抑制差减杂交方法筛选辐射诱导细胞恶性转化模型中的差异表达基因

目的：筛选辐射诱导的支气管上皮细胞恶性转化模型中的差异表达基因。方法：应用抑制差减杂交方法（SSH）构建辐射诱导的细胞转化模型差异表达基因的cDNA文库。对差减文库进行PCR筛选，对得到的差异片段进行测序及BLAST分析；对部分筛选出来的差异表达基因使用荧光定量PCR方法检测并确认其变化；将新的序列表达标签（EST）登录到Gen-Bank上。结果：在80个进行测序的克隆中，得到确定序列的共73个。在转化细胞中表达下降的序列41条，BLAST比较分析结果：得到已知序列6条；未知基因的EST序列20条；空载体序列7条；8条为重复测定序列。在转化细胞中表达上升的序列32条，BLAST分析：已知序列14条；未知基因的EST序列9条；重复测定的序列9条。对其中的部分基因改变进行荧光定量PCR检测，结果表明辐射转化组中MY06、HACE1、ZNF143、HNRPH1的表达量明显增加（与对照组相比，转化组中的mRNA分别增加了3．49、29．38、12．99、5．00倍）；而PCBP2、RPL15、TCERG1的表达量下降（与对照组相比，转化组中的mRNA分别减少了1．89、48．77、11．95倍）。将得到的29个未知序列登录到GenBank，序列ID：EB643220～EB643248。结论：利用抑制差减杂交方法成功建立了恶性转化细胞模型差异表达cDNA文库，包含大量功能未知的新基因；ZNF143表达增加，其与细胞的增殖与分裂有关，TCERG1作为转录辅助激活因子在mRNA转录和后期的修饰过程中起到重要的作用，PCBP2是一个Polyc连接蛋白，具有蛋白翻译调节功能，这些基因在辐射致癌中尚无研究报道。

MNNG和佛波酯诱导建立结肠癌的恶性转化细胞模型

目的建立结肠癌的恶性转化细胞模型。方法以1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)为启动剂、佛波酯(PMA)为促癌剂,对永生化的正常人结肠上皮细胞(NCM460细胞)进行多代诱导处理。采用MTT实验、细胞克隆形成实验和细胞划痕实验鉴定NCM460细胞恶性转化的倾向性和恶性生物学特征,采用Western blot检测神经钙黏附蛋白(N-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)和表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白表达水平。结果正常NCM460细胞形态为梭形,排列有序,呈单层生长;诱导后的第30代NCM460细胞形态发生显著变化,大小不一,排列紊乱,呈团块状生长。正常NCM460细胞、第17代NCM460细胞、第30代NCM460细胞的增殖能力依次升高,克隆形成数量依次增多,48 h迁移距离和迁移率依次增加或升高(P<0.05)。第30代NCM460细胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1的蛋白表达水平高于正常NCM460细胞(P<0.05)。结论经过MNNG和PMA连续多代诱导处理后,NCM460细胞的生物学功能(增殖、克隆形成和迁移能力)发生明显改变,具备恶性细胞的生物学特征。该模型可用于结肠癌的发病机制和治疗方法研究。