丙型肝炎病毒核心蛋白在昆虫细胞中表达、加工和细胞定位研究

以杆状病毒 -昆虫细胞表达系统Bac-to -Bac为模型 ,就目前存在较多争论的HCV核心蛋白的加工和细胞定位问题进行探讨。根据核心蛋白的亲水性分析结果 ,设计了三种长度的基因片段 (C173 、C191和C2 15) ,经过PCR扩增、重组转移载体构建、细菌内转座和昆虫细胞转染 ,获得三种重组病毒 (rvBACC173 、rvBACC191和rvBACC2 15)用于表达分析。SDS -PAGE电泳和免疫印迹试验表明 ,昆虫细胞能够识别核心蛋白第 191和 192位氨基酸之间的切点并低效率切割 ;但不能够识别 173～ 191位之间的切点。间接免疫荧光试验表明 ,截断型核心蛋白C173 定位于细胞核内 ,而C191和C2 15则停留在细胞浆中。rvBACC173 感染的细胞在核内出现单一的“类晶体样结构” ,电子显微镜分析证实 ,这种结构是截断型核心蛋白大量转运并沉积在细胞核内形成的蛋白聚合体。试验结果还表明 ,第 173至 191之间的疏水性序列负性调节蛋白的表达 ,并且影响蛋白在细胞内的分布。间接ELISA实验证实 。

光敏剂亚细胞定位研究方法的应用比较

目的探讨不同光敏剂亚细胞定位方法的应用特点。方法应用电感耦合器材(CCD)荧光显微成像系统,选择细胞器荧光探针BODIPY标记细胞内高尔基体。分别采用直接观察法、伪彩色融合法、波形比较法、相关系数法及细胞器-细胞荧光强度比值法,对光敏剂血卟啉单甲醚(HMME)进行细胞内分布的定性与定量研究。结果采用直接观察法比较光敏剂和细胞器探针荧光图像,发现HMME和BODIPY的荧光分布模式有相似之处,采用伪彩色融合法得到的二者融合图像,显示存在黄色的空间重叠区域。应用波形比较法发现,直线路径上所有像素在HMME荧光图像与BODIPY荧光图像中的灰度值相对空间坐标的曲线波形相似。应用相关系数法得出,各像素的HMME荧光灰度值与细胞器探针荧光灰度值之间的相关系数值为0.6024。采用细胞器-细胞荧光强度比值法发现,随着参数m的增大,即细胞器聚集程度的降低,高尔基体聚集区域的平均荧光强度比值(J1/J2)呈下降趋势,二者具有明显的相关性(P<0.05)。结论通过直接观察、伪彩色融合及波形比较的方法,基本可以判定HMME在高尔基体聚集区域有分布;采用相关系数法,尤其是细胞器-细胞荧光强度比值法能得到更为精确的量化结果,以弥补定性方法的不足。