脑脊液细胞学实验研究

目前广泛采用的脑脊液常规检查,只能提供细胞总数和简单的细胞分类。由于对标本不进行染色,细胞形态辨认不清,故不能提供准确的病理资料。1996年1月～1999年11月,我们开展了脑脊液细胞形态学检查,应用先进的脑脊液细胞离心、沉淀、染色技术,在普通光学显微镜下,清晰地观察到各种脑脊液细胞形态特征,为神经系统感染、出血、脑膜白血病等疾病诊断提供了可靠的临床检验资料。

细胞盖玻片培养法及其在实验细胞学研究中的应用

体外细胞培养作为重要的实验细胞学手段在生命科学研究的众多领域被广泛应用。以往的体外细胞学研究多以不同规格的培养皿/瓶为单位进行。在实验中,虽可通过设立多种形式的对照来消除各种因素造成的差异,但仍有一定的不足和弊端。这主要表现在:(1)多皿培养的细胞间存在着皿间差异;(2)培养皿内的细胞只能供单项指标观察;(3)

芪苓柴虎汤提取物抗乙型肝炎病毒的细胞实验研究

[目的]探讨芪苓柴虎汤(OD)提取物的抗乙型肝炎病毒(HBV)作用。[方法]OD提取物处理乙肝病毒转染的细胞(2.2.15细胞),用ELISA法测定HBsAg和HBeAg。[结果]OD制成的4个不同工艺提取物对HBV-DNA转染的2.2.15细胞分泌的HBsAg、HBeAg均有明显的抑制作用,并呈一定的剂量依赖关系。[结论]芪苓柴虎汤在体外对HBV有一定的抑制作用,为临床治疗慢性乙型肝炎提供了实验依据。

缺氧缺血对新生大鼠学习记忆能力的影响及海马CA_1区的细胞学变化

目的 探讨缺氧缺血性脑损伤（ＨＩＥ）对新生鼠发育过程中学习记忆能力的影响及其海马 ＣＡ１区的细胞学变化。方法取７ｄ龄Ｗｉｓｔａｒ大鼠，制备ＨＩＥ模型为实验组，另设假手术组。两组均在术后 ８个时限取脑，石蜡切片 Ｎｉｓｓｌｅ染色，观察分析海马 ＣＡ１区的细胞学变化。同时对 ４周和 ２个月的仔鼠进行学习记忆能力测试。结果与假手术组比较，实验组海马ＣＡ１区细胞数量减少，颗粒层明显变薄，学习记忆能力明显降低（ Ｐ＜０．０５， Ｐ＜０．０１）。结论 ＨＩＥ后发育至成年大鼠学习记忆能力降低，细胞学分析证实与海马 ＣＡ１区细胞损伤有直接关系。

McCoy细胞的冻存和增殖实验

目前有些作者认为McCoy细胞(鼠异倍体)感染衣原体较为敏感,故实验常用此细胞株来分离衣原体患者的病原菌。为了使McCoy细胞株保持其稳定性,有利于提高分离效果,作者对其冻存方法和影响增殖的主要因素作了探索。现将实验结果报道如下。

补肾方药有效成分不同比例配伍对成骨细胞增殖和分化的影响

背景:补肾方药的动物及细胞实验研究提示具有防治骨质疏松及改善骨代谢作用,但补肾方药研究具有相当的复杂性,目前复方中药研究多采用的血清药物代谢动力学的方法却具有局限性,使有效作用成分及药物物质基础尚不确定。目的:通过采用补肾方药有效成分配伍,在不同浓度和时间下,对新生SD大鼠成骨细胞进行干预性培养,并对其增殖与分化情况进行测定,从而确定补肾方药对成骨细胞时效和量效关系,为补肾方药防治骨质疏松症提供实验依据。方法:体外培养原代新生24 h的SD大鼠成骨细胞,采用补肾方药的"补药"和"泻药"有效化学成分不同比例配伍,实验分3组,即补>泻组、补<泻组和对照组,补>泻组、补<泻组分别加入质量浓度10,20,30μg/L的补肾方药无血清培养基干预成骨细胞培养,在培养24,48,72 h分别检测细胞的增殖,在培养48,72 h测定成骨细胞的碱性磷酸酶分泌。结果与结论:质量浓度为10μg/L,在培养48 h,补>泻组具有明显促增殖作用(P<0.05);质量浓度为20μg/L时,各时间点补>泻组、补<泻组无明显差别,但与对照组比较具有明显增殖作用;质量浓度为30μg/L,在培养48 h,补>泻组具有明显促增殖作用最强(P<0.05),72 h时增殖作用减弱;质量浓度为10μg/L,在培养72 h测得补>泻组具有促碱性磷酸酶分泌作用,质量浓度为20μg/L,在培养24 h以补<泻组最明显(P<0.05);质量浓度为30μg/L,在培养72 h补>泻组促明显的促碱性磷酸酶分泌作用最佳(P<0.05)。结果证实,补肾方药有效成分按补>泻组配伍比例对成骨细胞增殖、分化作用最强,且存在时-效及量-效关系。

静水压对人椎间盘髓核细胞形态及基质表达的影响

背景:加载在椎间盘上的重力引起的静态压力刺激是椎间盘细胞代谢的重要调节因素。目的:观察静水压对体外单层培养人椎间盘髓核细胞形态学及基质代谢的影响。方法:在静水压加载系统中对体外单层培养的传4代人髓核细胞施以0.3,0.7,3MPa的静压,分别加压30,60,90,120min,以常压0.1MPa为对照。结果与结论:①髓核细胞形态:在静水压干预下细胞体积均变小。0.3,0.7MPa静水压下轻微缩小,细胞形态相对完整;3MPa静水压下缩小最明显,且细胞形态不完整。②髓核细胞存活率:在持续静水压刺激下开始的30min,不论压力大小存活率都偏低,在0.3,0.7MPa时随作用时间延长而增加或维持稳定,细胞增殖逐渐增强,在3MPa时随时间趋于下降,最终细胞总体数量减少。③髓核细胞蛋白多糖:各组表达量随时间增加逐渐增加,当持续加压120min时,在0.3,0.7MPa静水压下合成量呈高表达状态,在0.1,3MPa静压表达相对较少。表明静水压会对髓核细胞形态学、存活率及基质表达产生影响。

一种高效实用的人卵巢表面上皮细胞培养方法

背景:体外分离培养纯度高、活力强且生物学特性稳定的卵巢表面上皮难度很大,目前原代培养主要采用组织块贴壁法和酶消化法,但这两种方法在取材、细胞活力及细胞纯度上都存在一定的问题。目的:建立一种高效实用的人卵巢表面上皮分离、培养和鉴定方法。方法:创新性地运用细胞刷刷取人卵巢表面上皮,以红细胞裂解法、差速贴壁法对细胞进行分离纯化,并向无血清DMEM-F12培养基中添加人表皮生长因子进行细胞培养。在倒置显微镜下观察细胞形态,应用苏木精-伊红染色和免疫细胞化学染色法对细胞进行鉴定,并绘制生长曲线。结果与结论:卵巢表面上皮培养24h开始贴壁生长,7-12d后基本达到融合,细胞呈多角形或扁平型,透光性及折光性强。细胞形态符合正常上皮细胞特性,所分离的细胞几乎完全表达上皮细胞表面标志物CK19。细胞生长良好,可以传6-8代,细胞生长曲线呈"S"形,纯度达95%以上。结果提示细胞刷取培养法操作简单,能够快速分离获得大量卵巢表面上皮,所获得的细胞经红细胞裂解法和差速贴壁法处理后纯度达95%以上,且细胞生长稳定。

低氧诱导因子1α慢病毒载体转染骨髓间充质干细胞的成骨基因表达

背景:成骨作用和血管发生在骨的形成和修复过程中紧密结合,而低氧诱导因子1α被认为是促血管新生相关基因调控中最重要的核心转录因子,其可促进缺氧部位血管的形成,进而促进骨的形成。目的:构建野生型和点突变型两个低氧诱导因子1α慢病毒真核表达载体Lenti-HIF1α-IRES-EGFP,并比较其对兔骨髓间充质干细胞成骨基因表达的影响。方法:首先根据野生型人源低氧诱导因子1α基因序列信息和确定酶切位点的点突变型序列信息构建低氧诱导因子1α基因野生型和点突变型两个慢病毒真核表达载体;然后采用制备的病毒液转染兔骨髓间充质干细胞。结果与结论:免疫荧光显微镜观察显示,转染7 d后野生型组和点突变型组细胞均未见明显荧光,转染14 d后两组细胞均呈现明显的绿色荧光;qPCR定量分析结果表明,转染7 d后即有低氧诱导因子1α和骨形态发生蛋白2基因的显著表达,转染14 d后,两基因仍然显示较高的表达水平。说明实验成功构建野生型和点突变型低氧诱导因子1α基因慢病毒真核表达载体,转染后可以促进兔骨髓间充质干细胞成骨基因的表达。

小干扰RNA对人类风湿关节炎患者滑膜细胞基因表达的影响

背景:类风湿关节炎的病因尚不十分明确,但核转录因子κB在类风湿性关节炎发病中的作用,己逐渐引起风湿病学者的关注。目的:通过RNA干扰技术阻断人类风湿关节炎滑膜细胞核转录因子κB信号通路,探索其在类风湿关节炎治疗中的应用前景。方法:分离、消化、培养滑膜细胞备用。根据小分子干扰RNA设计原则,确定核转录因子κB的小分子干扰RNA四条目标基因序列,合成并构建核转录因子κB小分子干扰RNA表达载体。将构建好的4条pGenesil-1/核转录因子κB小分子干扰RNA表达载体转染入生长状态良好的一代滑膜细胞,并设立空白和阴性对照组。收集转染后12 h、24 h、48 h、72 h、5 d、7 d不同时间段的细胞,并提取RNA。测定细胞内核转录因子κB mRNA相对表达水平,筛选出有效抑制核转录因子κB mRNA表达的小分子干扰RNA质粒载体。结果与结论:核转录因子κB在人类风湿关节炎滑膜细胞高表达,3#pGenesil-1/核转录因子κB能显著抑制人类风湿关节炎滑膜细胞核转录因子κB mRNA表达。RNA干扰技术可阻断核转录因子κB mRNA的表达,因此,可将阻断核转录因子κB信号通路作为基因治疗类风湿关节炎的靶点。

小胶质细胞介导帕金森病小鼠的氧化应激损伤

背景:研究证实,小胶质细胞诱导型一氧化氮合酶可增加多巴胺能神经元对百草枯的摄取,造成百草枯对多巴胺能神经元的特异性杀伤作用。帕金森病的黑质纹状体存在小胶质细胞的激活,但其产生氧化应激作用机制尚不明确。目的:建立帕金森病小鼠模型,观察小胶质细胞介导的氧化应激损伤在帕金森病中的作用。方法:36只C57BL/6小鼠随机分为帕金森病模型组和对照组,每组18只。以腹腔注射百草枯10mg/kg为模型组,等体积生理盐水为对照组,分别观察小鼠行为活动改变。采用高效液相法测定两组小鼠黑质纹状体多巴胺的含量及免疫组织化学方法检测两组小鼠黑质部位酪氨酸羟化酶、mac-1蛋白表达,同时应用化学比色法测定两组小鼠黑质部位超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性和丙二醛水平的变化。结果与结论:模型组小鼠自发行为活动较对照组减少(P<0.05)。高效液相法检测模型组小鼠黑质纹状体多巴胺含量及酪氨酸羟化酶蛋白的表达均显著低于对照组(P<0.05),mac-1蛋白表达高于对照组(P<0.05)。模型组超氧化物歧化酶、还原性谷胱甘肽、谷胱甘肽过氧化物酶活性较对照组均显著下降(P<0.05),丙二醛水平较对照组显著升高(P<0.05)。提示中脑黑质部位小胶质细胞的激活致使氧化应激反应增强及抗氧化保护作用减弱可能是引起帕金森病发病的重要机制。

共培养下后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶的基因表达

背景:后交叉韧带对人膝关节结构的稳定以及功能的发挥起着重要作用。与内侧副韧带相比,损伤后的后交叉韧带难以很好的自我愈合,甚至会导致半月板撕裂和软骨损伤。为了提高后交叉韧带的愈合能力,这就需要寻找新的途径来再生和修复损伤的后交叉韧带。近年来的研究表明,赖氨酰氧化酶在组织损伤修复过程中起到非常重要的作用,但其在后交叉韧带修复过程中的分子机制研究尚未涉猎。目的:观察与滑膜细胞共培养后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶基因的表达。方法:将第4代的后交叉韧带成纤维细胞和滑膜细胞分别种植于6孔板和Tanswell中。实验分为2组,即后交叉韧带成纤维细胞与滑膜细胞共培养组和后交叉韧带成纤维细胞单层培养组。培养6h后,提取总RNA,通过半定量PCR和实时定量PCR检测单层培养组和共培养组中后交叉韧带成纤维细胞中赖氨酰氧化酶基因表达。结果与结论:与单层培养组相比,赖氨酰氧化酶、赖氨酰氧化酶样蛋白1、赖氨酰氧化酶样蛋白2、赖氨酰氧化酶样蛋白3和赖氨酰氧化酶样蛋白4的基因表达在共培养的后交叉韧带细胞中都明显升高,分别增加了1.1,1.4,1.1,1.3,1.1倍(P<0.05)。单层培养组家族成员在单层培养和共培养中表达情况的差异性,说明细胞之间的相互作用会影响后交叉韧带组织的损伤修复,对后交叉韧带损伤修复的机制研究有极其重要的参考价值。

Cdx2反转录病毒载体的构建及转染膀胱上皮细胞的研究

背景:尾侧型同源转录因子2在消化道尤其是小肠与结肠上皮的发育中起到关键作用。目的:构建尾侧型同源转录因子2反转录病毒表达载体pLNCX2-Cdx2,观察pLNCX2-Cdx2体外转染对人膀胱上皮细胞发生肠上皮化生的作用。方法:应用基因重组技术将人尾侧型同源转录因子2cDNA克隆到反转录病毒载体pLXSN2,酶切鉴定,包装到PA317细胞中。转染人膀胱尿路上皮细胞,应用荧光PCR及Western blot检测尾侧型同源转录因子2以及绒毛蛋白、LI-cadherin的表达情况。结果与结论:pLNCX2-Cdx2成功构建;细胞转染后尾侧型同源转录因子2的mRNA及蛋白水平表达明显增加;尾侧型同源转录因子2的过表达明显激活了绒毛蛋白与LI-cadherin的表达;转染后细胞可出现肠细胞样特征改变。结果提示体外尾侧型同源转录因子2过表达可使膀胱上皮细胞发生尾侧型同源转录因子2激活并产生肠上皮分化,从而诱导腺性膀胱炎发生。

携带bcl-2基因慢病毒感染人原代卵巢颗粒细胞的凋亡

背景:慢病毒可以感染分裂及非分裂细胞,对于较难转染的原代卵巢颗粒细胞,慢病毒能否成功进行感染?目的:探讨携带bcl-2基因的慢病毒感染原代人卵巢颗粒细胞的效率及对细胞凋亡的影响。方法:利用分子生物学技术,构建携带bcl-2基因慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(10,50,100,200,400)感染人卵巢原代颗粒细胞,感染24,48,72,96h后观察感染效率及细胞增殖情况,同时采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况,利用反转录聚合酶链反应检测bcl-2基因的转录情况。结果与结论:原代培养人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当感染复数为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,其在颗粒细胞中的阳性率达60%;携带bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞,可以过度分泌Bcl-2蛋白,能抑制卵巢颗粒细胞的凋亡。

人角质形成细胞Notch信号通路与转化生长因子β调控受体蛋白的作用

背景:在皮肤中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控至关重要,而转化生长因子β似乎是其调控的上游因子,既然Notch信号和转化生长因子β信号通道如此相关,那么Notch是不是也参加了转化生长因子β信号对受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的调控呢?目的:探讨Notch信号通道在人角质形成细胞中对转化生长因子β调控受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa的作用的影响。方法:在分别用Jagged-1激活和用Γ-分泌酶抑制剂抑制Notch信号通道后,加入转化生长因子β,同时设立对照组,用Real-timePCR测试人角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappamRNA表达量。结果与结论:覆盖率为40%的角质形成细胞在加入了转化生长因子β后,受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappamRNA量在各时间点均高于对照组。在用Jagged-1激活Notch通道的角质形成细胞中,单独加入Jagged-1、转化生长因子β及两者都加入时均高于对照组(P<0.05,P<0.01)。在用γ-分泌酶抑制剂抑制Notch通道的角质形成细胞中,只加入转化生长因子β显著高于对照组(P<0.01),只加入γ-分泌酶抑制剂和两者均加入时与对照组比较,差异无显著性意义(P>0.05)。说明加入转化生长因子β导致角质形成细胞中受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达增加,而分别对Notch信号进行激活和抑制后发现,受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa信号分别显著增加和显著被抑制。所以在转化生长因子β升高受体蛋白酪氨酸磷酸酶kappa表达过程中Notch信号通道是非常重要且不可或缺的。

墨西哥钝口螈脊髓全切后胶质细胞的变化

背景:墨西哥钝口螈脊髓切断可以再生,再生过程伴随胶质细胞数目及分布的改变,研究墨西哥钝口螈脊髓全切后胶质细胞的变化,对进一步探讨其脊髓切断再生机制有重要意义。目的:观察墨西哥钝口螈脊髓全切后小胶质细胞、星形胶质细胞及少突胶质细胞的变化。方法:选用成年墨西哥钝口螈,分为脊髓全切组和对照组,利用免疫组织化学法观察脊髓全切后1,3和10d的损伤脊髓及周围区cd11b标记的小胶质细胞、胶质细胞原纤维酸性蛋白标记的星形胶质细胞及髓鞘碱性蛋白标记的少突胶质细胞的变化。结果与结论:脊髓全切后短期内cd11b染色阴性;脊髓损伤后胶质细胞原纤维酸性蛋白及髓鞘碱性蛋白阳性细胞染色强度,1d组阳性细胞染色强度与对照组比较无显著差异,3及10d组阳性细胞染色强度较对照组低。墨西哥钝口螈小胶质细胞染色阴性,可能存在不同于哺乳动物的标记蛋白;脊髓全切后3及10d在损伤脊髓及周围区的胶质细胞原纤维酸性蛋白及髓鞘碱性蛋白阳性细胞染色强度较对照组低,提示钝口螈脊髓急性损伤早期未见星形胶质细胞及少突胶质细胞增生,无胶质瘢痕形成。

RNA干扰对成肌细胞系L6中FOXO3a基因表达的影响

背景:最近的研究发现,一些因子在失神经骨骼肌萎缩的过程中发挥关键性作用,其中"feak-headbox"(Foxo)转录因子是调控骨骼肌萎缩最关键的分子。目的:探讨 RNA 干扰技术体外抑制 FOXO3a 基因表达的效果。方法:6 孔细胞培养板中培养大鼠成肌细胞系 L6,使用 pEGFP-N1 与 siRNA 重组质粒等比例在Lipofectamine2000 介导下转染,优化与检测系统的转染效率;将 2 μg FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染L6,转染 48 h 与 72 h。结果与结论:① p EGFP-N1 与 siRNA 重组质粒转染后 48 h,荧光显微镜下可见细胞中有大量明亮的绿色荧光表达,显示系统有较高的转染效率。②实时定量 PCR 分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a mRNA 的抑制率与未转染对照组相比差异均有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,并以 FOXO3a-Ⅰ的抑制效果最为明显。③Western 印迹灰度分析结果显示,转染后 48 h 和 72 h,干扰序列 FOXO3a-Ⅰ、FOXO3a-Ⅱ、FOXO3a-Ⅲ、FOXO3a-Ⅳ对 FOXO3a 蛋白表达的抑制率与对照组相比差异有显著性意义(P < 0.05),转染 72 h 与 48 h 相比,抑制效应更为明显,与 mRNA 水平的影响一致。结果可见 RNA 干扰技术在体外能够明显抑制叉头蛋白转录因子 FOXO3a 基因的表达,FOXO3a 基因 siRNA 重组质粒转染其干扰序列对 FOXO3a 的 mRNA 和蛋白抑制效果尚不明确,这可为 RNA 干扰介导的失神经骨骼肌萎缩基因治疗提供一种新的思路。

原代人宫颈癌细胞的培养方法

背景:在体外分离、培养宫颈癌上皮细胞,从细胞水平及分子水平研究肿瘤病因及治疗的基础,是宫颈癌组织工程研究的最基本环节。目的:探讨适用于组织工程宫颈癌研究的人宫颈癌原代细胞培养方法以及传代后细胞形态变化、增殖的特性。方法:0.25%胰蛋白酶和2%Ⅰ型胶原酶联合消化法体外培养宫颈癌原代细胞,荧光倒置显微镜下观察肿瘤细胞形态、体外生长情况,免疫组化法检测体外培养宫颈癌细胞表面标记物CK17和肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达。结果与结论:采用胰蛋白酶与Ⅰ型胶原酶联合消化法体外分离培养人宫颈癌细胞,该法相对简单且重复性较好,所得到的原代细胞纯度较高。经体外传代培养的宫颈癌细胞仍可保持稳定的细胞表型。宫颈癌细胞表面标记物CK17阳性表达,证实细胞为上皮源性,肿瘤细胞增殖抗原Ki67表达阳性提示所培养细胞具有肿瘤细胞恶性增殖的特性。

RNA干扰抑制内皮细胞韦伯潘力氏小体的释放

背景:利用RNA干扰和沉默基因达到临床治疗效果,已经越来越受到重视。目的:探讨利用小干扰RNA方法抑制内皮细胞韦伯潘力氏小体释放的效果和意义。方法:设计腺病毒介导的针对调节韦伯潘力氏小体释放的关键蛋白N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子N端功能区shRNA,筛选鉴定收获病毒,转染人主动脉内皮细胞,携带N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子shRNA的腺病毒感染设为实验组、单纯病毒表达载体转染设为阴性对照组,空白对照组未加任何东西。结果与结论:用携带N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子shRNA的腺病毒感染内皮细胞后,3组N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子mRNA表达比较,差异有显著性意义(P<0.05);实验组的表达随时间变化持续下降,24,48,72h组间比较差异有显著性意义(P=0.048)。N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子蛋白表达实验组低于两对照组,差异有显著性意义(P<0.05);而两对照组之间比较差异无显著性意义(P=0.249)。免疫荧光染色显示,N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子shRNA腺病毒感染,明显抑制凝血酶诱导的韦伯潘力氏小体的释放。说明携带N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子shRNA的腺病毒感染人主动脉内皮细胞,能明显抑制N-己基顺丁烯二酰亚胺敏感因子mRNA及蛋白表达,抑制凝血酶诱导的韦伯潘力氏小体释放。