阿托伐他汀对高血压患者血管内皮细胞损伤修复及PERK、IRE1α、BiP、Ero1-Lα蛋白表达的影响

目的探讨阿托伐他汀对高血压患者血管内皮细胞损伤修复及PERK、IRE1α、Bi P、Ero1-Lα蛋白表达的影响。方法 88例高血压患者通过随机数表法分为研究线和对照组各44例。对照组采用高血压基础干预措施,研究组在对照组干预基础上加用阿托伐他汀,两组均持续治疗2个月。对比两组临床疗效,分析治疗前后两组内质网应激(ER stress)标记蛋白(Ero1-Lα、Bi P、IRE1α、PERK)、血管内皮功能指标[内皮素(ET)、一氧化氮(NO)、肱动脉血流介导血管扩张率(FMD)]、血清炎症因子[白细胞介素(IL)-6、肿瘤坏死因子(TNF)-α、高敏C反应蛋白(hs-CRP)]水平变化。结果研究组总有效率高于对照组(P<0.05);治疗前两组Ero1-Lα、Bi P、IRE1α、PERK光密度值对比无明显差异(P>0.05),治疗后两组各指标水平较治疗前降低,且研究组均低于对照组(均P<0.05);治疗前两组ET、NO、FMD水平比较无明显差异(P>0.05),治疗后两组各指标水平较治疗前改善,且研究组ET水平低于对照组,NO、FMD水平高于对照组(P<0.05);治疗前研究组IL-6、TNF-α、hs-CRP水平与对照组比较无明显差异(P>0.05),治疗后两组炎症因子水平均降低,且研究组均低于对照组(P<0.05)。结论采用阿托伐他汀治疗高血压患者可有效降低PERK、IRE1α、Bi P、Ero1-Lα蛋白及血清炎症因子表达水平,促使血管内皮细胞损伤修复,提高治疗效果。

槐米及其不同成分对内皮细胞损伤修复作用比较研究

目的:比较研究芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物对高糖诱导的内皮细胞损伤的修复作用。方法:采用含有33mmol·L-1葡萄糖和1%FBS的DMEM低糖培养基处理人脐静脉HUVEC内皮细胞,建立细胞损伤模型,采用NO试剂盒检测各样品对模型内皮细胞NO分泌量的影响;采用MTT法测定细胞活力。结果:芦丁、槲皮素、槐米黄酮部位和槐米药材提取物均可不同程度地升高模型HUVEC内皮细胞NO分泌量,不同程度地增强细胞活力。结论:芦丁和槲皮素可能为槐米修复内皮细胞损伤的活性成分。

论“阴阳自和”与机体内环境稳态、细胞损伤修复的关系

"阴阳自和"最早由张仲景在《伤寒论》中提出,向后人阐释了人体具有自愈的能力;另总结出"阴阳自和"乃疾病自愈的根本原因。而现代医学同样从微观认识到细胞、组织损伤发生的早期阶段可通过自我调节机制(细胞损伤修复)来维持机体内环境的稳定,从而不表现出明显的"疾病"结果,达到"阴平阳秘";而当损伤超出细胞、组织的自我修复能力时,引起细胞、组织的变性,最终导致机体内环境的波动,乃至紊乱。由此可见,中医理论与现代医学在对疾病发生本质的认识上有异曲同工之妙。

血管内皮祖细胞动员在损伤血管修复中的作用及调控因素

骨髓内皮祖细胞是存在于骨髓的内皮前体细胞 ,目前已经证实外周血极少量的血管内皮祖细胞来源于骨髓。骨髓内皮祖细胞受内源性和外源性因素刺激 ,可动员而增量进入外周血 ,参与血管再生及损伤血管的再内皮化。深入研究内皮祖细胞的动员和调控因素 ,探明其在损伤血管修复中的作用 ,对治疗以血管内皮损伤为共同特点的疾病具有重要意义。

缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制

背景:建立人肝细胞体外缺氧再给氧损伤模型,模拟移植器官缺血再灌注损伤,从细胞分子水平探讨缺血再灌注所致纤维形肌动蛋白微丝损伤的机制,目前尚无相关研究报道。目的:分析缺氧再给氧对肝细胞膜纤维形肌动蛋白微丝损伤的分子机制。方法:建立体外大鼠肝细胞缺氧再给氧模型。肝细胞随机分为正常对照组、缺氧再给氧组。缺氧再给氧组又分为缺氧再给氧2 h、缺氧再给氧4 h、缺氧再给氧6 h组(分别为细胞缺氧3 h后再给氧2,4,6 h)。光镜观察细胞形态,电镜观察超微结构的改变,共聚焦激光显微镜观察纤维形肌动蛋白微丝含量变化,Real-time PCR检测HSP27、丝切蛋白基因的转录水平,Western blot检测HSP27、丝切蛋白蛋白的表达水平。结果与结论:光镜下缺氧再给氧各组梭形细胞显著增多,且脱落细胞明显增多;透射电镜下缺氧再给氧组与对照组相比内质网数量明显减少,线粒体密度深,糖原消失;共聚焦激光显微镜可见缺氧再给氧组纤维形肌动蛋白纤维荧光紊乱,形态明显改变,荧光染色明显减弱,平均荧光强度缺氧再给氧各组明显低于对照组(P<0.05);Real-time PCR和Western blot检测H/R各组HSP27、丝切蛋白基因转录和蛋白表达水平显著低于正常对照组(P<0.05)。表明缺氧再给氧可能是通过抑制肝细胞内HSP27、丝切蛋白的蛋白表达和基因转录,从而影响纤维形肌动蛋白微丝的正确装配以及减弱纤维形肌动蛋白的正常循环,进而改变纤维形肌动蛋白微丝骨架。

气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤动物模型的建立

背景:随着中医药对耳鸣耳聋的疗效越来越受到重视,但对其机制尚缺乏系统深入的研究,利用动物模型进行中医药治疗耳鸣耳聋的机制探索是非常有意义的研究方向。目的:建立一种气虚血瘀证型的Corti器毛细胞损伤动物(豚鼠)模型并评价其效果。方法:12只成年豚鼠按随机数字表法分为正常对照组和造模组。造模组首先采用改良耗气破气加饥饱失常法处理15 d进行气虚造模,之后以光化学反应法复制血瘀Corti器毛细胞损伤模型;正常对照组不干预。造模后检测两组豚鼠血清的D-木糖浓度,行耳声发射DPOAE测试,并观察光镜下耳蜗组织形态。结果与结论:(1)与正常对照组相比,造模组血清D-木糖浓度较低(P<0.01);(2)耳声发射DPOAE测试结果显示,造模组1 560,3 125 Hz DPOAE幅值较正常对照组及造模前降低(P<0.01);(3)造模组耳蜗组织形态发生变化:螺旋韧带、基底膜微血管及蜗轴毛细血管内有血管扩张、微血栓形成,血管纹水肿变性;Corti器内毛细胞变性、坏死或缺失;(4)提示:模型成功模拟了豚鼠气虚血瘀型Corti器毛细胞损伤的过程,未来可应用于中医药治疗耳鸣耳聋特别是突发性耳聋的机制研究。

木通皂苷D对人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用研究

目的探究木通皂苷D(以下简称ASD)对人脐静脉内皮细胞损伤的保护作用。方法采用H2O2诱导ECV304细胞损伤模型。以MTT法测定损伤细胞的活力;采用ELISA法检测内皮细胞外液中纤溶酶原活化物抑制剂(PAI-1)和血管性血友病因子(v WF)浓度变化。结果ASD的各个剂量组均具有极显著性提高受损细胞活力的作用(P<0.01);且ASD高剂量组能使细胞外液中v WF和PAI-1浓度极显著性降低(P<0.01)。结论 ASD对ECV304损伤细胞具有极显著性的保护作用,此作用使细胞外液PAI-1和v WF浓度降低,从而相对提高内皮细胞纤溶功能和抑制血小板的聚集,上述指标对治疗心脑血管疾病具有重大意义。

侧柏叶提取物对SOD酶活力修复作用及抗炎功效

为探索侧柏叶提取物对细胞损伤的修复作用及抗炎功效,采用SDS刺激HaCaT细胞和LPS诱导RAW264.7细胞构建炎症模型。随后加入侧柏叶提取物,观察其对SDS致HaCaT细胞损伤后的SOD酶活力修复作用及对RAW264.7细胞上清中炎症因子分泌的抑制作用。结果表明,SDS刺激HaCaT细胞后,能够对细胞造成一定损伤,并致使细胞内SOD酶活力降低,随后加入侧柏叶提取物,其对SOD酶活力有修复作用,最高修复率为85.6%,表明侧柏叶提取物具有修复SOD酶活力功效。同时LPS诱导RAW264.7细胞,构建炎症模型成功后,随后加入侧柏叶提取物,其对RAW264.7细胞上清NO含量具有降低作用,同时,能够抑制IL-6,IL-1β和TNF-α炎症因子的释放,表明侧柏叶提取物具有抗炎功效。

阳离子化牛血清白蛋白诱导膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白的表达

背景:膜性肾病动物模型可模拟人类膜性肾病的发病机制,对疾病的研究具有重要意义。目的:观察膜性肾病模型大鼠足细胞相关蛋白nephrin、podocin的表达,以探讨其与膜性肾病发病的关系。方法:将40只SD大鼠随机分为模型组和对照组,每组20只。模型组取阳离子化牛血清白蛋白1 mg溶解于0.5 mL生理盐水中与等量不完全弗氏佐剂充分乳化后在颈背部皮下多点注射预免疫1周后正式免疫,尾静脉给予阳离子化牛血清白蛋白16 mg/kg,隔日1次,持续4周。对照组尾静脉注射等体积生理盐水。造模后第2,4周进行生化指标检测和病理学检查,RT-PCR法检测肾组织中nephrin和podocin mR NA的表达。结果与结论:(1)模型组24 h尿液总量明显减少,且出现了明显的蛋白尿,血清肌酐、尿素氮、胆固醇、三酰甘油水平显著升高,血清白蛋白水平显著降低,与对照组比较差异有非常显著性意义(P<0.01),且随着病变继续发展,病情加重;(2)病理检测发现模型组有不同程度肾小管扩张,肾小球基底膜增厚,系膜细胞及基质增生,呈典型的膜性肾炎改变;(3)模型组大鼠肾组织nephrin和podocin m RNA表达量低于对照组;(4)结果表明,nephrin、podocin表达减少可能使足细胞裂孔膜结构的完整性受损,肾小球滤过屏障破坏,导致蛋白尿。

黄芪注射液干预人宫颈永生化上皮细胞体外实验模型的细胞凋亡变化

背景:宫颈永生化上皮细胞H8在致癌因素诱导下可以发生癌变,当有协同因子共同作用时就会导致宫颈癌的发生。但临床上对于癌前病变的女性尚缺乏有效的干预治疗,此项治疗临床为空白。目的:分析黄芪注射液对人宫颈永生化上皮细胞(H8细胞)凋亡的作用及机制。方法:实验分2组,黄芪注射液药物组和空白对照组。1ELISA法检测黄芪注射液作用后人宫颈永生化上皮细胞H8凋亡的DNA片断。2酶标仪分析黄芪注射液作用后人宫颈永生化上皮细胞H8中凋亡酶caspase-3、caspase-9酶活性的变化。3Western blot检测黄芪注射液作用后,人宫颈永生化上皮细胞H8中caspase-3、caspase-9、PARP蛋白表达的变化。结果与结论:1ELISA法检测,20 g/L黄芪注射液分别作用0,6,12,24 h后,人宫颈永生化上皮细胞H8DNA片段随着药物作用时间的延长逐渐增多,且呈时间依赖性(P<0.05)。2酶标仪检测,20 g/L黄芪注射液作用0,6,12,24 h后,人宫颈永生化上皮细胞H8 caspase-3和caspase-9的活性增高,且呈时间依赖性(P<0.05)。320 g/L黄芪注射液分别作用0,6,12和24 h后,人宫颈永生化上皮细胞H8中cleaved caspase-3、cleaved caspase-9表达逐渐升高,差异有显著性意义(P<0.05);Cleaved PARP蛋白的表达逐渐下降,差异有显著性意义(P<0.05)。结果说明,黄芪注射液对人宫颈永生化上皮细胞H8具有较显著的诱导凋亡作用,其机制可能与上调caspase-3和caspase-9蛋白表达有关。

红花黄色素对糖尿病肾病模型大鼠肾脏细胞血管紧张素Ⅱ1型受体的影响

背景:红花黄色素有治疗糖尿病肾病等作用,能够保护肾脏功能,减少损害,延缓或阻止糖尿病肾病的发展。目的:进一步验证红花黄色素对糖尿病肾病大鼠肾脏的作用以及其对肾脏细胞血管紧张素Ⅱ1型受体的表达的影响。方法:选择30只大鼠,随机分为3组,正常对照组、模型组和实验组,每组10只大鼠。实验组和模型组大鼠建立糖尿病肾病模型。建模成功后1周开始实验组大鼠每天给予红花黄色素注射液27.8 mg/kg腹腔注射,1次/d,模型组和对照组每天给予等量生理盐水腹腔注射,共给药23周。观察大鼠的各项肾脏相关生化指标、肾脏组织的病理学变化以及肾脏组织血管紧张素Ⅱ1型受体的表达情况。结果与结论:1实验组和模型组大鼠的肥大指数明显高于对照组(P<0.05)。2模型组的24 h蛋白尿、糖化血红蛋白、总胆固醇、三酰甘油、肌酐及尿素氮均高于对照组(P<0.05);实验组的24 h蛋白尿、糖化血红蛋白、总胆固醇及尿素氮均高于对照组(P<0.05);实验组的24 h蛋白尿、总胆固醇、三酰甘油、肌酐及尿素氮均低于模型组(P<0.05)。3模型组大鼠肾小球肥大,毛细血管的基底膜明显增厚,细胞增生,系膜增宽;对照组大鼠肾脏组织结构发现异常改变;实验组大鼠的肾脏组织病理学损害程度介于对照组和模型组之间。4实验组和模型组的肾脏组织血管紧张素Ⅱ1型受体表达水平高于对照组(P<0.05),实验组的肾脏组织血管紧张素Ⅱ1型受体表达水平低于模型组(P<0.05)。结果说明,红花黄色素对糖尿病肾病的肾脏具有保护作用,其作用机制可能与其阻断肾脏局部的肾素-血管紧张素系统有关。

重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对脓毒症模型小鼠的治疗作用

背景:研究发现粒细胞集落刺激因子可以用于治疗粒细胞减少症,关于粒细胞集落刺激因子治疗脓毒症的研究不多。目的:探讨重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子对脓毒症小鼠的治疗作用。方法:采用腹腔内注射脂多糖的方法建立脓毒症小鼠动物模型,建模后6,30 h皮下注射重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子,观察小鼠的肺组织病理变化、外周血中性粒细胞CD64表达以及血清肿瘤坏死因子α、白细胞介素10水平。结果与结论:(1)治疗后小鼠支气管上皮尚完整,间质轻度增生,见少量中性粒细胞浸润;(2)治疗后1,3,7 d治疗组小鼠外周血中性粒细胞CD64的表达和血清白细胞介素10水平显著高于模型组和正常对照组(P<0.05);(3)治疗后1,3,7 d治疗组小鼠血清肿瘤坏死因子α水平明显高于正常对照组(P<0.05),但低于模型组(P<0.05);(4)结果表明,重组人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子具有增强脓毒症小鼠中性粒细胞功能和抗炎作用。

玻璃体腔注射促红细胞生成素保护糖尿病视网膜病变模型大鼠的视神经作用

背景:糖尿病会导致多种并发症的出现,其中视网膜病变是一种常见的类型,为探究促红细胞生成素在糖尿病视网膜病变中的作用,建立具有临床视网膜新生血管相似病理特征且重复性高的动物模型是十分必要的。目的:观察玻璃体腔注射促红细胞生成素对糖尿病视网膜病变大鼠视神经的保护作用。方法:建立糖尿病视网膜病变模型大鼠,于玻璃体腔注射促红细胞生成素干预,连续注射14 d,设模型组和正常对照组作对比。结果与结论:1透射电镜观察:与模型组相比,促红细胞生成素组视网膜神经节细胞核呈现出均匀的染色,细胞膜完整,内质网呈轻微肿胀,细胞核周围线粒体存在数量较少的空泡;2Western blot和RT-PCR检测:与模型组相比,促红细胞生成素组Caspase-3激活型、Bax蛋白表达降低(P<0.05),Caspase-3原型蛋白和Bcl-2蛋白表达明显提高(P<0.05),两组核转录因子κB和Survivn基因的表达也差异有显著性意义(P<0.05);3结果证实:玻璃体腔注射促红细胞生成素对糖尿病视网膜病变大鼠视神经有保护作用,可能与其抑制细胞凋亡有关。

体细胞重编程的转化医学研究

脑血管疾病、痴呆、糖尿病、恶性肿瘤、骨退行性病等重大临床疾患的发病率、患病率、病死率和致残率居高不下,细胞保护与细胞损伤修复药物、策略和方法的转化研发、应用与推广一直停滞不前或进展过缓应是其重要原因之一。本研究通过医学、生物学、数据库构建、程序编写、软件研制、统计分析及管理工程等多个领域专业人员的通力合作,对2012年诺贝尔生理学或医学奖两位获奖者关于"成熟细胞可以被重编程而多能化"的原始研究及其被引用的大规模复杂信息数据做整体定量对比和局部关联解析,探讨体细胞重编程研究的临床应用前景和实现策略,发现两位获奖者原创性研究及其影响在时间、学科、科学和技术等多个层面与角度上差异具有统计学意义,揭示和证明了加强与加快转化医学和转化神经科学研究的时代意义、紧迫需求、重要方向、目标与路径及我国医学科研管理体系因此所面临的重要挑战。

雌二醇和孕酮对去势模型小鼠子宫内膜巨噬细胞及相关因子表达的影响

背景:有研究表明,巨噬细胞功能及巨噬细胞集落刺激因子的表达可能受雌、孕激素直接或间接调控,但具体影响尚未深入研究。目的:观察雌二醇和孕酮对双侧卵巢切除小鼠子宫内膜巨噬细胞及巨噬细胞集落刺激因子表达的影响。方法:将双侧卵巢切除的小鼠随机分为雌激素组、孕激素组和对照组,分析各组小鼠子宫内膜巨噬细胞的数量和巨噬细胞集落刺激因子的表达强度。结果与结论:免疫组织化学染色结果显示,与对照组相比,雌激素组与孕激素组小鼠子宫内膜巨噬细胞数量、干预6,24 h后巨噬细胞集落刺激因子的表达明显高于对照组(P<0.05)。结果证实,雌二醇和孕酮都对子宫内膜巨噬细胞有趋化作用,并可以诱导巨噬细胞集落刺激因子的表达。

构建HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物及对乳腺癌细胞增殖的影响

背景:凋亡素(Apoptin)能诱导50种以上不同类型的肿瘤细胞凋亡,有望成为一种极具应用前景的抗肿瘤制剂。如何安全、有效地将其应用于临床,是一个亟待解决的最具现实意义的问题。目的:拟制备人血清白蛋白(HSA)与Apoptin基因的复合物,通过体内外实验验证其抗瘤效果,为Apoptin尽早应用于基因治疗寻找一个简单有效的转移方式。方法:(1)构建含Apoptin基因的真核表达载体pcD NA-Apoptin。以水溶性碳二亚胺(EDC)为交联剂,将聚醚酰亚胺(PEI)与人血清白蛋白(HSA)连接,合成HSA-PEI复合物,然后经电荷中和效应将HSA-PEI复合物与pcD NA-Apoptin重组体及pcD NA空载体分别连接,形成相应HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物;(2)将HSA-PEI-pcD NA-Apoptin复合物转染乳腺癌MCF-7细胞,Western blot检测Apoptin基因在细胞中的表达,MTT法和流式细胞术检测转染后细胞增殖情况;(3)建立裸鼠乳腺癌模型,使用尾静脉注射法,分别将0.5 mL HSA-PEI-pcD NA-Apoptin、HSA-PEI-pcD NA及生理盐水注射入裸鼠体内,4周后测量肿瘤体积。结果与结论:(1)成功构建并鉴定了HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物,体外成功转染乳腺癌MCF-7细胞;(2)HSA-PEI-pcDNA-Apoptin转染MCF-7细胞24 h有Apoptin蛋白的表达,而转染HSA-PEI-pcD NA细胞及空白对照组细胞未见Apoptin蛋白的表达;(3)体外细胞增殖实验提示HSA-PEI-pcD NA-Apoptin组吸光度值明显低于HSA-PEI-pcDNA组及空白对照组(P<0.05);(4)裸鼠乳腺癌模型HSA-PEI-pcDNA-Apoptin组肿瘤体积小于HSA-PEI-pcDNA组及空白对照组(P<0.05);(5)结果表明,HSA-PEI-pcDNA-Apoptin复合物有明显的抑制肿瘤作用。

山姜素对脂多糖诱导的结肠NCM460细胞损伤及对VDR/Nrf2/HO-1通路的作用研究

目的研究山姜素对脂多糖诱导的结肠NCM460细胞损伤修复及对维生素D3受体(VDR)/核因子E2相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)通路的调节作用。方法使用脂多糖建立NCM460细胞损伤模型,分别设置对照组,山姜素低、中、高剂量组及白藜芦醇组,山姜素低、中、高剂量组分别加入终浓度为25、50、100μmol/L的山姜素,白藜芦醇组加入终浓度为120μmol/L的白藜芦醇,继续培养72 h后,CCK-8法测定NCM460细胞增殖率,酶联免疫吸附法(ELISA)测定NCM460细胞上清液肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素(IL)-17、IL-8、IL-6、IL-1β及NCM460细胞匀浆液超氧化物歧化酶(SOD)、一氧化氮(NO)、丙二醛(MDA)水平,流式细胞术测定NCM460细胞凋亡率,使用试剂盒测定NCM460细胞线粒体膜电位水平,实时定量聚合酶链式反应(RT-qPCR)测定NCM460细胞VDR、Nrf2及HO-1 mRNA水平,免疫印迹法(Western blotting)测定NCM460细胞VDR、Nrf2及HO-1蛋白水平。结果与模型组比较,山姜素各剂量组及白藜芦醇组NCM460细胞增殖率、SOD水平、线粒体膜电位、VDR、Nrf2及HO-1 mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05),NCM460细胞上清液TNF-α、IL-17、IL-8、IL-6、IL-1β水平、细胞匀浆液NO及MDA水平、NCM460细胞凋亡率显著降低(P<0.05)。结论山姜素能够显著抑制脂多糖诱导的结肠NCM460细胞损伤后炎症因子的释放及细胞凋亡,恢复NCM460细胞氧化损伤的修复能力及线粒体膜电位改变,促进NCM460细胞增殖,其机制可能与调节VDR/Nrf2/HO-1通路有关。

肺泡上皮细胞损伤及修复对急性肺损伤预后的影响

ALI／ARDS是由弥漫性肺损伤，肺泡上皮与微血管内皮屏障的广泛破坏，使肺泡与间质内聚积大量富含蛋白的水肿液。因此有效的肺泡上皮修复至关重要。研究上皮细胞损伤及修复机制对研发ALI的有效治疗策略至关重要。

细胞膜损伤与修复—秀丽隐杆线虫中的启发

细胞膜作为维持细胞内环境稳态的重要屏障,其完整性可能会受到病原体、化学物质、辐射、炎症反应和机械应力的影响。细胞膜在损伤后的自我修复决定着受损细胞是否能够恢复功能并存活,同时决定相应生物体组织结构和功能的正常。领域内过去的研究发现,根据“伤害”的性质和“伤口”的大小,细胞会启动不同的膜修复机制以恢复细胞膜结构和功能完整性。该文将总结细胞膜修复相关机制的研究现况,重点介绍近年来利用成年秀丽隐杆线虫表皮细胞研究在体细胞膜损伤修复的成果。

应用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠海马神经元中Purα基因可减弱神经元对DNA损伤的修复作用

人转录活化因子Purα是体内重要的转录因子,在体内多个环节中都发挥着重要的作用,尤其是在神经系统中,它与神经元的发育,突触形成都有很密切的关系。该文通过构建Purα基因敲除的小鼠海马神经元细胞系来观察其在DNA损伤修复中的作用。根据目的基因靶向删除外显子的位置设计相应的sg RNA序列,合成相应的寡核苷酸后克隆在p Sp Cas9(BB)-2A-Puro(PX459)V2.0质粒载体相应位点上,从而构建能对Purα基因进行敲除的CRISPR/Cas9质粒,将构建好的质粒通过酶切和测序进行鉴定,将经过鉴定证实相位正确及在有sg RNA序列插入的阳性质粒转染到小鼠海马神经元(HT22)细胞中,加入嘌呤霉素进行抗性筛选,保留正常生长的细胞进行培养,从而建立能稳定地进行Purα基因敲除的细胞系。通过Real-time PCR和Western blot技术分别在转录和翻译水平上检测Purα基因的表达情况,从而来判定Purα基因的敲除效率;将所构建的Purα基因敲除的细胞用羟基脲(HU)进行处理来建立细胞DNA损伤的实验模型,通过Western blot、脉冲电场反转凝胶电泳实验及细胞毒性实验观察Purα在DNA损伤修复中的作用。实验结果证实,所插入片段相位正确。通过TA克隆测序和T7E1酶切证实所构建的质粒具有良好的CRISPR/Cas9活性,可导致基因组碱基发生突变,Real-time PCR和Western blot实验结果证实,Purα基因敲除组的Purα基因表达明显降低。Purα基因敲除后,细胞对HU引起的DNA损伤极为敏感,说明Purα在维持基因组DNA的完整性方面发挥着重要的作用,是细胞中一种不可或缺的蛋白质。该实验结果还提示,利用CRISPR/Cs9技术可以有效地对目的基因进行敲除,同时由于该质粒携带有嘌呤霉素抗性基因,利用这一特点,可以方便地建立稳定的细胞系,该细胞系可用作研究Purα基因在神经元中的生物学功能的细胞模型。