病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ N端肽调控SDF-1α/CXCR4诱导趋化机制

目的:评价病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN端肽(NT21MP)是否通过干扰SDF-1α/CXCR4信号抑制人乳腺癌细胞株SKBR3细胞的趋化作用。方法:以RT-PCR和免疫组化检测SKBR3和MCF-7两种人乳腺癌细胞中CXCR4的表达;用细胞转移实验检测在NT21MP存在或缺乏的情况下SDF-1α诱导SKBR3细胞的趋化作用;以Fluo3/AM为细胞内游离钙离子的荧光指示剂,用激光扫描共聚焦显微镜测定NT21MP对SDF-1α诱导SKBR3细胞内游离钙浓度的影响;Western blot分析ERK1/2和FAK蛋白的磷酸化水平变化。结果:相对于MCF-7细胞,SKBR3细胞中CXCR4蛋白表达水平较高;经SDF-1α处理后,SKBR3的迁移能力提高,CXCR4抑制剂AMD3100可有效抑制SKBR3细胞的迁移,细胞经NT21MP预处理后,可剂量依赖性地抑制SKBR3细胞的迁移(P<0.05);NT21MP也可抑制由SDF-1α诱导的细胞内Ca2+峰值(P<0.05),而钙离子浓度升高是SKBR3细胞迁移的重要信号之一;另外,相对于阴性对照组,NT21MP也可下调SDF-1α诱导的SKBR3中信号蛋白ERK1/2和FAK的磷酸化水平(P<0.05)。结论:NT21MP可抑制SDF-1α诱导的SK-BR3细胞的迁移,可能与其上游钙离子释放和ERK1/2及FAK磷酸化阻断信号有关。

重组病毒巨噬细胞炎性蛋白在大鼠体内的药动学及组织分布

目的了解重组病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP)在SD大鼠体内的药动学及组织分布。方法对vMIP进行碘标、分离纯化和鉴定,然后利用其进行药动学实验。采用同位素示踪法测量vMIP在SD大鼠体内的药动学,并检测其在大鼠组织中的分布。结果60,240μg·kg-12个剂量组(静脉注射给药)的主要药动学参数分别为ρmax(249·4±84·50),(887·01±204·22)μg·L-1;t1/2β(1·5±0·28),(2·65±0·85)h;AUC0-∞(136·0±40·70),(493·84±49·42)μg·h·L-1。tmax10·0min。结论vMIP进入大鼠体内主要分布在肝和肺,在体内消除较快,其动力学特征符合一级吸收二室开放模型。

病毒巨噬细胞炎性蛋白与趋化因子受体结合的效应分析

目的:探讨人疱疹病毒8 K6基因编码的产物病毒巨噬细胞炎性蛋白(viral m acrophage inflamm atory prote in,vM IP)是否具有结合趋化因子受体以及趋化作用。方法:受体配体交联试验检测vM IP与受体结合能力。趋化实验及细胞内钙流检测判断vM IP的生物学活性。结果:vM IP可与外周血单个核细胞(PBMCs)膜上的趋化因子受体结合,抑制hM IP-1α对PBMC的趋化能力,EC50为3.39 ng/m l。其本身只有较弱的趋化能力。钙流实验证实vM IP轻度升高胞内钙离子浓度,但可明显抑制hM IP-1α所引起的胞内钙离子高峰。结论:重组vM IP与hM IP-1α受体(CCR5)结合后,可有效的阻断人源性趋化因子的结合与信号传导,但其本身对细胞未有明显的激活作用,因此可作为趋化因子受体的天然阻断剂,可用于免疫移植中的排斥反应或H IV-1病毒感染等。

重组病毒巨噬细胞炎性蛋白抗SIVmac251的体外研究

目的研究重组病毒巨噬细胞炎性蛋白vMIP体外抗猴艾滋病毒SIVmac作用效果和机制。方法分别在SIVmac接种前后将敏感细胞系与重组vMIP作用,检测细胞系病变(CPE)情况和病毒滴度水平,培养上清P27抗原水平。结果先用重组vMIP处理过的细胞,病毒感染后细胞病变程度很轻,培养上清P27抗原和病毒滴度水平明显低于对照组,先感染病毒再用重组vMIP处理组,病毒P27抗原水平和细胞内病毒滴度水平也显著降低,但降低程度不如先用重组vMIP处理后感染病毒组。结论重组vMIP有明显的抑制病毒进入靶细胞和保护靶细胞免受病毒感染的作用,进入靶细胞的抑制作用强于对已感染细胞的病毒抑制作用;说明主要作用机制为阻止病毒进入靶细胞,同时可能也通过某种机制抑制细胞内SIVmac病毒的产生。

肝移植术后巨细胞病毒感染的诊治进展

巨噬细胞病毒（CMV）是一种带状疱疹病毒,与人类带状疱疹病毒6型和7型同为β带状疱疹病毒家族.在健康人群中,CMV广泛存在,但多不发病,然而,在脏器移植受体,CMV是唯一的条件致病病毒,对脏器移植有着直接或间接的影响.如不使用预防性抗病毒治疗,病毒感染的发生率为（45-100）%,但总体上只有（18～30）%的患者发病.……

病毒巨噬细胞炎性蛋白ⅡN-端肽对乳腺癌miRNAs表达谱的影响

目的:阐明病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(virus macrophage inflammatory protein-Ⅱ,v MIP-Ⅱ) N末端21个氨基酸的多肽(NT21MP)对乳腺癌MCF-7细胞miRNAs表达谱的调控作用。方法:收集各组细胞抽提RNA,RNA质量评估后逆转录成c DNA。采用染料法(SYBR GreenⅠ)进行相对定量分析,实验按照2-△△Ct解析法进行设计。结果:总共检测了168个miRNAs,以上调> 2倍或下调<0. 5倍筛选。相对于S组,N组升高的有9个:miR-223、miR-451a、miR-128、miR-489、miR-141、miR-320a、miR-155-3p、miR-335、miR-320e,降低的有2个:miR-15a、miR-339。结论:筛选得到NT21MP调控miRNAs差异表达谱,其为研究miRNAs在NT21MP调控中的作用机制提供依据。

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ的研究进展

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ（viral macro-phage inflammatory protein-Ⅱ,v MIP-Ⅱ）也称v CCL2,是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiency virus,HIV）感染者或移植病人用免疫抑制剂后卡波肉瘤的病原体卡波西肉瘤相关孢疹病毒,即人疱疹病毒-8 K4基因编码的小分子蛋白质,与人CC类趋化因子巨噬细胞炎性蛋白Ⅰ在氨基酸序列上有较高的同源性,是人趋化因子的类似物。

vMIP对细胞膜上趋化因子受体亲和力的结合特性研究

目的通过病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP)对外周血中单个核细胞(PBMC)膜上趋化因子受体结合的比较性研究,阐明vMIP与受体的结合能力。方法通过放射性配体受体结合实验,利用饱和实验、动力学实验和特异性分析,鉴定vMIP的受体结合能力。结果vMIP与人、食蟹猴PBMC膜上受体结合的Kd分别为11.1、14.3nmol/L,对趋化因子受体CCR5和CXCR4竞争结合的IC50分别为3.4、4.5nmol/L。结论提示了vMIP与膜上受体有较高的亲和力,并对CCR5和CXCR4具有高度特异性,可能对防治炎症及HIV1感染等具有重要意义。

SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测HIV-1前病毒方法的建立及应用

目的建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR技术测定HIV-1前病毒载量方法,并以其观察相关病毒进入抑制剂对HIV-1前病毒的作用。方法选择HIV-1的gag和env保守区域设计引物,建立SYBR Green I荧光定量PCR测定HIV-1前病毒载量的体系,并以其观察6μg/ml^6 ng/ml的重组病毒巨噬细胞炎症蛋白(rvMIP)、逆转录酶抑制剂(AZT)、膜融合抑制剂(T-20)、rvMIP+AZT、rvMIP+T-20对HIV-1前病毒载量的影响。结果所建立的荧光定量PCR体系的检测下限为101Copies,其标准曲线的相关系数为0.998 9,斜率为-4.925,截距为35.70;除6ng/ml的rvMIP、AZT、T-20外,三种药物处理后HIV-1前病毒载量均显著减小(P<0.05),并呈质量浓度依赖性;联合用药者前病毒载量显著低于单用rvMIP者(P<0.05),HIV-1前病毒载量rvMIP+T-20(rvMIP+AZT(rvMIP(T-20(AZT。结论本研究建立的SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法具有灵敏、快速、准确及成本低廉等优点;与T-20或AZT联用可增强rvMIP对HIV-1前病毒的抑制作用。

病毒趋化因子vMIP与卡波西肉瘤发病机制关系的研究进展

大量研究显示,人疱疹病毒8在卡波西肉瘤形成中具有重要作用,但其具体的致病过程不清楚。病毒巨噬细胞炎性蛋白(vMIP)是人疱疹病毒8编码的趋化因子,其参与了卡波西肉瘤的血管生成以及人疱疹病毒8感染、复制及免疫逃避等病理生理过程。该文就vMIP与卡波西肉瘤的关系进行综述,探讨vMIP在卡波西肉瘤发病机制中可能的作用。

vMIP-II对细胞表面趋化因子受体CXCR4内化及调变的研究

研究利用激光共聚焦显微镜和流式细胞仪分别定性、定量检测CXCR4的内化,观察vMIP-II对细胞表面趋化因子受体CXCR4内化的影响,用荧光分光光度计连续动态检测vMIP-II对细胞内钙离子浓度的影响,以阐明vMIP-II抗HIV/AIDS的作用机制。结果表明100 ng/ml vMIP-II在给药后的最初30 min能使细胞表面受体CXCR4内化达到最大值,内化率约为75%,且内化到细胞内的CXCR4并不能再循环到细胞表面。vMIP-II能诱导瞬间的高钙离子内流及细胞内钙离子库中钙离子的释放,证明了vMIP-II能引起细胞表面受体CXCR4的内化,内化的受体不再循环到细胞表面。

紫杉醇长循环纳米胶束联合vMIP-ⅡN端肽逆转乳腺癌细胞耐药的研究

目的:探讨紫杉醇长循环纳米载药胶束联合病毒巨噬细胞炎性蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)N端肽(NT21MP)对乳腺癌紫杉醇耐药细胞株(MCF-7/PR)耐药性的影响。方法:采用磺酰罗丹明B(SRB)染色法检测乳腺癌耐药细胞株MCF-7/PR的存活率;细胞划痕及Transwell实验检测紫杉醇纳米载药胶束联合NT21MP对乳腺癌耐药细胞迁移、侵袭能力的影响;流式细胞术分析细胞凋亡、周期;Western blotting实验检测细胞凋亡、耐药及上皮间充质转化相关蛋白水平表达。结果:相对于紫杉醇组,紫杉醇纳米胶束更有效地抑制细胞增殖、迁移和侵袭,凋亡蛋白Bax、caspase3的蛋白表达水平上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达水平下调,且耐药相关蛋白MRP、P-gp和EMT相关蛋白Vimentin、Slug表达水平下调,E-cadherin表达上调(P<0.01);相对于紫杉醇纳米胶束组,紫杉醇纳米胶束与NT21MP联合组对细胞增殖、迁移、侵袭、细胞周期的抑制,以及抗凋亡和逆转耐药作用更明显(P<0.01)。结论:紫杉醇纳米胶束可有效发挥逆转乳腺癌细胞耐药性的作用,且以紫杉醇纳米胶束联合多肽药物NT21MP作用更明显。

人巨细胞病毒单克隆抗体识别的抗原表位的筛选

目的找出人巨细胞病毒（ＨＣＭＶ）单克隆抗体识别的抗原表位以进行ＨＣＭＶ多肽疫苗的研制。方法通过链亲和素－生物素的作用将ＨＣＭＶ单抗固定在酶联板上，加入噬菌体随机六肽文库，经过三轮捕捉、洗脱、扩大培养的筛选过程，并逐轮增加冲洗强度，与ＨＣＭＶＭｃＡｂ具有亲合力的噬菌体得到了富集；从最后得到的三级库中，随机挑选１６个单克隆，测定其所携带的外源ＤＮＡ的序列，找出一致序列并进行同源性查询。结果１６个克隆中有１５个序列相同，５＇－ＡＧＴＧＣＴＧＧＴＴＧＧＧＣＴＴＣＴ－３＇，对应的氨基酸序列为Ｓｅｒ－Ａｌａ－Ｇｌｙ－Ｔｒｐ－Ａｌａ－Ｓｅｒ，此序列同源性查询结果显示与ＨＣＭＶ病毒膜糖蛋白ＵＬ０１有７８．８％的同源性，其中有４个氨基酸残基（ＡＧＷＡ）是完全相符的。结论所筛选到的六肽序列可能为ＨＣＭＶ抗原表位。

巨细胞病毒感染对骨髓造血细胞的免疫损伤作用

目的观察巨细胞病毒(CMV)感染对患者骨髓造血细胞的破坏作用及其临床意义。方法(1)通过ELISA方法检测30例CMV感染者治疗前后血清白细胞介素(IL)-17和γ干扰素(IFN-γ)水平,(2)用流式细胞仪(FACS)检测外周血淋巴细胞亚群比例,(3)针吸细胞学观察颈部淋巴结细胞学,(4)细胞免疫化学、免疫荧光染色,观察骨髓造血微环境中免疫细胞释放POX、人类白细胞抗原(HLA-DR)、IL-17A和IFN-γ表达状态。健康查体人群血清标本作为对照,无感染的缺铁性贫血患者骨髓涂片作为骨髓免疫染色比较。结果(1)患者血清IL-17和IFN-γ水平明显升高,[分别为IL-17(48.23±3.86)ng/L与(20.16±1.05)ng/L;IFN-γ(40.16±3.11)与(8.17±1.92)ng/L P<0.01]。(2)患者CD16^+/CD56^+NK细胞比例显著升高,[(43.54±6.01)%与(14.01±3.25)%,P<0.01],CD3^+CD4^+T和CD3^+CD8^+T细胞比例减少,[分别为(20.91±5.15)%与(35.10±4.88)%,(15.41±5.13)%与(25.11±3.92)%,P<0.05]。(3)骨髓和淋巴结中可见到较多异常淋巴细胞和体积巨大、吞噬大量CMV包涵体的巨噬细胞(MΦ)。CMV可感染破坏骨髓中各系造血细胞,活化的MΦ还能吞噬CMV感染病变的血细胞。(4)骨髓造血微环境中活化的MΦ释放POX呈强阳性,高表达Ⅱ类分子HLA-DR、炎性因子IL-17A和IFN-γ。(5)22例白细胞升高者经更昔洛韦联合抗生素治疗2周后,其中16例感染灶消失,WBC计数和CMV-IgM水平降至正常;6例CMV未转阴者,病情迁延,粒细胞和(或)血小板计数降至正常范围以下。另14例入院时粒细胞或血小板计数减少,CMV-IgM下降缓慢,更昔洛韦治疗长达4周以上。结论CMV可通过血液感染骨髓有核血细胞和有丰富细胞器的血小板破坏造血。MΦ具有双重性,既吞噬CMV病毒和病毒感染的血细胞,又能释放POX、IL-17A和IFN-γ等炎性因子,介导骨髓炎症反应。

病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ在毕赤酵母中的表达及其抗HIV-1活性

目的在毕赤酵母中表达病毒巨噬细胞炎性蛋白-Ⅱ(Viral macrophage inflammatory protein-Ⅱ,vMIP-Ⅱ),并检测其抗HIV-1活性。方法通过PCR技术从质粒pQE-vMIP-Ⅱ中扩增vMIP-Ⅱ基因,插入酵母表达载体pPICZaA中,构建表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ,转化毕赤酵母菌X33,甲醇诱导表达。表达产物经镍离子亲和层析和分子筛层析纯化后,进行Western blot鉴定,并检测重组vMIP-Ⅱ蛋白对HIV-1诱导的细胞合胞体形成的抑制作用。结果重组表达质粒pPICZaA-vMIP-Ⅱ经酶切及测序鉴定证明构建正确;表达的重组vMIP-Ⅱ蛋白的相对分子质量约为8 500,以分泌形式表达于重组酵母菌的发酵上清中;纯化的重组蛋白纯度达97.3%,且可与HRP标记的vMIP-Ⅱ多克隆抗体发生反应;重组vMIP-Ⅱ蛋白组的合胞体数目明显少于阳性对照组(P﹤0.05),其IC50值为1.35 ng/ml。结论已成功在毕赤酵母中表达了重组vMIP-Ⅱ蛋白,其具有较强的抑制HIV-1的活性。

荧光定量PCR法研究重组病毒巨噬细胞炎症蛋白联合用药体外抗HIV-1的作用

目的建立荧光定量PCR技术测定HIV-1病毒载量的方法 ,并用于研究重组病毒巨噬细胞炎症蛋白(rvMIP)联合用药前后的病毒载量变化。方法选择HIV-1的gag和env保守区域设计引物,建立荧光定量PCR测定HIV-1病毒载量的体系。分别设置rvMIP、AZT、T-20、rvMIP+AZT、rvMIP+T-20 5个不同用药组,运用荧光定量PCR法检测用药后各组病毒载量的变化。结果所建立的荧光定量PCR体系的检测下限为101拷贝,其标准曲线的相关系数为0.997 4,斜率为-2.524,截距为29.716;除了浓度6 ng.mL-1的rvMIP组、AZT组、T-20组外,各用药组病毒载量值与阳性对照均有差别,且随药物浓度增加,病毒载量逐渐减小。各相同浓度用药组病毒载量相比,rvMIP+T-20组(rvMIP+AZT组(rvMIP组(T-20组(AZT组。结论所建立的荧光定量PCR检测体系可靠;rvMIP与T-20或AZT联用可以增强rvMIP对HIV-1病毒的抑制作用。

病毒巨噬细胞炎症蛋白vMIP-Ⅰ和vMIP-Ⅱ在Kaposi＇s肉瘤患者中的表达及意义

目的 初步探明KSHV编码的病毒巨噬细胞炎症蛋白vMIP-Ⅰ和vMIP-Ⅱ在新疆经典型Kaposi＇s sarcoma（KS）患者的肉瘤组织、血液、唾液和尿液中的表达情况.方法 对8例新疆经典KS患者的新鲜冰冻肉瘤组织、血液、唾液和尿液标本进行基因组DNA提取,应用PCR扩增各标本中的vMIP-Ⅰ和vMIP-Ⅱ基因.结果 8例新疆经典型KS患者的肉瘤组织、血液、唾液和尿液中均获得较好的基因组DNA;同时8例组织标本全部扩增出vMIP-Ⅰ、vMIP-Ⅱ基因,但是8例患者的血液、唾液和尿液标本都未出现vMIP-Ⅰ和vMIP-Ⅱ基因表达.结论 新疆经典型KS患者肉瘤组织中均检测到vMIP-Ⅰ和vMIP-Ⅱ基因片段的表达,为深入研究卡波氏肉瘤的血管形成机制提供初步的依据.

病毒巨噬细胞炎症蛋白-Ⅱ对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化样蛋白3G和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白表达的影响

目的:明确病毒巨噬细胞炎症蛋白-II(viral macrophage inflammatory protein-II,vMIP-II)对HIV-1抑制因子:载脂蛋白BmRNA编辑酶催化蛋白3G(apolipoproteon B mRNA-editing catalytic polypeptide-3G,APOBEC 3G)和正常T细胞表达分泌的调节活化蛋白(regulated upon activation normal T expressed and secreted,RANTES)表达的影响。方法:构建vMIP-II真核表达载pEGFP-N3-vMIP-II,分别采用电穿孔和脂质体转染的方法将其转染至Jurkat和293T细胞。荧光定量PCR检测vMIP-II基因对Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES表达水平的影响。结果:测序结果显示成功构建了的vMIP-II真核表达载体,荧光显微镜观察估计转染效率达到50%左右。与空载体组相比较,转染pEGFP-N3-vMIP-II组的Jurkat细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调4.97倍和7.31倍,293T细胞内的APOBEC3G和RANTES分别上调为5.73倍和8.14倍。结论:vMIP-II基因不同程度的上调了Jurkat细胞和293T细胞内的抗艾滋病基因APOBEC3G和RANTES的表达。

病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ对293T细胞APOBEC3G表达的影响

目的探讨病毒巨噬细胞炎症蛋白Ⅱ(vMIP-Ⅱ)对载脂蛋白B mRNA编辑酶催化多肽样蛋白3G(APOBEC3G)表达的影响及其机制。方法转染vMIP-Ⅱ质粒(vMIP-Ⅱ质粒组)、空质粒(空质粒组)至293T细胞。定量PCR和Western 印迹法分析转染vMIP-Ⅱ基因对293T细胞APOBEC3G表达的影响。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组细胞分别加入1 000 IU/ml干扰素α(IFN-α),培养36 h后,Western印迹法检测空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G的蛋白水平。对转染vMIP-Ⅱ质粒的293T细胞,分别用75 μmol/L JAK/STAT信号通路抑制剂AG490和20 μmol/LERK信号通路抑制剂U0126处理,24 h后收集细胞总蛋白,Western印迹法检测APOBEC3G蛋白水平。构建包含APOBEC3G启动子的荧光素酶报告基因重组质粒,启动子片段包括APOBEC3G全长启动子序列(POS)与长度1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp序列及APOBEC3G启动子序列中不含调控元件的区域(NEG),将荧光素酶报告基因重组质粒和vMIP-Ⅱ质粒共转染293T细胞为实验组,以与空质粒共转染的293T细胞为对照,检测APOBEC3G启动子活性,分析vMIP-Ⅱ调控APOBEC3G转录活性的关键启动子作用区域。统计学比较采用t检验、单因素方差分析、LSD-t检验。结果 vMIP-Ⅱ转染组APOBEC3G mRNA、蛋白水平(2.500 ± 0.013、1.472 ± 0.013)均高于对照组(1、0.364 ± 0.030,t值分别为 6.22、6.54,均P < 0.05)。空质粒组、vMIP-Ⅱ质粒组、空质粒+ IFN-α组、vMIP-Ⅱ质粒+ IFN-α组APOBEC3G水平(分别为1、2.030 ± 0.108、2.700 ± 0.081、2.600 ± 0.099)差异有统计学意义(F = 67.026,P < 0.001),vMIP-Ⅱ质粒组与空质粒+ IFN-α组差异无统计学意义(t = 3.46,P > 0.05)。vMIP-Ⅱ质粒组、vMIP-Ⅱ质粒+ AG490组、vMIP-Ⅱ质粒+ U0126组APOBEC3G水平(0.617 ± 0.025、0.179 ± 0.061、0.359 ± 0.012)差异有统计学意义(F = 70.019,P < 0.001),后两组均低于vMIP-Ⅱ质粒组(t值分别为9.66、11.836,P < 0.01)。荧光素酶活性检测显示,转染了POS、1 560、960、720、480、420、360、330、240 bp及NEG序列的vMIP-Ⅱ质粒组启动子活性差异有统计学意义(F = 81.092,P < 0.001),从720 bp片段至480 bp片段,APOBEC3G启动子活性降低幅度巨大。结论 vMIP-Ⅱ上调APOBEC3G的表达,可能是通过JAK/STAT信号通路或作用于APOBEC3G转录活性的关键启动子区域。

PCR在定量测定和基因分离中的应用

如果是理想的条件.在1个半小时左右就能将特定的 DNA 片段扩增到100万倍的聚合酶链反应技术正被迅速扩大其应用范围.现在。PCR 法不仅用于医药系统也是农艺化学领域和工程的研究对象.这些方面的最新成果已在今春的学会上加以报道.