蛋白酶体20S亚基β8调控丝裂原活化蛋白激酶激酶/细胞外信号调节激酶通路对肾透明细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的探究蛋白酶体20S亚基β8(PSMB8)对肾透明细胞癌(ccRCC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响,以及是否通过调控丝裂原活化蛋白激酶激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路发挥其作用。方法采用癌症基因组图谱数据库分析ccRCC与正常组织PSMB8 mRNA的表达水平,并通过实时荧光定量PCR、Western blot和免疫组织化学染色等方法进一步检测PSMB8在ccRCC组织和细胞中的表达情况。构建稳定过表达和敲减PSMB8的细胞株,分别采用CCK-8法和平板克隆实验检测细胞的增殖能力,划痕愈合实验和Transwell实验检测细胞迁移和侵袭的能力。对PSMB8共表达基因进行京都基因与基因组百科全书通路富集分析,Western blot检测MEK/ERK通路相关蛋白的磷酸化水平,并加用ERK激动剂C16-PAF处理进行细胞功能学挽救实验。结果与正常组织比较,PSMB8 mRNA和蛋白在ccRCC组织中呈高表达(P均<0.001),且与临床患者的TNM分期显著相关(P<0.001);与阴性对照组比较,过表达PSMB8可以促进786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.021,P=0.039)、迁移和侵袭(P均<0.001),敲减PSMB8可以抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.022,P=0.005)、迁移和侵袭(P均<0.001);PSMB8共表达基因通路富集分析提示其可能与丝裂原活化蛋白激酶通路相关(P<0.001);敲减PSMB8后786-O和ACHN细胞MEK1/2(P=0.017,P=0.016)、ERK1/2(P=0.010,P=0.040)蛋白磷酸化水平及ERK下游因子c-Myc(P=0.043,P=0.038)、c-Fos(P=0.025,P=0.008)和CyclinD1(P=0.006,P=0.047)转录水平均下调;与ERK激动剂C16-PAF处理组比较,敲减PSMB8+C16-PAF组明显抑制786-O、ACHN细胞的增殖(P=0.003,P=0.002)、迁移和侵袭能力(P均<0.001)。结论PSMB8通过激活MEK/ERK信号通路从而促进ccRCC细胞的增殖、迁移及侵袭。

丝裂原活化蛋白激酶/细胞外调节蛋白激酶通路在动静脉内瘘术后内膜增生部位血管组织和细胞中的表达及意义

目的探讨丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)/细胞外调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路在动静脉内瘘术后内膜增生部位血管组织中的表达及意义,初步探索抑制MAPK/ERK通路对肌成纤维细胞自噬及增殖过程的影响。方法选取2023年1月至3月期间在海南医学院第一附属医院肾内科行动静脉内瘘重建术的患者6例,观察组收集动静脉内瘘重建术患者内膜增生严重部位的静脉血管组织,对照组为重建术中需结扎的侧支正常静脉组织。术前收集患者的一般资料,超声测量拟切取部位血管内径及内膜厚度,蛋白质印迹法检测血管组织中磷酸化细胞外调节蛋白激酶(phosphorylation-extracellular regulat-ed protein kinases 1/2,p-ERK1/2)、B细胞淋巴瘤/白血病-2蛋白相互作用蛋白1(myosin-like B cell lymphoma/lewkmia-2 interacting protein1,Beclin^(-1))、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)蛋白的表达水平,并分析其与静脉内膜厚度的相关性。以肌成纤维细胞为研究对象,尿毒症血清培养,并予ERK1/2抑制剂去氢钩藤碱(Corynoxeine)干预,提取细胞总蛋白及RNA,蛋白质印迹法及实时定量PCR检测Beclin^(-1)及PCNA的表达变化。结果入组患者透析过程中均存在血流量不足,灰阶超声提示动静脉内瘘狭窄处静脉内膜明显增厚[(0.143±0.014)cm比(0.097±0.016)cm],血管腔内径为(0.166±0.028)cm。蛋白质印迹法结果显示,与正常侧支部位血管组织相比较,内膜严重增生部位血管组织中p-ERK1/2、Beclin^(-1)、PCNA蛋白的表达明显增加,差异有统计学意义(均P<0.05)。观察组静脉内膜厚度与p-ERK1/2、Beclin^(-1)、PCNA蛋白的表达水平均呈正相关(R2=0.929、0.702、0.789,均P<0.05)。在细胞模型上,与正常对照组相比较,尿毒症血清组自噬相关指标Beclin^(-1)及增殖相关指标PCNA的表达明显升高,差异有统计学意义(均P<0.05)。而加入ERK特异性抑制剂Corynoxeine后,Beclin^(-1)及PCNA的表达均明显减低,差异有统计学意义(均P<0.05)。结论MAPK/ERK通路参与了动静脉内瘘内膜增生过程,促进细胞自噬及增殖过程,抑制该通路活性,或可减低细胞自噬及增殖,从而减轻内膜增生。

过氧化物酶体膜蛋白4通过细胞外信号调节激酶1/2信号通路促进肝细胞癌细胞的上皮间质转化

目的:探讨过氧化物酶体膜蛋白4(PXMP4)对肝细胞癌(HCC)细胞迁移和侵袭及上皮间质转化(EMT)进程的影响。方法:采用生物信息学和免疫组织化学方法分析HCC组织中PXMP4的表达,分析其与患者临床病理特征的相关性。在HCCLM3和MHCC97H细胞中干扰PXMP4,在Huh7和MHCC97L细胞中过表达PXMP4,利用WB和qPCR法验证干扰/过表达效率。利用CCK-8、划痕愈合实验和Transwell侵袭实验检测干扰/过表达PXMP4对HCC细胞增殖、迁移和侵袭能力的影响,采用WB法检测干扰/过表达PXMP4或0、5、10和20μmol/L U0126处理对HCC细胞中N-cadherin、E-cadherin、vimentin、细胞外信号调节激酶(ERK)、p-ERK表达的影响。结果:生物信息学和免疫组织化学分析显示,HCC组织中PXMP4呈高表达(P<0.05)。临床病理分析发现,PXMP4的表达与肿瘤分化程度有关联(P<0.05)。在HCC细胞中,干扰PXMP4后抑制细胞增殖、侵袭和EMT进程(P<0.05);反之,过表达PXMP4后促进HCC细胞增殖、侵袭及EMT进程(P<0.05)。此外,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程,U0126处理同样能够抑制HCC细胞EMT进程。结论:PXMP4在HCC组织中呈高表达且与HCC细胞分化有关联,PXMP4通过激活ERK1/2信号通路促进HCC细胞EMT进程。

汉黄芩素调节磷脂酰肌醇3激酶/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶/核因子κB信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠辅助性T细胞17/调节性T细胞平衡的影响

目的探讨汉黄芩素(Wog)调节磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)/核因子κB(NF-κB)信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠辅助性T细胞17(Th17)/调节性T细胞(Treg)平衡的影响。方法2022年8-12月,大鼠采用随机数字表法分为Model组、低剂量Wog组(Wog-L组,50 mg/kg)、高剂量Wog组(Wog-H组,100 mg/kg)、阳性药物氨茶碱组(Ami组,2.3 mg/kg)、IGF-1(PI3K激活剂)组(1.33 mg/kg)、Wog-H+IGF-1组(100 mg/kg+1.33 mg/kg)、对照组(CK组),每组12只。除CK组外,其他组大鼠均需利用烟熏法联合气管滴注脂多糖(LPS)的方法构建COPD模型,建模成功24 h后,进行给药处理,每天1次给药,持续4周。检测呼气峰流量(PEF)、每分钟通气量(MV)、吸气峰流量(PIF);流式细胞术检测外周血中Th17/Treg;HE染色检测肺组织病理;酶联免疫吸附法检测大鼠肺组织中白细胞介素(IL)-17、IL-10水平;蛋白质印迹法检测肺组织中维甲酸相关孤核受体γt(RORγt)、叉头框蛋白P3(Foxp3)、磷酸化PI3K(p-PI3K)、磷酸化Akt(p-Akt)、磷酸化NF-κB p65(p-NF-κB p65)蛋白。结果与CK组比较,Model组大鼠PEF(12.56±0.47比8.72±0.39)、PIF(9.35±0.32比7.24±0.17)、MV(132.26±5.78比96.63±3.28)、Treg(31.18±2.62比15.52±1.01)比例、IL-10(23.35±1.16比8.85±0.27)明显降低(均P<0.05);Th17(3.14±0.13比18.86±1.67)比例、Th17/Treg(0.10±0.01比1.22±0.11)、肺泡间隔(33.36±1.48比49.78±1.73)、气道炎症评分(0比4.56±0.23)及IL-17(75.83±3.60比185.56±8.62)水平明显升高(均P<0.05)。与Model组比较,Wog-L组、Wog-H组PEF(9.66±0.40,11.49±0.51)、PIF(8.28±0.19,9.03±0.22)、MV(105.54±4.11,126.67±5.72)、Treg(19.93±1.18,27.73±2.05)比例、IL-10(11.56±0.33,20.72±0.59)水平明显升高(均P<0.05);Th17(3.14±0.13比18.86±1.67)比例、Th17/Treg(0.10±0.01比1.22±0.11)、肺泡间隔(43.45±1.26,35.78±1.12)、气道炎症评分(3.75±0.17,0.86±0.07)、IL-17(162.27±7.14,103.35±4.33)水平明显降低(均P<0.05)。与CK组比较,Model组大鼠RORγt(0.15±0.01比1.34±0.11)、p-PI3K(0.22±0.01比0.86±0.07)、p-Akt(0.18±0.01比0.75±0.06)、p-NF-κB p65(0.11±0.01比0.69±0.06)蛋白表达升高,Foxp3(1.45±0.27比0.35±0.02)蛋白表达降低(均P<0.05)。与Model组相比,Wog-L组、Wog-H组RORγt(1.08±0.10,0.36±0.02)、p-PI3K(0.71±0.06,0.35±0.03)、p-Akt(0.62±0.06,0.28±0.02)、p-NF-κB p65(0.52±0.05,0.26±0.02)蛋白表达明显降低,Foxp3(0.57±0.04,1.13±0.09)蛋白表达明显升高(均P<0.05)。Wog-H组与Ami组大鼠上述各指标水平近似,均差异无统计学意义(P>0.05)。IGF-1逆转了高剂量Wog对COPD大鼠Th17/Treg的影响。结论Wog促进COPD大鼠Th17/Treg平衡的机制可能与下调PI3K/Akt/NF-κB通路有关。

miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对细胞外调节蛋白激酶1/2信号通路的影响

目的:观察miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的神经保护作用及其对胞外调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)信号通路的影响。方法:将大鼠随机数字法分为模型组、miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组。建模后,模型组经尾静脉注射10 mL/kg生理盐水,miR-17-5p mimics组、miR-17-5p inhibitor组分别经尾静脉注射7μL miR-17-5p mimics、miR-17-5p inhibitor与RNAi脂质体转染试剂的混合溶液。各组大鼠苏醒后的24 h进行神经功能评分,测定脑梗死体积、大鼠脑组织含水量,检测缺血侧大脑皮质细胞凋亡率,caspase-3、Bax、Bcl-2和ERK1/2蛋白表达。结果:miR-17-5p mimics组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率明显低于模型组,miR-17-5p inhibitor组的神经功能障碍评分、脑梗死体积、脑组织含水量、缺血侧大脑皮质细胞凋亡率显著高于其他2组;miR-17-5p mimics组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax蛋白表达明显低于模型组,Bcl-2、p-ERK1/2蛋白表达高于模型组;miR-17-5p inhibitor组大鼠缺血脑组织中caspase-3、Bax、p-ERK1/2蛋白表达显著高于其他2组,Bcl-2蛋白表达低于其他2组。结论:miR-17-5p对缺血性脑卒中大鼠的脑损伤具有一定的保护作用,miR-17-5p可抑制ERK1/2信号通路激活。

RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路在胃癌中的研究进展

胃癌(GC)的发病机制复杂,与多种因素有关,包括环境和遗传因素等。细胞内信号通路失调代表了一种常见的致病机制,可能适合对患者进行靶向药物治疗。RAS/RAF/丝裂原活化蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路在多种恶性肿瘤的发生发展中起到至关重要的作用。但迄今为止,大多数针对此通路的药物研究是基础实验,临床试验有待开展。本文就RAS/RAF/MEK/ERK信号通路在GC中的研究进展进行综述,重点论述其与GC的关系及潜在的作用机制,以及RAS/RAF/MEK/ERK信号通路抑制剂在GC治疗中的应用前景,旨在为GC的早期诊断和治疗提供新思路。

细胞外信号调节蛋白激酶在颞下颌关节骨关节炎髁突软骨退变中的作用

目的探究细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)在小鼠颞下颌关节骨关节炎(TMJOA)髁突软骨退变中的作用。方法C57BL/6J雌性小鼠36只,随机分成假手术对照组(Sham组)和单侧前牙反[牙合]组(UAC组),每组于造模3、7、11周后各取6只处死,取颞下颌关节(TMJ)。另18只小鼠随机分成假手术对照+关节腔注射PBS组(Sham+PBS组)、单侧前牙反[牙合]+关节腔注射PBS组(UAC+PBS组)和单侧前牙反[牙合]+关节腔注射ERK抑制剂PD98059组(UAC+PD98059组),11周后处死,取TMJ。HE和番红O染色评价软骨退变程度;RT-PCR检测软骨基质(Aggrecan)、增殖相关分子(Pcna)和分化/降解分子(Mmp13)的mRNA表达水平;免疫组化染色检测髁突软骨中磷酸化ERK(p-ERK)表达。结果与同期Sham组相比,UAC组软骨厚度、番红O阳性面积比、Aggrecan和Pcna mRNA表达显著降低(P<0.01),Mmp13 mRNA表达、p-ERK阳性细胞率显著升高(P<0.01)。与UAC+PBS组相比,UAC+PD98059组软骨厚度、番红O阳性面积比、Aggrecan和Pcna mRNA表达显著升高(P<0.01),Mmp13 mRNA表达显著降低(P<0.01)。结论ERK参与了TMJOA的软骨退行性变进程,阻断ERK相关通路可以显著逆转髁突软骨退行性变进程。

外源性硫化氢对早期糖尿病肾脏疾病大鼠丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路的影响

目的研究外源性硫化氢(H2 S)通过丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶(MEK)/细胞外信号调节激酶(ERK)信号通路对早期糖尿病肾脏疾病(DN)大鼠的保护作用。方法随机选取SPF级健康雄性SD大鼠24只腹腔一次性注射1%链尿佐菌素(STZ)60 mg/kg制作DN模型,余下10只(正常对照组)腹腔一次性注射等量的柠檬酸缓冲液。3周后DN造模成功,再将24只DN大鼠随机分为DN组和DN+硫氢化钠(NaHS)组,每组各12只。DN+NaHS组予腹腔注射NaHS溶液56μmol·kg^(-1)·d^(-1),正常对照组和DN组予等量生理盐水腹腔注射,3组大鼠均连续注射12周。检测各组血清肌酐(SCr)、尿素氮(BUN)及24小时尿蛋白(24h Upro)水平,观察其肾脏组织病理变化。采用Katafuchi评分评估大鼠肾脏病变(包括肾小球、肾小管及肾血管)。采用免疫组化法检测ERK1/2、MEK1和MEK2蛋白阳性区域面积百分比。结果DN组大鼠SCr、BUN及24h Upro水平、肾脏组织Katafuchi评分、MEK1、MEK2及ERK1/2蛋白阳性区域面积百分比均显著高于正常对照组和DN+NaHS组(P<0.01),而正常对照组与DN+NaHS组大鼠上述指标水平比较差异均无统计学意义(P>0.05)。结论外源性H2 S对早期DN大鼠肾脏的保护作用可能与抑制MEK/ERK信号通路有关。

淫羊藿素通过调控黏着斑激酶及下游细胞外信号调节激酶/细胞周期蛋白D1和蛋白激酶B/哺乳动物雷帕霉素蛋白信号通路抑制肝癌细胞增殖的作用机制研究

目的探究淫羊藿素(icaritin,ICA)抑制肝癌细胞增殖的作用机制。方法以Huh7肝癌细胞为研究对象并在体外培养;设置200、100、50、20、10、5、2、1、0.5μmol/L不同浓度的ICA给药干预72小时之后,采用0.5%结晶紫染色分析ICA对Huh7肝癌细胞生存的影响;将Huh7肝癌细胞给与ICA高(10μmol/L)、中(5μmol/L)、低(2.5μmol/L)三个浓度,每个浓度设置三个复孔,通过克隆形成实验检测ICA对Huh7肝癌细胞增殖能力的影响;Huh7肝癌细胞给与ICA IC 50值浓度,对照孔及ICA给药孔分别在0、6、12、24小时在倒置显微镜下拍照,通过细胞划痕分析ICA对肝癌细胞迁移能力的影响;并且用流式细胞术对细胞周期进行分析。另外,通过蛋白印迹对增殖相关蛋白,如增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)、磷酸化黏着斑激酶(phosphorylated focal adhesion kinase,p-FAK)、细胞周期蛋白D1(cyclin D1)、磷酸化细胞外信号调节激酶(phosphorylated extracellular signal-regulated protein kinase,p-ERK)、磷酸化蛋白激酶B(phosphorylated protein kinase B,p-Akt)和磷酸化哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(phosphorylated mammalian target of rapamycin,p-mTOR)等蛋白的表达水平进行分析。结果ICA可以明显抑制肝癌细胞的增殖及迁移能力,并且使肝癌细胞的细胞周期在G1期发生阻滞(P<0.05)。另外,研究发现ICA可以下调p-FAK及其下游调节蛋白p-ERK、cyclin D1以及p-Akt、p-mTOR、p-S6的表达水平。结论ICA可能通过调控FAK及下游ERK/cyclin D1和Akt/mTOR信号通路从而抑制肝癌细胞的增殖生长。

细胞外信号调节蛋白激酶对哮喘大鼠气道平滑肌细胞周期的影响

目的探讨细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)通道调控支气管哮喘大鼠气道平滑肌细胞(ASMC)增殖中的细胞周期机制。方法30只Wistar大鼠随机分为正常组和哮喘组,哮喘组采用卵清蛋白致敏和激发建立哮喘模型。取两组大鼠叶支气管ASMC进行原代培养,采用ERK激动剂表皮生长因子(EGF)和抑制剂PD98059干预哮喘组ASMC。用免疫组织化学法检测ASMC细胞周期蛋白CyclinD1和CDK2的表达;Western免疫印迹检测ERK1/2和磷酸化ERK1/2蛋白的表达,计算ERK活化率。结果哮喘组大鼠ASMC中CyclinD1、CDK2的表达和ERK活化率[76.15±4.88、92.30±7.95和(82.37±5.78)%]均较正常组[54.17±6.11、61.04±4.09和(49.91±3.26)%]显著升高(P均<0.05)。经EGF处理后上述指标进一步升高[119.28±8.14、134.77±9.26和(91.57±5.32)%,P均<0.05],经PD98059处理后显著降低[58.78±4.60、69.15±5.83和(54.01±4.12)%,P均<0.05]。结论哮喘大鼠ASMC增殖活性增强。ERK1/2可通过诱导ASMC中CyclinD1和CDK2蛋白高表达,使细胞从G1期向S期发展,促进细胞增殖。

磷酸化的细胞外信号调节蛋白激酶1/2在正常小鼠脑内的免疫细胞化学定位

细胞外信号调节蛋白激酶(ERK)1/2是重要的信号转导分子。现已知在正常动物的中枢神经系统内有其活化形式即磷酸化的ERK1/2(pERK1/2)分子的存在,但其在小鼠脑内的分布目前还没有全面的观察。本研究用免疫组织化学技术(ABC法)研究了pERK1/2样免疫反应阳性产物在脱臼处死的正常小鼠全脑内的分布。结果发现pERK1/2在正常小鼠脑内有广泛的表达,阳性产物主要存在于神经元,亦见于个别白质内的胶质细胞,脑膜及室管膜细胞也有表达。强阳性表达的核团主要有:岛皮质、视听皮质、边缘前皮质、扣带前皮质、海马垂直部、弓状核、蓝斑和小脑Purkinje细胞;中等阳性表达的核团主要有:感觉运动皮质、外侧隔区、内侧杏仁核、皮质杏仁核和外侧杏仁核、丘脑室旁核前部、视交叉上核、穹隆下器、终板血管器、前腹侧视前核和下丘脑背内侧核;弱阳性表达的核团主要有:视上核、下丘脑室旁核大细胞部、下丘脑后区、顶盖前区、室周灰质腹外侧柱、A5区、孤束核和延髓腹外侧网状结构等。本文结果观察到pERK1/2在正常小鼠脑内广泛存在,提示pERK1/2作为重要的信号转导分子,可能参与许多脑区在正常状态下的功能活动,揭示其分布特点为了解其在脑内的多样性功能提供了形态学依据。

细胞外信号调节蛋白激酶5/凋亡调节蛋白信号途径在低温诱导心肌细胞损伤及凋亡中的调控作用

目的:探讨低温刺激诱导心肌细胞损伤及凋亡,以及细胞外信号调节蛋白激酶5(ERK5)/凋亡调节蛋白Bim途径的调控作用。方法:基于乳鼠原代心肌细胞,低温培养箱施加低温刺激;使用特异性小干扰RNA(siRNA)下调ERK5或Bim的表达;细胞凋亡使用流式细胞仪检测;各蛋白表达水平通过Western blot检测;细胞内钙离子、活性氧簇(ROS)水平、线粒体膜电位(ΔΨm)通过荧光标记及流式细胞仪检测。结果:在低温刺激下的心肌细胞中,ERK5 siRNA可加剧Bim蛋白表达;Bim siRNA不影响ERK5,但减轻p-ERK5表达;ERK5 siRNA导致更高的细胞凋亡率,Bim siRNA则可减弱ERK5 siRNA的促凋亡作用;ERK5 siRNA加重了细胞内钙离子超载、ROS激活、线粒体膜电位破坏,Bim siRNA则可对抗上述损伤性作用。结论:在低温干预下的心肌细胞中,下调ERK5可释放对Bim的表达抑制,加重凋亡、细胞内钙离子超载、ROS爆发,造成更严重的线粒体膜电位破坏,而下调Bim则产生反向的保护作用。结果显示ERK5/Bim途径在低温诱导心肌细胞损伤中的重要调控作用。

人A431皮肤鳞状细胞癌中丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶信号通路对P53的调节作用

目的观察丝裂原活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(MAPK/ERK)信号通路的活化及抑制对皮肤鳞状细胞癌(SCC)细胞增殖、凋亡情况的影响,探讨MAPK/ERK信号通路与抑癌基因P53在皮肤SCC中的相互作用机制。方法培养人A431皮肤SCC细胞株,分为低、中、高浓度的MAPK/ERK通路抑制剂(PD98059+DMSO)组及激活剂(IGF+PBS)组、空白对照(DMSO)组。噻唑蓝法检测细胞体外增殖活力,流式细胞术(FCM)检测细胞的凋亡,Western blot检测各组A431细胞中P-ERK、P53蛋白表达。结果经不同浓度的抑制术PD98059处理A431细胞,细胞增殖受到抑制,呈浓度-效应和时间-效应关系(P<0.05);经不同浓度的激动剂胰岛素样生长因子(IGF)处理A431细胞,细胞增殖受到促进,呈浓度-效应和时间-效应关系(P<0.05)。FCM检测结果显示,PD98059作用于A431细胞,细胞凋亡率明显增高,呈浓度-效应关系(P<0.05);而IGF作用于A431细胞,细胞凋亡率明显降低,呈浓度-效应关系(P<0.05)。Western blot检测结果显示,PD98059处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达降低,P53蛋白的表达增强,随着PD98059浓度的增加,P-ERK蛋白明显降低,P53蛋白明显增强(P<0.05);而IGF处理A431细胞,P-ERK蛋白的表达增强,P53蛋白的表达降低,随着IGF浓度的增加,P-ERK蛋白明显增强,P53蛋白明显降低(P<0.05);经过Pearson相关性分析,P53与P-ERK的表达呈负相关(P<0.05)。结论人A431细胞中MAPK/ERK信号通路被IGF激活后,促凋亡因子P53表达降低,细胞增殖能力增强,凋亡能力降低;而该通路受抑制后,促凋亡因子P53表达增高,细胞增殖能力降低、凋亡能力增强。

磷酸化细胞外信号调节蛋白激酶加重糖尿病大鼠脑缺血性损伤

目的探讨高血糖加重脑缺血性损伤的分子机制。方法采用大鼠全脑缺血模型,通过免疫组化、末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP原位切口末端标记方法和Western blot技术,对比研究Streptozotocin诱导的糖尿病大鼠脑缺血时神经元细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)磷酸化和神经元凋亡的关系。结果糖尿病组脑缺血30min和再灌注1、3、6h后,扣带皮质和海马CA3区ERK1/2阳性细胞数和神经元凋亡明显高于正常血糖组(P<0.05)。ERK1/2抑制剂U0126可明显减少ERK1/2的磷酸化和凋亡神经元的数量。Western blot分析可见,在缺血脑组织中磷酸化ERK1/2明显增高,再灌注3和6h糖尿病组显著高于正常血糖缺血组(P<0.05)。结论糖尿病高血糖加重缺血性脑损伤与MAPK家族激活有关,特别是ERK1/2参与了脑细胞的损伤。

针刺对大鼠局部筋膜和脊髓细胞外信号调节激酶1/2和P38丝裂酶原活化蛋白激酶信号通路的影响

目的:观察针刺捻转拉伸大鼠皮下筋膜对局部筋膜和脊髓背角细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)和丝裂原活化蛋白激酶P38(P38MAPK)信号通路的影响及筋膜结缔组织的形态学变化。方法:20只SD大鼠通过随机分组,每组5只,针刺后三里组和针刺非穴位组进行手针捻转,拉伸刺激组进行拉伸刺激,采用免疫组化技术观察筋膜和脊髓组织中细胞信号蛋白的变化;利用相差显微镜观察拉伸刺激组局部皮下筋膜形态学变化。结果:组织学改变:拉伸刺激组皮下筋膜的纤维以拉伸点为中心呈向心性分布,单位面积内细胞密度增大,细胞骨架和胞核重构成"扁梭形"。细胞信号蛋白变化:针刺组筋膜结缔组织ERK1/2和P38MAPK表达与对照组相比均有增加,但以非穴组增加显著;ERK1/2与P38MAPK在脊髓中的表达位置由胞质转向胞核,ERK1/2与空白对照组相比差异没有显著性意义;P38MAPK的表达有所增加。结论:针刺对局部浅筋膜的ERK1/2和P38有上调作用,但与脊髓中的信号蛋白增加幅度并不完全一致,提示筋膜结缔组织支架可能在微观的信号转导层面对局部细胞分化与增殖具有促进作用。

不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶和细胞外调节蛋白激酶表达的影响

目的观察不同灸量隔姜灸对脾虚证大鼠胃组织丝裂原细胞外激酶(MEK)1/2和细胞外调节蛋白激酶(ERK)1/2表达的影响,探讨隔姜灸治疗脾虚证的可能作用机制及量效特征。方法将75只SD大鼠按随机数字表法分为空白对照组、模型组、隔姜灸3壮组、隔姜灸6壮组、隔姜灸9壮组,每组15只。200%大黄浓缩液4℃灌胃制作脾虚证大鼠模型。造模成功后,隔姜灸组选取"足三里""中脘"予不同灸量治疗,连续8 d。HE染色镜下观察大鼠胃组织病理学改变,免疫组化检测大鼠胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达。结果与空白对照组比较,模型组大鼠胃黏膜损伤明显,可见较大的破损、脱落;与模型组比较,隔姜灸3壮组大鼠胃黏膜表面有部分脱落、破损情况改善,隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组大鼠胃黏膜表面较完整、脱落及破损明显改善。与空白对照组比较,模型组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.01);与模型组比较,隔姜灸各组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白明显表达升高(P<0.01);与隔姜灸3壮组比较,隔姜灸6壮组和隔姜灸9壮组胃组织MEK1/2及ERK1/2蛋白表达明显升高(P<0.01),但二者作用效果相当,差异无统计学意义(P>0.05)。结论隔姜灸通过提高胃组织MEK1/2及ERK1/2的蛋白表达,激活MEK/ERK信号转导通路,进而促进脾虚证大鼠胃黏膜的修复。

电针干预自发性高血压大鼠主动脉丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1及磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白的表达

背景:近年来大量临床研究表明针刺风池、太冲、曲池等穴位能有效降低血压,可用于高血压,但对其治疗的分子机制尚未阐明。目的:观察针刺大鼠风池、太冲、曲池等穴位对丝裂原活化蛋白激酶信号转导调控系统的影响,从而探讨针刺治疗高血压的分子机制。方法:选取8月龄自发性高血压雄性Wistar大鼠14只,随机分为针刺组和模型组,每组7只;另选取同月龄正常血压雄性Wistar-Kyoto大鼠7只作为对照组。对针刺组大鼠采用电针针刺双侧风池、曲池和三阴交穴,毫针刺太溪和太冲穴。3周后采用RT-PCR方法检测各组大鼠主动脉组织丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1mRAN的表达,Western blot方法检测丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1、磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达。结果与结论:与对照组比较,模型组主动脉组织磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达水平升高,丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1mRNA及其蛋白表达水平降低(P<0.01);与模型组比较,针刺组主动脉组织磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达水平降低,丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1mRNA及其蛋白表达水平升高(P<0.05)。提示针刺治疗自发性高血压大鼠可能是通过调控丝裂原活化蛋白激酶信号转导途径,增强磷酸化细胞外信号调节激酶1/2蛋白表达,降低丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1蛋白表达,从而改善血管重塑,降低血压。

牙髓卟啉单胞菌脂多糖对成骨细胞p38丝裂原活化蛋白激酶和细胞外信号调节激酶1、2表达的影响

目的:探讨牙髓卟啉单胞菌(P.e)脂多糖(LPS)对小鼠成骨细胞株MC3T3-E1细胞ERK1/2和p38表达的影响。方法:用10μg/mL的P.e-LPS分别作用于成骨细胞0、5、15、30、60、180 min,应用蛋白质印迹技术检测成骨细胞内磷酸化ERK1/2和p38表达水平的变化。采用SPSS11.0软件包对结果进行单因素方差分析和Dunnett t检验。结果:10μg/mL的P.e-LPS刺激后,成骨细胞内p38迅速被活化,5～30 min为激活高峰(P<0.01),60 min后基本恢复至正常水平;ERK1/2磷酸化水平在P.e-LPS刺激5 min后明显增加,15 min后磷酸化水平最高(P<0.01),30 min后磷酸化水平下降。结论:P.e-LPS可诱导成骨细胞MC3T3-E1的p38和ERK1/2蛋白表达增强,Pe-LPS可能通过p38和ERK1/2对成骨细胞发挥作用。

加味脑泰方对卵巢摘除脑缺血大鼠海马细胞外信号调节蛋白激酶1/2和c-Jun氨基末端蛋白激酶蛋白活化的影响

目的探讨加味脑泰方对卵巢摘除脑缺血大鼠神经细胞凋亡的影响及其机制。方法雌性Sprague-Dawley大鼠40只随机分为假手术组(n=10)、模型组(n=10)、雌激素组(n=10)和加味脑泰方组(n=10)。模型组、雌激素组、加味脑泰方组大鼠摘除卵巢。去卵巢术后11 d,雌激素组、加味脑泰方组分别予雌激素和加味脑泰方灌胃3 d;术后14 d,模型组、雌激素组、加味脑泰方组线栓法制备局灶性脑缺血模型。缺血24 h后取脑组织,TUNEL法观察神经细胞凋亡率,Western blotting检测海马细胞外信号调节蛋白激酶1/2(ERK1/2)、c-Jun氨基末端蛋白激酶(JNK)蛋白活化程度。结果与模型组比较,加味脑泰方组和雌激素组神经细胞凋亡率显著降低(P<0.001),ERK1/2蛋白活化程度明显升高(P<0.01),p-JNK蛋白活化程度明显降低(P<0.01)。结论加味脑泰方可能通过提高p-ERK1/2蛋白活化,降低p-JNK蛋白活化,降低脑缺血后神经细胞凋亡率。

高糖对系膜细胞胞外调节蛋白激酶表达及细胞外基质合成的影响

目的:探讨高糖环境下系膜细胞中胞外调节蛋白激酶(ERK)转导途径活性和转化生长因子-β1(TGF-β1)mRNA表达的变化。方法:分离培养大鼠肾脏系膜细胞,调整培养液浓度为以下3组,即正常糖组、高糖组、甘露醇组。分别予干预12h、24h、48h后用免疫细胞化学法和Western-blot法对系膜细胞中磷酸化ERK1/2(pERK1/2)的表达进行定位、定性及半定量分析,用RT-PCR法检测细胞中TGF-β1 mRNA的表达,放免法测定各组细胞上清中Ⅳ型胶原的含量。结果:高糖组系膜细胞中pERK1/2蛋白的表达较正常糖组明显增高并由胞浆向胞核内转移,随培养时间延长其表达呈上升趋势(P<0.01),高糖组TGF-β1 mRNA的表达及细胞上清液Ⅳ型胶原的含量均高于正常糖组(P<0.01),甘露醇组上述指标较正常糖组略有升高,但两组间无统计学意义(P>0.05)。结论:高糖环境下系膜细胞中ERK信号转导通路被激活,TGF-β1 mRNA表达上调,可能是糖尿病肾病系膜细胞受损,肾小球硬化的机制之一。