X射线激活氧化应激诱导DNA损伤及HaCaT发生细胞早衰研究

目的:探索不同剂量X射线照射人永生化角质形成细胞(HaCaT)后导致细胞氧化应激水平变化、DNA损伤及细胞早衰的发生。方法:对HaCaT进行X射线照射,根据照射剂量将其分为0 Gy组、5 Gy组和10 Gy组,使用2,7-二氯荧光素二乙酸酯(DCFH-DA)荧光探针检测细胞内活性氧(ROS)水平,并用比色法测定细胞内脂质过氧化产物丙二醛(MDA)含量和超氧化物歧化酶(SOD)活性。利用免疫荧光染色检测不同剂量X射线照射后HaCaT中的磷酸化组蛋白2A变异体(γ-H2AX)焦点变化。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)试剂盒检测不同剂量X射线照射HaCaT后对细胞增殖的影响,采用β-半乳糖苷酶染色检测早衰细胞比例。利用蛋白免疫印迹法检测X射线照射后p21、p53蛋白表达变化。结果:X射线照射HaCaT后24 h,5 Gy组、10 Gy组均较0 Gy组2',7'-二氯荧光素(DCF)荧光强度显著增加,MDA含量较0 Gy组显著升高,而SOD活性较0 Gy组显著下降,3组比较差异均有统计学意义(F=38.35、92.22、5.22,P<0.05)。照射后1 h,γ-H2AX焦点变化呈剂量依赖性显著增加,与0 Gy组相比差异均有统计学意义(F=129.3,P<0.05)。X射线照射HaCaT后6、24和48 h,5 Gy组、10 Gy组均较与0 Gy组相比细胞增殖能力降低,3组比较差异均有统计学意义(F=116.41、62.20、34.29,P<0.01),β-半乳糖苷酶活性增高,其差异均有统计学意义(F=1629.22,P<0.01)。不同剂量X射线照射HaCaT后72 h,5 Gy组和10 Gy组p21、p53蛋白表达量升高,3组比较差异均有统计学意义(F=104.4、66.69,P<0.01)。结论:电离辐射可诱导HaCaT细胞发生氧化应激和DNA损伤同时引起细胞早衰的发生。

高钙磷激活DNA损伤应答诱导人主动脉平滑肌细胞早衰

目的探讨DNA损伤应答(DDR)通路调控人主动脉平滑肌细胞(HASMCs)钙化机制。方法将HASMCs分为对照组、模型组、ATM干预组、PARP干预组,培养12 d。茜素红-S染色法定性和邻-甲酚酞法定量检测细胞钙化;Western blot检测组蛋白γH2AX磷酸化、p16和p21、ATM上Ser1981的磷酸化水平;β-半乳糖苷酶染色检测细胞早衰;qPCR检测p16和p21 mRNA水平。8-羟基-2′-脱氧鸟苷(8-OHDG)检测氧化应激水平,ELISA方法检测IL-6、IL-8水平。结果模型组较对照组钙化明显,8-OHDG、组蛋白γH2AX磷酸化、β-半乳糖苷酶染色、p16的mRNA和蛋白、p21 mRNA、IL6和IL8、ATM磷酸化等指标有显著变化(P<0.05),ATM和PARP干预组可以缓解模型组的变化。结论高钙磷环境刺激HASMCs产生持续DNA损伤,触发ATM磷酸化并激活p16蛋白表达,诱导细胞早衰导致钙化。

吡咯喹啉醌对UVB诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的抑制作用

目的:探究吡咯喹啉醌(pyrroloquinoline quinine,PQQ)对中波紫外线(ultraviolet B,UVB)诱导的人皮肤成纤维细胞早衰的影响。方法:采用不同浓度(10、30、50、60、100μmol/L)PQQ处理成纤维细胞24 h,使用CCK-8法检测细胞活力,筛选最适PQQ浓度。将成纤维细胞分为对照组、PQQ组、光老化+PQQ组和光老化组。用UVB照射诱导人成纤维细胞提前衰老模型,后予50μmol/L PQQ处理24 h。采用流式细胞仪检测细胞周期;β-半乳糖苷酶(β-galacsidase,SA-β-Gal)染色观察细胞衰老;Western Blot法检测p16、p21、p53蛋白质在细胞内的表达情况;实时定量PCR(quantitative real-time PCR,qRT-PCR)法检测Ⅰ型胶原(typeⅠcollagen,COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原(typeⅢcollagen,COL-Ⅲ)、基质金属蛋白酶-1(matrix metalloproteinases-1,MMP-1)和基质金属蛋白酶-3(matrix metalloproteinases-3,MMP-3)mRNA表达水平。结果:与光老化组比较,光老化+PQQ组细胞形态改善,细胞间隙减小,SA-β-Gal阳性表达细胞减少,细胞增殖活性提高,细胞周期阻滞改善,p16、p21和p53蛋白表达减少,COL-Ⅰ、COL-ⅢmRNA表达量增加,MMP-1和MMP-3 mRNA表达降低。结论:PQQ对UVB诱导的人成纤维细胞提前衰老有抑制作用,其可能通过下调衰老相关蛋白p16、p21、p53的水平,调控MMP-1、MMP-3、COL-Ⅰ和COL-Ⅲ的基因表达而发挥光保护作用。

信号转导和转录激活因子3及小凹蛋白1在X射线诱导肺腺癌A549细胞早衰中的调控关系研究

目的:探讨信号转导和转录激活因子3(STAT3)和小凹蛋白1(Cav-1)在X射线诱导A549细胞早衰过程中的调控关系,完善X射线诱导A549细胞早衰的分子机制。方法:利用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测不同肿瘤细胞A875、BGC-823、A549细胞和正常细胞株Hacat细胞中STAT3和Cav-1蛋白表达水平,并检测X射线照射和STAT3过表达及抑制剂处理后A549细胞中p53蛋白、Cav-1蛋白表达水平。结果:肿瘤细胞A875、BGC-823、A549细胞及正常细胞Hacat细胞中STAT3、Cav-1蛋白呈现阳性表达;X射线照射A549细胞后p53蛋白表达增加,STAT3过表达及活化可引起p53蛋白表达水平升高,同时抑制Cav-1蛋白的表达。结论:X射线诱导的A549细胞p53蛋白早衰通路部分依赖于STAT3激活,STAT3负向调控Cav-1蛋白表达。

小分子热休克蛋白HSPB1通过上调SIRT1减轻H_(2)O_(2)诱导的人血管内皮细胞早衰

目的:观察小分子热休克蛋白HSPB1是否减轻过氧化氢(hydrogen peroxide,H_(2)O_(2))诱导的人血管内皮细胞早衰,并从沉默信息调节因子1(silent information regulator 1,SIRT1)信号通路来探讨其可能的作用机制。方法:将常规培养的人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)随机分为空白对照组、50μmol/L H_(2)O_(2)组和H_(2)O_(2)+HSPB1过表达组。通过RT-qPCR法检测p16和p21的mRNA表达;衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associatedβ-galactosidase,SA-β-Gal)活性检测试剂盒检测SA-β-Gal活性;Western blot检测p53、p16、p21、血管细胞黏附分子1(vascular cell adhesion molecule-1,VCAM-1)和细胞间黏附分子1(intercellular adhesion molecule-1,ICAM-1)的蛋白水平;流式细胞术检测细胞内活性氧(reactive oxygen species,ROS)水平。同时,通过沉默SIRT1基因,观察SIRT1对HSPB1减缓H_(2)O_(2)诱导HUVECs衰老的影响。结果:与H_(2)O_(2)组比较,HSPB1过表达可减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs损伤,包括p16和p21 mRNA水平降低、SA-β-Gal活性及ROS水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。同时,HSPB1过表达可使p53、p16、p21、VCAM-1和ICAM-1蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。沉默SIRT1基因可逆转HSPB1对p16和p21 mRNA表达及组蛋白H2AX磷酸化的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。同时,沉默SIRT1基因导致HSPB1抑制SA-β-Gal活性作用也显著减弱(P<0.01)。另外,SIRT1 siRNA逆转了HSPB1对p53、p21及p16蛋白表达的抑制作用(P<0.05或P<0.01)。结论:小分子热休克蛋白HSPB1能够有效减轻H_(2)O_(2)诱导的HUVECs早衰,其机制与激活SIRT1信号通路,抑制氧化应激反应有关。

Beclin1介导的自噬在辐射诱导细胞早衰中的作用

自噬是机体及细胞必不可少的调节过程,在维持细胞的正常生理状态过程中发挥重要的作用。Beclin1是自噬的核心功能基因之一,其影响自噬体形成,并通过自噬影响肿瘤的发生和发展。研究发现Beclin1在p62蛋白介导的早衰调控中发挥一定作用,电离辐射可引起细胞发生自噬及早衰等细胞反应,导致细胞死亡。研究Beclin1介导的自噬在辐射诱导细胞早衰中的作用对肿瘤的放射治疗有重要意义,可为如何提高肿瘤细胞的放射治疗敏感性这一问题提供参考。综述Beclin1介导的自噬在辐射诱导细胞早衰中作用的相关研究进展,为Beclin1相关的肿瘤放射治疗的理论基础研究提供参考。

共济失调毛细血管扩张基因和Rad3相关基因介导电离辐射诱导的A549细胞早衰作用研究

目的:研究共济失调毛细血管扩张突变(ATM)基因和ATM-Rad3相关基因(ATR)对早衰相关的p53蛋白及p16蛋白的促进作用。方法:通过阐明ATM、ATR在电离辐射诱导的A549细胞早衰中是否发挥作用,对ATM、ATR与A549细胞早衰的关系做进一步验证。将采用ATM、ATR抑制剂处理的A549细胞定义为实验组,将采用二甲基亚砜(DMSO)处理的A549细胞定义为对照组,1 h后进行4 Gy X射线照射,72 h后利用蛋白免疫印迹法检测p62蛋白的表达、β-半乳糖苷酶(β-Galactosidase)染色试剂盒检测细胞早衰的发生。结果:实验组在ATM、ATR抑制剂处理后72 h,A549细胞中p62蛋白的表达水平升高,与对照组相比差异有统计学意义(t=51.68,P<0.001)。ATM、ATR抑制剂处理后72 h,A549细胞早衰水平升高,实验组与对照组相比A549细胞早衰减少,差异有统计学意义(t=6.018,P<0.001);当4 Gy X射线照射实验组与对照组细胞后,实验组细胞发生早衰的数量较对照组明显下降,差异有统计学意义(t=6.030,P<0.001)。结论:抑制ATM、ATR可促进A549细胞p62蛋白的表达,同时抑制细胞早衰的发生;在4 Gy X射线照射A549细胞72 h后,ATM、ATR具有调控X射线诱导的A549早衰的作用。

肾实质细胞早衰与IgA肾病进展病机的关系研究

目的:本研究拟探讨肾实质细胞早衰与IgA肾病气虚、阴虚向阴阳两虚证候演变的关系。方法:纳入2016年01月~2017年06月151例已行肾活检的IgA肾病患者,根据《IgA肾病中医证候流行病学临床调查表》进行中医辨证,分析各证型患者临床和实验室指标,以及肾实质细胞衰老之间的关系。采用牛津病理分型评分分析肾组织病理损伤。利用免疫组化检测肾实质细胞衰老标志物P16和DcR2的表达。Spearson相关分析IgA肾病患者肾实质细胞早衰与中医证型之间关系。结果:151例IgAN患者脾肾气虚证患者比例最高,为51例(33.8%);气阴两虚证患者为48例(31.8%);肝肾阴虚证为30例(19.9%);脾肾阳虚证为22例(14.6%)。脾肾气虚证、气阴两虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证牛津病理分型评分依次升高,分别为(4.2±3.3)、(5.4±3.6)、(8.2±4.2)、(12.4±3.2)。脾肾气虚证、气阴两虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证P16肾小球阳性细胞比例依次升高,脾肾气虚证(42.1±4.6)%明显低于脾肾阳虚证(57.2±5.1%,P<0.05)。这四种证型患者P16阳性肾小管细胞比例也依次升高,脾肾气虚证(25.1±7.6)%、气阴两虚证(35.4±11.2)%、肝肾阴虚症(53.8±10.6)%明显低于脾肾阳虚证(85.1±13.1)%(P<0.05)。脾肾气虚证、气阴两虚证、肝肾阴虚证、脾肾阳虚证DcR2阳性肾小管细胞比例依次升高,分别为(25.1±7.6)%、(35.4±11.2)%、(53.8±10.6)%、(85.1±13.1)%,组间差异有统计学意义(P<0.05)。P16、DcR2阳性肾实质细胞比例分别与IgA肾病中医证型差异有统计学意义(P<0.05)。结论:肾实质细胞早衰可能是IgA肾病气虚、阴虚向阴阳两虚证候演变的重要细胞学基础。

GATA4在Cr(Ⅵ)诱导肝细胞早衰中的作用研究

目的通过构建Cr(Ⅵ)诱导的早衰L02肝细胞模型,研究GATA4在调控细胞早衰过程中所发挥的作用。方法10 nmol/L Cr(Ⅵ)连续处理L02肝细胞4周。采用β-Gal染色及Western blot检测衰老相关蛋白表达明确L02肝细胞早衰发生。通过慢病毒转染构建GATA4-sh L02肝细胞及其对照组Scr与并予以Cr(Ⅵ)染毒探讨GATA4对细胞衰老的作用。采用β-Gal染色及Western blot检测衰老相关蛋白表达明确GATA4能够促进Cr(Ⅵ)诱导L02肝细胞早衰。结果10 nmol/L Cr(Ⅵ)处理L02肝细胞4周后β-Gal染色呈现大量阳性衰老细胞且衰老相关蛋白FN1、CLU和SMP30表达明显升高(LSD-t=5.52,10.39,11.66,P<0.05)。GATA4/NF-κB通路相关蛋白GATA4、TRAF3IP2和p65表达明显升高(LSD-t=12.13,16.64,13.73,P<0.05)。当敲低GATA4后10 nmol/L Cr(Ⅵ)处理GATA4-sh L02肝细胞,与对照组相比衰老相关蛋白表达明显降低(t=15.30,P<0.05)。结论Cr(Ⅵ)通过GATA4诱导L02肝细胞早衰发生。

针刀对膝关节骨关节炎兔软骨细胞早衰标志物p16^(Ink4a)和p21^(Waf1/Cip1)表达的影响

目的:观察针刀对膝关节骨关节炎(KOA)兔软骨细胞早衰标志物p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)表达的影响,分析针刀是否可通过抑制软骨细胞早衰治疗KOA。方法:新西兰兔随机分为正常组、模型组、针刀组和电针组,每组6只。采用改良Videman法左后肢伸直位制动制备KOA模型。针刀组选取兔左后肢膝关节股内外侧肌肌腱止点、股直肌肌腱止点、股二头肌肌腱止点及鹅足滑囊等高应力点行针刀松解治疗,1次/周,治疗3周。电针组选取兔左后肢“血海”“梁丘”“内膝眼”和“外膝眼”进行电针治疗,20 min/次,隔日1次,治疗3周。治疗前后,各组兔进行患侧膝关节Lequesne MG评分和膝关节被动活动度(PROM)检测。治疗结束后采用免疫组织化学法和Western blot法分别检测患侧膝关节软骨组织p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)的阳性表达和蛋白表达水平。结果:治疗前后,与正常组相比,模型组兔患侧膝关节Lequesne MG评分显著升高(P<0.01),PROM显著减小(P<0.01)。治疗后,与正常组相比,模型组兔患侧膝关节软骨组织p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)阳性表达和蛋白表达水平显著升高(P<0.01);与模型组相比,针刀组和电针组兔的患侧膝关节Lequesne MG评分显著降低(P<0.01),PROM显著增加(P<0.01),膝关节软骨组织p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)阳性表达和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01,P<0.05);与电针组相比,针刀组患侧膝关节Lequesne MG评分降低(P<0.05),PROM增加(P<0.05),膝关节软骨组织p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)阳性表达和蛋白表达水平均显著降低(P<0.05,P<0.01)。结论:针刀干预能够下调软骨细胞中早衰标志物p16^(Ink4a)、p21^(Waf1/Cip1)的表达,提示针刀力学效应可能通过抑制软骨细胞早衰缓解软骨退变以治疗KOA。

细胞早衰对放射性皮肤损伤中伤口愈合的影响及机制研究

医疗照射、职业性暴露、应急照射均可引起放射性皮肤损伤,相关的研究大多集中在放射性皮肤损伤的预防与治疗措施方面,但相关分子尚未完全阐明。研究表明,辐射诱导的细胞早衰在放射性皮肤损伤发生发展中发挥重要作用。本文从放射性皮肤损伤机制及细胞早衰促进放射性皮肤损伤的发生发展,电离辐射诱导的细胞早衰信号通路,及细胞早衰在伤口愈合中的作用3个方面进行综述,探讨辐射诱导的细胞早衰与放射性皮肤损伤的关系。

重金属六价铬暴露后早衰肝细胞分泌表型中炎性成分的作用研究

目的探究重金属六价铬[C(rⅥ)]诱导的早衰L02肝细胞衰老相关分泌表型(SASP)中炎性成分白细胞介素-6与白细胞介素-8的调控及其生物学作用。方法L02肝细胞予以10 nmol/L C(rⅥ)连续处理4周,每周3次,每次24 h。对照组使用磷酸盐缓冲液处理。使用β-半乳糖苷酶染色及衰老相关蛋白检测以明确早衰发生。活性氧及线粒体呼吸链复合物(MRCC)检测试剂盒检测活性氧表达及MRCCⅠ与MRCCⅡ的表达情况。ELISA试剂盒检测白细胞介素-6与白细胞介素-8的表达情况。检测SASP炎性成分白细胞介素-6与白细胞介素-8对人高转移肝癌细胞与衰老细胞增殖能力的影响。结果10 nmol/L C(rⅥ)处理L02肝细胞4周后,β-半乳糖苷酶染色呈现大量阳性细胞且衰老相关蛋白SMP30、FN1、Apo J表达明显升高(P<0.05)。Cr(Ⅵ)能够通过抑制MRCCⅠ与MRCCⅡ活性从而诱导L02肝细胞产生大量活性氧(P<0.05),导致细胞早衰发生并分泌白细胞介素-6与白细胞介素-8。核因子-κB通路蛋白p-p65、p65、p-IκBα以及IκBα蛋白表达升高(P<0.05)。早衰L02肝细胞分泌炎性成分白细胞介素-6与白细胞介素-8能够促进人高转移肝癌细胞增殖。结论C(rⅥ)能够通过活性氧/核因子-κB通路诱导L02肝细胞早衰并调控SASP炎性成分白细胞介素-6与白细胞介素-8分泌,白细胞介素-6与白细胞介素-8能够促进人高转移肝癌细胞增殖。

辐射诱导p62/SQSTM1介导的细胞早衰研究进展

细胞早衰是指细胞在非端粒信号刺激下发生的增殖能力和生理功能下降,提前进入衰老状态。电离辐射可以引起细胞DNA损伤,随后经过细胞周期永久性停滞或启动SASP来诱导细胞早衰。其信号通路较为复杂,p53、p16、p38MAPK、p62等信号分子参与该过程。本文总结了辐射诱导p62介导的细胞早衰研究进展。

褪黑素通过调控p53介导的细胞早衰抑制紫外线诱导的HaCaT细胞中黑色素合成

目的探索褪黑素对中波紫外线(UVB)引起人永生化表皮角质形成(HaCaT)细胞黑色素合成的影响及机制,为褪黑素的皮肤保护机制提供理论基础。方法80 mJ/cm^(2) UVB照射10-5 mol/L褪黑素预处理的HaCaT细胞,照后48和72 h,利用NaOH法检测细胞黑色素水平。照后72 h,利用β-半乳糖苷酶染色试剂盒检测早衰阳性细胞并分析其比例,蛋白免疫印迹法检测衰老相关蛋白p53和酪氨酸酶(TYR)的表达变化。80 mJ/cm^(2) UVB照射分别经毛细血管扩张性共济失调突变激酶/毛细血管扩张性共济失调Rad3相关激酶(ATM/ATR)抑制剂、p53抑制剂和褪黑素预处理的HaCaT细胞,照后72 h检测细胞早衰阳性比例和黑色素水平变化。结果褪黑素抑制UVB诱导的黑色素水平增加(t=56.65、13.39,P<0.05),同时抑制UVB诱导的TYR表达增加(t=16.46,P<0.05);并可缓解UVB诱导的HaCaT细胞早衰(t=6.37,P<0.05),抑制UVB诱导的p53表达增加(t=19.08,P<0.05);ATM/ATR抑制剂、p53抑制剂和褪黑素预处理均可抑制UVB诱导的HaCaT细胞黑色素水平升高(t=13.88、7.86、8.96,P<0.05)。结论褪黑素通过调控p53介导的细胞早衰,抑制UVB诱导的HaCaT细胞黑色素水平增加。

岩藻黄素抗H_2O_2诱导WI-38细胞早衰的作用研究

目的探讨岩藻黄素是否具有抑制H_2O_2引起的WI-38细胞早衰的活性。方法 WI-38细胞在添加岩藻黄素的培养基中培养一定时间后经H_2O_2处理诱导发生早衰,用MTT法检测细胞活力,SA-β-半乳糖苷酶染色法检测细胞内衰老相关的SA-β-半乳糖苷酶活性。结果 300μmol·L-1 H_2O_2处理WI-38细胞20min可成功建立早衰细胞模型。与空白对照组相比,H_2O_2处理组细胞活力明显降低,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数明显增多。5和10μmol·L-1岩藻黄素组细胞活力明显高于H_2O_2处理组,SA-β-半乳糖苷酶阳性细胞数较H_2O_2组明显减少。结论岩藻黄素能够抑制由H_2O_2处理引起的细胞早衰,具有一定的抗衰老作用。

衰老相关分泌表型引起的早衰在电离辐射诱导血管内皮细胞损伤中的作用

辐射诱发的血管内皮损伤是放疗的主要并发症,也是事故受照人群发病和死亡的主要原因。电离辐射诱导的细胞衰老是导致血管内皮细胞损伤的重要因素,因此深入理解衰老相关分泌表型(SASP)导致早衰的机制及其在电离辐射诱导血管内皮细胞损伤中的作用,对预防及治疗电离辐射诱发血管内皮细胞损伤具有重要意义。本文从电离辐射诱导的血管内皮细胞损伤机制、电离辐射诱导细胞早衰以及SASP相关早衰在电离辐射诱导血管内皮细胞损伤中的作用及潜在靶点3个方面进行综述,探讨SASP相关早衰与电离辐射诱导血管内皮细胞损伤的关系。

莪术醇诱导人肝癌HepG2细胞衰老及其机制研究

为进一步探讨莪术醇的诱导细胞衰老的机制,该研究采用荧光定量PCR技术对莪术醇处理后细胞中81个细胞衰老相关基因差异表达谱进行分析,结果发现TP53及其下游基因p16Ink4a、p21Waf1/Cip1和p27Kip1等的表达水平显著升高,伴随ABL1、ALDH1A3、CHEK2、HRAS、PTEN等多个衰老信号通路启动与效应关联基因的转录显著增强,而CyclinA2、IGFBP3、SIRT1以及TERT等细胞周期进程与衰老信号通路的负性调控基因的表达水平则显著降低。Western印迹检测结果显示,p53及其下游周期素依赖性蛋白激酶抑制物(CKI)分子p21WAF1和p16INK4水平升高,CyclinA2水平降低,与PCR结果一致,并伴野生型p53-诱导的蛋白磷酸酶1(Wip1)水平显著增高,提示莪术醇可能通过激活p53信号通路诱导HepG2细胞衰老。该研究进一步发现莪术醇能够诱导HepG2细胞发生衰老表型改变,伴G0/G1期周期阻滞。

Notch通路与骨髓基质细胞衰老的关系探讨

本研究探讨Notch通路活化与骨髓基质细胞衰老的关系。用脂质体转染法将Notch1胞内区(ICN)转入体外培养的小鼠骨髓基质细胞,转染后3天,用MTT法检测细胞增殖率;用流式细胞术检测细胞周期分布;用细胞化学法检测衰老相关β-半乳糖苷酶(senescence-associated β galactosidase,SA-β-gal)阳性细胞百分率;用RT-PCR及Western blot法分别检测周期蛋白激酶抑制因子P53、p21Cip1/Waf1基因水平和蛋白水平的表达。结果表明,ICN转染入小鼠骨髓基质细胞后3天,骨髓基质细胞增殖受抑,细胞周期阻滞在G1期,SA-β-gal阳性细胞百分率增加,无论从基因水平还是蛋白水平均显示P53、p21Cip1/Waf1表达增高,与未转染组及转空貭粒组相比差异均具有统计学意义。结论:Notch通路活化可导致骨髓基质细胞衰老,这种作用可能是通过增加p53、p21Cip1/Waf1蛋白的表达实现的。

顺铂诱导人鼻咽癌CNE2细胞衰老及其相关基因表达谱的研究

目的探讨顺铂体外诱导人鼻咽癌CNE2细胞衰老的效应及其分子机制。方法采用MTT比色法观察顺铂对CNE2细胞增殖的抑制作用,衰老相关-β-半乳糖苷酶(SA-β-gal)活性评判细胞衰老,流式细胞术分析细胞周期分布,实时定量PCR法检测78个人类细胞衰老相关基因的表达。结果顺铂对CNE2细胞的增殖具有明显抑制作用;1.0 mg/L顺铂处理后第6和第8天检测SA-β-gal染色阳性细胞数分别达到67.63%和89.22%,细胞阻滞于G2期;TP53、TP63、p16Ink4a,p27Kip1、PTEN、RB1、Cdc25C、TBX3、Gadd45a、IGF1R、PIK3CA、BMI-1、B2M、MORC3、MYC和SPARC等16个衰老相关基因的m RNA水平显著升高(P<0.05或0.01),Cyclin A2、Cyclin B1、Cyclin E1、CDK6、ATM、ETS2、MDM2、E2F1、ETS1、FN1、IGFBP3、RBL2、SERPINB2及SIRT1等14个基因表达水平下降(P<0.05或0.01)。结论顺铂能够在体外诱导CNE2细胞衰老,其机制涉及p16和p27介导的p53-p RB和PTEN衰老信号调控网络。

STAT3在高能X射线照射诱导肺腺癌早衰中的作用研究

目的:在前期研究发现高能X射线照射可诱导肺腺癌A549细胞早衰及信号传导子与转录激活子3(STAT3)信号通路的活化基础上,进一步探讨STAT3在高能X射线照射后诱导肺腺癌A549细胞早衰中的作用。方法:利用β-半乳糖苷酶染色实验检测过表达和抑制STAT3A549细胞的早衰。用高能X射线对A549细胞进行照射后,分别利用蛋白免疫印迹(Westernblot)法和β-半乳糖苷酶染色实验检测α-氰基-(3,4-羟基)N-苄苯乙烯胺(AG490)和雷帕霉素(RAPA)对受照细胞磷酸化STAT3(p-STAT3)的影响及细胞早衰的影响。结果:加入STAT3磷酸化抑制剂AG490和RAPA均可显著抑制A549细胞的早衰,过表达STAT3可显著促进A549细胞早衰。4 Gy高能X射线照射可显著上调A549细胞内p-STAT3的水平,AG490和RAPA可显著抑制4 Gy高能X射线诱导的p-STAT3升高。AG490和RAPA同样抑制了4 Gy高能X射线诱导的A549细胞早衰。结论:STAT3参与A549细胞早衰的调控,高能X射线照射可通过激活STAT3诱导A549细胞发生早衰。