞中ERK5mRNA和蛋白表达均升高,而在BEL-7402/5-FU细胞中ERK5mRNA表达降低,ERK5蛋白表达升高。结论ERK5的表达与人肝癌多药耐药的发生密切相关,为逆转治疗肝癌细胞多药耐药研究提供了新思路。

黄芪甲苷基于MEK5/ERK5信号通路对阿尔茨海默病大鼠小胶质细胞活性的影响

目的研究黄芪甲苷基于丝裂原激活蛋白激酶5(MEK5)/细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路对阿尔茨海默病(AD)大鼠小胶质细胞活性的影响。方法清洁级健康SD雄性大鼠60只,随机选取10只为正常组,其余50只建立AD模型,然后随机分为模型组、阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组,每组10只。阳性对照组给予石杉碱甲(0.02 mg/kg)干预,正常组和模型组分别给予等体积的0.9%NaCl溶液,黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组分别给予15 mg/kg、30 mg/kg、60 mg/kg的黄芪甲苷。各组均干预21 d,检测白介素-1(IL-1)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)水平,以及葡萄糖调节蛋白78(GRP78)、C/EBP同源蛋白(CHOP)、MEK5、ERK5表达。结果与正常组相比,模型组、阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组IL-1、TNF-α水平及GRP78、CHOP、MEK5、ERK5表达升高(P<0.05);与模型组相比,阳性对照组、黄芪甲苷低剂量组、黄芪甲苷中剂量组、黄芪甲苷高剂量组IL-1、TNF-α水平及GRP78、CHOP、MEK5、ERK5表达降低,且随剂量增加而降低(P<0.05)。结论黄芪甲苷基于MEK5/ERK5信号通路对AD大鼠小胶质细胞的活性具有抑制作用,可减少AD大鼠神经细胞的凋亡。

β-葡聚糖对巨噬细胞的增殖及ERK5通路的影响

目的:探讨β-葡聚糖对于小鼠巨噬细胞RAW 264.7的生长增殖和诱导细胞分泌肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的影响,以及细胞外信号调节激酶5(ERK5)信号通路在这一过程中的表达。方法:以不同浓度(12.5,25,50,100,200和400μg/m l)的β-葡聚糖刺激体外培养小鼠巨噬细胞系RAW 264.7细胞后,用四唑盐比色实验(MTT)检测细胞的生长增殖;瑞氏染色法检测RAW 264.7细胞的吞噬活性;用ELISA方法测定培养上清液中TNF-α的表达量;蛋白质印迹法检测ERK5及磷酸化ERK5(p-ERK5)表达情况。结果:MTT实验结果显示不同浓度的β-葡聚糖对细胞的增殖有不同程度的促进作用,其中以100μg/m l浓度时促进作用最大,大剂量时则对细胞增殖产生抑制作用。在浓度为100μg/m l时,TNF-α的表达量达到峰值,ERK5和p-ERK5被活化。结论:一定浓度的葡聚糖对小鼠巨噬细胞的增殖和吞噬有明显的促进作用,细胞外信号调节激酶5信号通路参与了这一过程。

ERK5和JNK参与BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化

目的研究细胞外信号调节激酶5(ERK5)和c-Jun N端激酶(JNK)在骨形态发生蛋白9(BMP9)诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法利用重组腺病毒将BMP9基因导入C3H10T1/2细胞,Western blot法检测加入BMP9及不同浓度ERK5特异性抑制剂BIX02189或JNK特异性抑制剂SP600125后ERK5和JNK的激活情况;实时定量PCR(qRT-PCR)检测BMP9诱导1周后心肌特异性基因肌细胞增强因子2C(MEF2C)、GATA结合蛋白4(GATA4)表达;Western blot法检测经BMP9诱导3周后心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白43(CX43)、心肌肌钙蛋白T(cTnT)表达和免疫荧光技术检测CX43、cTnT在细胞内的表达。结果在转染效率达50%左右的情况下,BMP9可过度激活ERK5和JNK,使其磷酸化水平显著增高(P<0.05);BIX02189抑制ERK5激活后,BMP9诱导的C3H10T1/2细胞的心肌分化标志物MEF2C、GATA4、CX43、cTnT均受到显著抑制(P<0.05),JNK特异性抑制剂SP600125也可抑制MEF2C、GATA4、CX43、cTnT表达,但对MEF2C及GATA4的抑制不如BIX02189显著(P<0.05)。结论 ERK5和JNK的过度激活参与了BMP9诱导的C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化。

siRNA 沉默 ERK5基因对 MC3 T3-E1成骨细胞增殖及BMP2／BMP7的影响

目的观察ERK5信号通路对MC3T3-E1成骨细胞的增殖,及功能分化蛋白BMP2/BMP7的影响。方法应用小RNA分子干扰技术(siRNA)沉默ERK5基因,分别将浓度为20、40、60、80 nmol/L的ERK5 siRNA干预MC3T3-E1成骨细胞,筛选ERK5 siRNA转染的最佳浓度。噻唑蓝实验(MTT)检测转染后12 h、24 h、36 h和48 h细胞的增殖情况,实时荧光定量PCR检测ERK5、BMP2和BMP7 mRNA的表达。Westernblot检测不同干预组BMP2及BMP7蛋白的表达变化。结果当ERK5siRNA浓度为60 nmol/L时,MC3T3-E1成骨细胞的ERK5 mRNA的表达下降最为显著,沉默率为76.8±2.2%(P<0.01)。ERK5 siRNA转染后12 h、24 h、36 h,成骨细胞的增殖受到明显抑制(P<0.05),但48 h转染组未发现明显变化(P>0.05)。ERK5 siRNA转染24 h后,实时荧光定量PCR结果显示:空白组与对照siRNA组成骨细胞的BMP2/BMP7 mRNA变化水平无显著性差异(P>0.05),但ERK5 siRNA转染组的BMP2/BMP7 mRNA明显降低(P<0.05);Westernblot结果显示,空白组与对照siRNA组成骨细胞的BMP2/BMP7蛋白未发现明显变化(P>0.05),但转染组成骨细胞的BMP2/BMP7显著降低(P<0.05)。结论 ERK5 siRNA对MC3T3-E1成骨细胞的增殖以及骨形态蛋白BMP2和BMP7的表达有明显抑制作用。

ERK5信号通路参与BMP9诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞的分化

目的:研究细胞外信号调节激酶5(extracellular signal-regulated kinase 5,ERK5)信号通路在骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)诱导C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化中的作用。方法:用AdBMP9和AdGFP转染C3H10T1/2细胞,流式细胞术检测转染效率,Western blot检测磷酸化ERK5(phosphorylation ERK5,p-ERK5)和ERK5的表达水平,免疫荧光检测p-ERK5在细胞内的表达位置;ERK5特异性抑制剂BIX02189预处理细胞再经AdBMP9诱导,Western blot检测pERK5和ERK5表达水平,RT-qPCR检测心肌特异性基因肌细胞增强因子(myocyte enhancer factor,MEF)2C、GATA结合蛋白4(GATA binding protein 4,GATA4)表达,Western blot检测心肌特异性蛋白缝隙连接蛋白43(connexin 43,CX43)、心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)表达。结果:AdGFP与AdBMP9的转染效率达50%左右,经AdBMP9诱导后的细胞p-ERK5表达明显增高(P<0.01),免疫荧光结果显示BMP9组p-ERK5表达明显增强且主要集中于胞核;15μmol/L BIX02189可完全抑制pERK5的表达(P<0.01),且明显降低了由AdBMP9诱导的C3H10T1/2细胞GATA4、MEF2C基因与CX43、cTnT蛋白表达(P=0.000)。结论:BMP9可以通过激活ERK5信号通路调控C3H10T1/2细胞向心肌样细胞分化。

ERK5信号通路介导流体剪切力对MC3T3-E1成骨细胞MMPs、TIMPs表达的影响

目的观察流体剪切力(fluid shear stress,FSS)作用下,MC3T3-E1成骨细胞中细胞基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMPs)和基质金属蛋白酶抑制剂(tissue inhibitors of metalloproteinases,TIMPs)的表达情况,并探讨ERK5信号通路在其中的作用。方法对MC3T3-E1成骨细胞进行不同的处理,分为正常组、XMD8-92组、FSS组和FSS+XMD8-92组,对FSS组施加12 dyn/cm^2流体剪切力,采用蛋白免疫印迹法分别检测P-ERK5、ERK5、MMPs和TIMPs蛋白水平的变化。结果生理强度(12 dyn/cm^2)的流体剪切力作用于MC3T3-E1成骨细胞45 min后能显著上调MMPs的表达,下调TIMPs的表达,但此效应可被ERK5高选择性抑制剂XMD8-92阻断。结论 ERK5信号通路调控流体剪切力对成骨细胞MMPs、TIMPs蛋白的表达。