神经细胞微团法检测化学物的致畸作用

神经细胞微团法检测化学物的致畸作用席小平，李建国，郭琳，贾继峰山西省卫生防疫站（太原０３００１２）大鼠胚胎中脑神经细胞微团培养（简称微团法），这一体外测试系统筛选化学物的致畸作用，国内外报道其测试结果可靠性达９０％［１］。我们对已知致畸物维生素Ａ（Ｖ...

大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验检测化学物的致畸作用

大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验检测化学物的致畸作用席小平，李建国，郭琳，贾继峰（山西省卫生防疫站毒理科太原０３００１２）大鼠胚胎中脑神经细胞微团试验（简称微团法），国内开展单位尚不多。我们在本实验室建立了该法，并用已知的致畸物维生素Ａ、乙酰水杨酸进行了...

肺癌细胞微团的低温保存实验

细胞微团、细胞聚集体所构建的三维细胞模型在肿瘤研究领域中逐渐成为更合适的体外研究模型,但目前对于细胞微团的低温保存方法尚不完善。本文研究了A549肺癌细胞的接种密度以及培养天数对肺癌细胞微团尺寸及生长状态的影响,结果表明:接种密度为2×104个/mL,培养三天的肺癌细胞微团状态良好,可形成致密的结构,微团直径为344.24μm±0.74μm,最适用于低温保存。采用程序降温盒、程控降温仪两种慢速冷冻法低温保存肺癌细胞微团,复苏后细胞微团活力和增殖率远低于新鲜组;使用塑料麦管和玻璃毛细管快速或玻璃化保存肺癌细胞微团,当采用玻璃毛细管为冷冻载体,以含有20%EG+20%Me 2SO+0.5 mol/L海藻糖的DMEM作为低温保护剂时,复苏后细胞微团相对新鲜组活力为94.59%±9.23%,三天增殖率与新鲜组最为接近。最后,对冷冻载体的降温速率以及保护剂的临界降温速率进行测定,分析了细胞微团低温保存的热力学机理。

鸡胚背根节神经细胞微团悬滴培养法的建立及应用

采用神经细胞微团悬滴培养法培养Hamburger35期鸡胚背根节 (dorsalrootganglion ,DRG)神经元 .结果 ,神经元于培养 2 4h后开始生长 ,5～ 8d神经突起联成网状 ,说明本法可行 .该法为今后进一步探讨神经营养因子对培养神经元存活、生长的影响奠定了基础 .

玻璃酸钠及胎盘间充质干细胞和诱导的软骨细胞膝关节腔内注射:修复膝骨关节炎

背景:胎盘间充质干细胞已被证实具有较强的增殖能力,能向神经细胞、血管内皮细胞、表皮细胞以及胰岛样细胞等诱导分化,但向软骨细胞诱导分化并修复膝骨关节的研究不多。目的:人胎盘间充质干细胞体外诱导软骨细胞膝关节腔内注射修复兔膝骨关节炎,并比较璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射的修复效果。方法:1选新西兰大白兔制作骨关节炎模型,左后肢膝关节炎造模后石膏固定5.5周,镜下观察关节软骨情况。2利用Ⅳ型胶原酶消化分离培养人胎盘间充质干细胞,流式细胞仪检测细胞表面标志物,证实为胎盘间充质干细胞。取第3代胎盘间充质干细胞进行实验,将胎盘间充质干细胞加入软骨诱导培养基向软骨细胞分化,倒置显微镜观察结果。3将大白兔随机分成玻璃酸钠膝关节腔内注射组、胎盘来源间充质干细胞膝关节腔内注射组和诱导软骨细胞膝关节腔内注射组,分别给予膝关节腔内注射,连续5周取膝关节软骨镜下观察,比较软骨修复情况。结果与结论:体外诱导培养的人胎盘间充质干细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,显示人胎盘间充质干细胞可以分化为软骨细胞。苏木精-伊红染色镜下观察发现,各组兔膝关节软骨细胞均有修复,诱导软骨细胞膝关节腔内注射后兔膝关节软骨修复情况较好,优于玻璃酸钠和胎盘间充质干细胞膝关节腔内注射组。

稳恒磁场对体外胚胎中脑神经元细胞分化影响的研究

本文利用大鼠胚胎中脑神经细胞作原代微团培养，培养物经不同强度（分别为５ ｍ Ｔ，１０ ｍ Ｔ，２０ｍ Ｔ，３０ ｍ Ｔ，４０ ｍ Ｔ，５０ ｍ Ｔ和６０ ｍ Ｔ）的稳恒磁场作用，研究其对细胞生长和分化的影响，并利用图像分析细胞形态的变化。结果表明：各种强度的稳恒磁场能明显地抑制中脑神经细胞的分化，集落形成率明显减少，且细胞表面的突起和集落间的神经纤维束减少。

胎盘来源间充质干细胞的体外诱导成软骨分化

背景:胎盘间充质干细胞已被证实有较强的增殖能力,且能向成骨细胞、成神经细胞、类肝样细胞等诱导分化,但对其成软骨细胞诱导分化的研究不多。目的:在体外诱导人胎盘间充质干细胞成软骨细胞分化。方法:体外培养人胎盘间充质干细胞并鉴定。取第3代胎盘间充质干细胞,调整细胞悬液浓度为1.6×1010 L-1,在24孔板中央分别滴5,10,15μL细胞悬液,培养2 h(目的是形成微团);然后加入间充质干细胞培养基或软骨诱导培养基培养14 d,阿利新蓝染色,进行大体观察及倒置显微镜观察。结果与结论:应用间充质干细胞培养基培养的对照组,细胞增殖形成大量贴壁细胞,贴壁细胞具有典型的间充质细胞形态;应用软骨诱导培养基培养后,细胞只保持微团,不继续增殖形成贴壁细胞,微团基部无贴壁细胞,随着接种细胞数量的增加,微团直径增大。说明人胎盘来源间充质干细胞具有向软骨细胞分化的能力,可作为组织工程、细胞治疗等应用的种子细胞来源。

同型半胱氨酸对大鼠胚胎肢芽细胞增殖和分化的影响

目的 进一步研究同型半胱氨酸(HCY)的致畸性及作用机制。方法 应用大鼠胚胎胚芽细胞微团培养法了解HCY对胚胎胚芽细胞增殖和分化的影响。结果 随着剂量的增加,HCY表现了对胚胎肢芽细胞的促进和抑制双相作用。半数抑制分化浓度(IC_(50))是5.0mmol/L,当加入S9时,IC_(50)减至3.5mmol/L;半数抑制增殖浓度是9.5mol/L,当加入S9时,IC_(50)为5.8mmol/L。结论 HCY对胚胎细胞分化的影响更为显著,对大鼠致畸作用不明显。

牛磺酸对维生素A致胎鼠中脑细胞分化抑制的保护作用

目的：进一步探讨牛磺酸在神经细胞分化中的作用。方法：采用胎鼠中脑神经元细胞微团培养物的方法，观察牛磺酸对维生素Ａ引起的神经细胞分化抑制是否具有保护作用。结果：同时加入牛磺酸和维生素Ａ组微团细胞集落数要较单独加入维生素Ａ的集落数多，而单独加入牛磺酸组微团集落数也多且微团之间的束状联接较多。结论：牛磺酸本身有促进神经细胞分化的作用，对维生素Ａ引起的细胞分化抑制可起保护作用。

胚胎毒性体外试验的研究进展

胚胎毒性体外试验已广泛应用于胚胎生殖发育毒物筛选和致畸机制研究等方面,现已有三十余种不同类型的毒性测试方法。欧洲替代方法研究中心推荐的有效性较高的3个胚胎毒性体外筛选试验,即体外全胚胎培养试验、胚胎细胞微团培养试验和胚胎干细胞试验具有良好的应用价值,就以上试验的研究方法、应用价值及研究进展综述。

中药生殖毒性体外实验研究进展

生殖毒性作为中药学重要研究内容之一,是中药安全性研究的重要组成部分。目前对中药生殖毒性研究评价主要采用国内外新药临床前安全性评价指南所推荐的三阶段试验,然而存在费用高、实验周期长等缺点。欧洲替代方法研究中心(ECVAM)所推荐的胚胎干细胞试验、胚胎细胞微团培养试验及全胚胎培养试验等体外替代试验已应用于中药生殖、胚胎毒性的研究。该文就中药单体或复方生殖毒性体外试验评价的现状,对体外替代试验方法及其优缺点、必要性等进行了讨论。

新型环氧合酶-2抑制剂Ia-10和Ib-10的生殖毒性的早期评价

目的化合物Ia-10和Ib-10为我所研发的一类全新的化合物,拟开发为一类环氧合酶-2(COX-2)抑制剂类非甾体类抗炎药。本研究采用体外替代方法,评价该新型COX-2抑制剂类化合物的潜在生殖毒性,初步评价其开发前景。方法采用原代微团培养法培养大鼠胚胎中脑神经细胞,分别采用中性红吸收法和微团集落计数法,观察化合物Ia-10、Ib-10、已上市COX-2抑制剂赛来昔布以及生殖毒性阳性对照药羟基脲暴露后对细胞增殖和分化的影响,计算受试物对中脑神经细胞微团的半数增殖抑制浓度(IV50)和半数分化抑制浓度(ID50),并根据IV50与ID50的比值R来评价化合物的潜在生殖毒性(R>2.0,化合物具有潜在生殖毒性;R<2.0,化合物无潜在生殖毒性)。结果化合物Ia-10对中脑神经细胞微团的IV50为31.48μg/ml,ID50为8.76μg/ml(R=3.59);化合物Ib-10的IV50为35.46μg/ml,ID50为23.55μg/ml(R=1.51);COX-2抑制剂赛来昔布的IV50为28.89μg/ml,ID50为36.55μg/ml(R=0.79);阳性药羟基脲的IV50为6.64μg/ml,ID50为2.52μg/ml(R=2.63)。结论根据R值进行判断,阳性药物羟基脲具有生殖毒性,赛来昔布无潜在的生殖毒性;化合物Ia-10具有潜在的生殖毒性,而化合物Ib-10无潜在生殖毒性,提示具有市场开发前景。

生长分化因子-5影响肢芽细胞分化的机制

目的研究生长分化因子-5(growthdifferentiatifoanctor-,5GDF-5)对肢芽细胞分化的影响机制及在骨形成过程中的作用机制。方法取妊娠第12d胎鼠肢芽,行肢芽细胞微团培养,以不同浓度(0ng/ml、10ng/ml、50ng/ml、100ng/ml、120ng/ml)重组鼠GDF-5,干预培养中的肢芽细胞。于细胞培养第1d、3d,用扫描电镜观察不同浓度GDF-5对肢芽细胞生长与分化的影响。于细胞培养第3d,采用免疫组织化学和实时定量PCR等方法观察GDF-5对肢芽细胞核结合转录因子(Cbfa1)与Ⅹ型胶原蛋白表达的影响。结果在细胞培养第1d,扫描电镜观察结果显示,GDF-5可使肢芽细胞连接更为紧密,高浓度GDF-5组有成熟软骨基质和软骨结节形成,低浓度组也有软骨结节形成,该效应与GDF-5浓度呈正相关。在细胞培养第3d,免疫组织化学检测结果显示,Ⅹ型胶原蛋白表达以120ng/ml浓度组最为广泛和强烈,0ng/ml浓度组表达最弱,其表达趋势接近于Cbfa1的表达,表明GDF-5有促进肢芽细胞向成熟软骨方向分化的作用。实时定量PCR结果显示,GDF-5在mRNA水平同样促进Cbfa1表达,其促进作用呈剂量依赖效应。结论GDF-5通过上调Cbfa1和Ⅹ型胶原蛋白表达的途径促进肢芽细胞向软骨分化和促进骨形成。

中药生殖毒性研究思路和方法

中药生殖毒性研究是中药安全性研究的重要组成部分。与传统中医理论中妊娠禁忌不同,现代所说的中药生殖毒性不仅包括药物致流产、胎儿死亡,还包括药物对受胎能力、生殖系统、胚胎发育及胎仔出生后发育的潜在不良影响,以及药物诱导畸胎产生的可能性。目前的中药生殖毒性评价主要采用国内外新药临床前安全性评价指南推荐的三阶段生殖毒性试验。此外,全胚胎培养、胚胎干细胞试验等体外替代胚胎毒性评价方法也用于在中药胚胎毒性评价。本文结合传统中医药特点就现代中药生殖毒性研究进展和中药新药生殖毒性评价方法等内容进行综述。