细胞型朊蛋白对口腔癌生长及侵袭迁移的影响

目的探讨细胞型朊蛋白(PrP^C)对口腔癌生长及侵袭迁移的影响。方法通过shRNA转染技术构建PrPC稳定敲减的CAL27细胞。采用CCK8法、细胞粘附实验、划痕实验和侵袭实验检测PrP^C在细胞增殖、粘附、迁移和侵袭中的作用。为进一步确定PrP^C在体内的作用,分别将CAL27和PrP^C敲减CAL27细胞注射至裸鼠背部皮下。定期测量肿瘤体积,采用Ki67免疫组织化学染色和TUNEL法检测移植瘤的细胞增殖和凋亡情况。结果稳定敲减PrP^C明显减弱CAL27细胞活力,降低细胞粘附和侵袭迁移能力。PrP^C敲减明显抑制裸鼠移植瘤生长及细胞增殖,促进肿瘤细胞凋亡。结论PrP^C促进口腔癌生长和侵袭迁移,PrP^C有望成为口腔癌防治新靶点。

VZV对Schwann细胞朊蛋白糖基化的影响及甲钴胺的调节作用

目的探究水痘-带状疱疹病毒(varicella-zoster virus,VZV)对人Schwann细胞(human Schwann cells,hSC)朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)糖基化特征的影响,及甲钴胺(methylcobalamin,MeB12)的调节作用。方法以感染复数1.0的VZV感染细胞48 h,加入250μg/ml的MeB12培养48 h,用抗体3F4分别包被上清和沉淀中PrPC,凝集素-ELISA法筛查PrPC的糖基化特征,并测定上清中超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)活性与丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量。结果VZV感染组细胞上清与沉淀中的PrPC聚糖比例与未感染组比较有明显变化,总聚糖比分别为1∶1.5和1∶2.6(F=24.18,P<0.001,LSD-t=8.27,P<0.001),提示VZV感染后PrPC稳定性下降,相应的SOD活性(4.43±2.05 U/mg)与未感染组(14.23±1.27 U/mg)比较明显下降(F=18.19,P=0.001,LSD-t=6.54,P<0.001),MDA水平(11.17±1.89 nmol/mg)与未感染组(3.73±0.35 nmol/mg)比较明显升高(F=30.70,P<0.001,LSD-t=8.25,P<0.001),差异均有统计学意义。加入MeB12后,VZV感染细胞沉淀中的聚糖较VZV感染未加药组有明显增加,总聚糖比为1∶2.4,提示MeB12增强了PrPC的稳定性,相应地SOD活性明显增高(11.07±2.07 U/mg,LSD-t=4.42,P=0.002),MDA水平明显下降(5.23±0.96 nmol/mg,LSD-t=6.58,P<0.001),与感染未加MeB12组比较差异有统计学意义。结论VZV可改变hSC中PrPC的糖基化特征,而MeB12可调节PrPC的糖基化特征,增强PrPC的稳定性,从而提高hSC的抗氧化能力。

消化系肿瘤中细胞型朊蛋白的研究进展

朊病毒病（prion disease）是一种慢性、致死性、神经退行性传染病,正常的细胞型构象细胞型朊蛋白（prpc）在一定的条件下可以转化成致病型羊痒病朊蛋白（prpsc）这种异常构象,从而引起朊病毒病的发生,prpc在人体内分布较广,以神经元的表达量最高,过去对于朊蛋白的研究主要集中在神经系统方面。

甲钴胺对VZV病毒感染施万细胞中朊蛋白和TNF-α转换酶表达的影响

目的:探究感染水痘-带状疱疹病毒(VZV)对人施万细胞(hSC)朊蛋白(PrP^(C))、肿瘤坏死因子-α转换酶(TACE)和肿瘤坏死因子-α受体1(TNFR1)表达的影响,及甲钴胺(MCbl)的调节作用。方法:将传代培养的hSC分为:空白对照组、VZV感染组、VZV感染加MCbl干预组、VZV感染PrP^(C)基因(Prnp)siRNA转染细胞组、VZV感染Prnp-siRNA转染细胞加MCbl干预组。设计合成Prnp的siRNA序列转染hSC,构建PrP^(C)表达下调的hSC模型。以感染复数为1.0的VZV分别感染后4组细胞3 d后,加药组分别加入250μg/ml的MCbl干预。感染7 d后采用CCK-8法评估细胞活力,real time RT-PCR检测Prnp mRNA表达,Western Blot分析PrP^(C)糖基化的变化,免疫荧光双染检测TACE和TNFR1的表达,TACE试剂盒检测其酶活性的变化,酶联免疫吸附试验(ELISA)测定细胞上清液中可溶性TNFR1(sTNFR1)的浓度。结果:与对照组比较,感染组细胞活力明显下降(P<0.05)。感染组细胞Prnp的mRNA表达与对照组相比上调了2.7倍,PrP^(C)的单糖基化条带密度明显增加。TACE染色颗粒明显变小,TACE活性为对照组的36%,TNFR1表达与对照组比较明显增多,sTNFR1含量为(16.77±4.57)pg/ml。感染加药组Prnp mRNA表达上调3.7倍,显著高于感染组,PrP^(C)向单糖基化迁移的比例较感染组明显减少。TACE染色颗粒变大,且TACE的活性为对照组的76%,TNFR1表达较感染组减少,sTNFR1水平达到(231.23±41.04)pg/ml,较感染组明显增加。Prnp-siRNA转染细胞感染VZV后,TACE和TNFR1等表达及活性与VZV感染组比较无明显差异,sTNFR1含量与感染组比较无明显差异。Prnp-siRNA转染细胞感染VZV加药组对TACE和TNFR1的表达及活性调节作用不明显,sTNFR1含量与感染组比较无明显差异。结论:VZV可诱导hSC中PrP^(C)稳定性下降,TACE活性降低。而MCbl可稳定PrP^(C),调节TACE活性,促进TNFR1的脱落,从而增强hSC的抗TNF-α神经毒性能力。

细胞型朊蛋白在不同月龄小鼠视网膜中表达的实验研究

目的观察细胞型朊蛋白(cellular prion protein,Pr Pc)在2周龄、9个月龄、18个月龄正常ICR小鼠视网膜中的表达情况。方法选取2周龄、9个月龄、18个月龄ICR小鼠各20只,取出视网膜分别使用RT-PCR检测视网膜组织中Pr Pc基因的表达情况,Western blot检测小鼠视网膜组织中Pr Pc蛋白的表达情况。分析小鼠视网膜中Pr Pc的表达水平与月龄的关系及18个月龄小鼠视网膜与脑组织中Pr Pc的表达差异。结果 2周龄、9个月龄、18个月龄小鼠视网膜组织中Pr Pc基因表达的相对光密度值分别为0.175±0.010、0.420±0.044、0.692±0.030,两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);18个月龄小鼠脑组织中Pr Pc基因表达的相对光密度值为1.363±0.255,与18个月龄小鼠视网膜组织中Pr Pc基因表达的相对光密度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。2周龄、9个月龄、18个月龄小鼠视网膜组织中Pr Pc蛋白表达的相对光密度值分别为0.319±0.028、0.698±0.066、0.996±0.058,两两比较,差异均有统计学意义(均为P<0.05);18个月龄小鼠脑组织中Pr Pc蛋白表达的相对光密度值为2.008±0.192,与18个月龄小鼠视网膜组织中Pr Pc蛋白表达的相对光密度值比较,差异有统计学意义(P<0.05)。结论正常小鼠视网膜中存在Pr Pc的表达,且表达水平随着小鼠月龄的增加而逐渐增强,但弱于脑组织中的Pr Pc表达强度。

细胞型朊蛋白抑菌活性的初步探索

目的:研究细胞型朊蛋白(PrP^c)有无抑菌活性。方法:把Pr Pc分别与金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、巨大芽孢杆菌、苏云金芽孢杆菌、大肠杆菌等5种菌孵育一定时间,然后用碘化丙锭对上述5种样品染色后采用流式细胞仪检测各样品的荧光信号。结果:通过对流式细胞仪的荧光信号进行分析,发现PrP^c对金黄色葡萄球菌和枯草芽孢杆菌具有明显的抑制活性,而另外3种菌的样品没有检测到荧光信号的增强,亦即PrP^c对这3种菌无抑菌活性。结论:细胞型朊蛋白有一定的抑菌活性,有望成为一种新型的抗菌肽。

细胞型朊蛋白受体或结合蛋白在不同发育阶段小鼠脑内的分布

目的 表达和纯化以朊蛋白 (Pr P)胞外部分与人Ig G Fc段构建的融合蛋白 Pr PFc,并以此为配体蛋白 ,定位细胞型朊蛋白 (Pr Pc)的受体在小鼠不同发育阶段脑内的分布 .方法 收集表达 Pr PFc的细胞培养液 ,通过蛋白 A-琼脂糖柱亲和层析纯化 ,以 Pr PFc纯化蛋白与新鲜弱固定的组织切片反应 ,免疫组织化学法显示受体在脑内分布模式 .结果 在正常成年小鼠脑内 ,细胞型朊蛋白的受体分布以位于大脑皮层 (包括新皮层和旧皮层 )和纹状体为最多 ,其次为丘脑、下丘脑及脑干 ,再次为海马的 CA区和齿状回及小脑的蒲肯野和颗粒细胞层 ,嗅球部位也有一些细胞呈阳性染色 ;出生后 14 d小鼠脑内朊蛋白受体与成年动物分布模式及染色强度皆类似 ,而出生当日及 7d后受体分布与 14 d和成年动物相似 ,但染色强度明显较弱 .结论 朊蛋白受体 (或结合蛋白 )在脑组织有广泛分布 ;朊蛋白与其受体在脑组织中分布相似 .

细胞型朊蛋白(PrPc)受体或受体源的筛选

目的 本研究表达了细胞型朊蛋白 (Pr Pc)和碱性磷酸酶 (AP)的融合蛋白 (Pr PAP) ,并以此融合蛋白作为配体通过结合实验寻找 Pr Pc的受体 (或结合蛋白 ) .方法 以碱性磷酸酶组织化学法检测表达 Pr PAP的细胞培养液与细胞表达的细胞粘附分子、少突胶质细胞和雪旺氏细胞系以及原代培养的小脑颗粒细胞的结合 ,并以含 AP的细胞培养液作对照 ,阳性对照为 Kit AP及其细胞表面表达受体的结合 .结果 在所表达的细胞粘附分子中 ,NCAM1 4 0有疑似结合 ,其他L1 ,CHL1 ,P0 ,Tag,F3及 Pr P未见与朊蛋白的阳性结合 ;约有 2 0 %呈现雪旺氏细胞阳性结合 ,少突胶质细胞阳性结合率约为 60 % ;原代培养的小脑颗粒细胞与朊蛋白有几乎1 0 0 %的阳性结合 ,并且细胞密度高 . AP对照仅有微弱染色 .结论 推测朊蛋白的功能作用方式为异嗜性结合 ;确定原代培养小脑颗粒细胞为进一步分离提纯朊蛋白受体的起始材料 。

细胞型朊蛋白对人结肠癌细胞株HT29细胞增殖及化疗敏感性的影响

目的探讨细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)对人结肠癌细胞株HT29细胞增殖及化疗敏感性的影响,为结肠癌的临床诊治提供策略。方法构建滴度合格的PrPC干扰慢病毒LV582-1、LV582-2和LV582-3侵染结肠癌细胞株HT29,分别设置为干扰组1、干扰组2及干扰组3,阴性慢病毒侵染HT29作为对照组,采用qPCR和Western blot技术检测结肠癌细胞株中PrPC的表达,CCK8检测[顺铂处理组(干扰+顺铂处理组、对照+顺铂处理组),无顺铂处理组(干扰组、对照组)]细胞的增殖效率。结果 qPCR检测结果显示,干扰组3(PrPC mRNA为22.22±0.32)的干扰效率最高(为74.297%),提示LV582-3可有效抑制结肠癌细胞株PrPC mRNA的表达;Western blot结果显示干扰组3细胞中PrPC蛋白表达水平低于对照组(P<0.05);CCK8结果显示,干扰组与对照组细胞增殖效率差异无统计学意义(P>0.05),但顺铂处理组与无顺铂处理组相比较,前者明显不利于细胞增殖(P<0.01),且干扰+顺铂处理组与对照+顺铂处理组相比较,前者更加不利于细胞增殖(P<0.05)。结论下调PrPC表达对HT29细胞增殖无显著影响,但可以增加细胞对化疗药物顺铂的敏感性。

细胞型朊蛋白在结直肠癌中的表达及其与预后的关系

目的探讨细胞型朊蛋白(PrPC)在结直肠癌(CRC)组织中的表达及其与预后的关系。方法收集2016年1月-2017年1月苏州大学附属太仓医院(太仓市第一人民医院)胃肠外科经手术切除的CRC标本50例及癌旁正常组织标本(距肿瘤组织2 cm以上)30例。采用免疫组化SP法检测PrPC的表达情况,Spearman检验分析CRC组织中PrPC阳性表达与临床病理特征的相关性,Kaplan-Meier法分析PrPC表达与CRC患者预后的关系,多因素Cox比例风险回归模型分析CRC预后的影响因素。结果PrPC在CRC组织中呈高表达,其阳性表达率明显高于癌旁正常组织[68.0%(34/50)vs.20.0%(6/30),P<0.01],且PrPC表达水平与TNM分期、肿瘤浸润深度、肿瘤分化程度、脉管侵犯及淋巴结转移相关(P<0.05)。随访截至2021年1月,除1例失访外,余49例获得完整随访,随访时间为6~68个月,随访期间32例死亡,中位随访时间为48个月。Kaplan-Meier生存曲线分析显示,PrPC阴性表达组患者的生存时间为(62.0±7.0)个月,5年总体生存率为50.3%,PrPC阳性表达组患者的生存时间为(45.0±4.1)个月,5年总体生存率为7.0%;两组生存情况比较,差异有统计学意义(P=0.015)。多因素Cox比例风险回归模型分析显示,TNM分期和PrPC阳性表达是CRC患者预后的独立影响因素(P<0.05)。结论PrPC在CRC组织中呈高表达,且与患者预后不良相关,有望成为判断CRC预后的重要指标。

与朊毒体相关的鱼类朊蛋白研究概况

疯牛病(mad cow disease),即牛传染性海绵状脑病(bovine transmissible spongiform encephalopathy,BSE)的俗称,是一种慢性消耗性、致死性、中枢神经系统退行性疾病。疯牛病被认为与朊毒体(Prion)有关,朊毒体是由正常朊蛋白(Prion protein,或者PrPC)发生构象改变后形成的异常蛋白(PrPSc)。疯牛病的发生引起了世界各国政府和科学界的高度重视,PrP的起源及其功能研究已成为研究热点。鱼类PrP相关蛋白的研究正在展开中,由于鱼类PrP相关蛋白与朊蛋白的结构相似,鱼类感染TSE类似病存在理论上的风险。本文全面地综述了疯牛病的概况、朊毒体的特性、朊毒体与哺乳动物朊蛋白、鱼类PrP相关蛋白(PrP1、PrP2和PrP3)及鱼类其他PrP相关蛋白的研究情况,为国内水生动物PrP相关蛋白研究提供参考。

三种哺乳动物朊蛋白基因的克隆与分析

以外周血液的总DNA为模板,运用PCR方法克隆了汉族人、秦川黄牛和甘肃土种绵羊的Prnp基因,运用分子生物学软件对这些序列进行了分析比较。结果表明,获得的3种哺乳动物的Prnp基因均位于1个单一的外显子内,与GenBank中登录的相应序列具有高度同源性,达99.0%。牛与绵羊Prnp基因同源性为97.3%,推导氨基酸序列同源性为96.5%。人Prnp基因与黄牛和绵羊Prnp基因的同源性分别为86.7%和87.1%,其氨基酸序列的同源性均为90.0%。3种Prnp基因均有富含G-C的重复区,编码的PrP蛋白均由氨基端的信号肽、中间的成熟蛋白和羧基端的GPⅠ锚结合位点组成。基因型分析表明,秦川黄牛和甘肃土种绵羊可能存在感染海绵状脑病的风险。

朊蛋白在神经系统作用机制研究进展

细胞型朊蛋白(PrP~C)作为一种跨膜糖蛋白在哺乳动物中广泛存在。基因敲除的研究显示PrP~C在神经系统的活动中的关键作用包括周围神经髓鞘的形成以及对神经毒素刺激的保护。PrP~C在不同的细胞类型中也有不同的生物学作用。如PrP~C模块化结构、多种结合伴侣以及与脂质筏的密切关联的特性,使其具有组装多组分复合物的能力,从而触发不同的信号通路,调节细胞分化。PrP~C在大脑中参与的病理性作用仍然没有一致的定论,其错误折叠产生的异构体PrP~(SC)是朊病毒疾病的主要致病因素。但有证据指出PrP~C在朊病毒疾病中发挥的致病作用独立于羊瘙痒病朊蛋白亚型(PrP~(SC)),在朊病毒感染过程中,朊病毒疾病的临床和神经病理症状与大脑中PrP~C而不是PrP~(SC)的表达水平成正比。另外,PrP~C可能还是一种与神经退行性病变相关的蛋白,参与β淀粉样蛋白(Aβ)等聚集性蛋白的神经毒素信号转导,还充当α-突触核蛋白的细胞受体,促进其在细胞吸收以及大脑中传播。虽然朊病毒的研究已经取得很大的进展,但PrP~C在大脑中的作用仍然没有明确,因此探索PrP~C在细胞中作用具有十分重要的意义。

朊病毒致病机理的研究进展

就细胞型朊蛋白PrPc的分子生物学特性、朊蛋白的生理功能、致病性朊蛋白PrPsc对免疫系统的影响、朊病毒的外周致病机理以及相关细胞因子、化学因子与朊病毒神经侵袭之间的关系、朊病毒从外周到中枢的转运机制、入侵门户、血液传播及朊病的其他病理标志和检测方法的研究做一综述。

人外周血单核细胞释放PrP^C与其分泌Exosomes相关性研究

为探求人外周血单核细胞是否分泌exosomes以及exosomes的分泌与细胞外环境中PrP^C的关系。采用密度梯度离心的方法从人外周血单核细胞系的培养基中提取exosomes,并利用电镜技术和免疫印迹分析对其形态学和生物学特征进行鉴定。结果显示所提取的exosomes主要分布在1.13～1.16 g/ml的密度层中,平均直径在30～100 nm之间,呈杯状,这与相关报道关于其他细胞分泌的exosomes特征分析的结果相一致;与exosomes相关的分子Tsg101、flotillin-1、Hsp70、PrP^C均为阳性标记,而作为内质网标志蛋白的钙连接蛋白在exosomes上没有检测到。以上结果说明人外周血单核细胞分泌的exosomes没有被细胞器污染,而且细胞向培养基中释放PrP^C与其分泌exosomes有关。

阿尔茨海默病、视神经及特殊蛋白三者关系的研究进展

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)是一种以不可逆的记忆力进行性减退直至痴呆为特征的神经变性疾病,伴随认知减退及视觉空间感觉的丧失。目前国内外有文献表明可对某些特殊蛋白如β-淀粉样蛋白、细胞型朊蛋白进行分子生物学实验,发现它们会影响AD的发展,并且称可通过眼科光学相干断层成像技术完善AD的早期诊断。现就β-淀粉样蛋白、细胞型朊蛋白分别对AD及视神经的影响作一综述。同时,基于AD患者有视网膜机能失调,还就上述两种蛋白与AD视神经的关系作了初步展望。

细胞型朊蛋白PrP^C与浮舰蛋白flotillin功能的研究进展

朊蛋白和脂筏是当今研究的热点。细胞型朊蛋白(PrPC)能够通过构象转变生成致病型的朊病毒(PrPSc),导致海绵状脑病的发生,但是目前关于PrPC的转变机制还不清楚。PrPC也是重要的信号转导蛋白,引发众多的信号转导事件。Flotillin属于新被命名为SPFH(stomatin/prohibitin/flotillin/HflK/C)的蛋白家族,是重要的脂筏标识性蛋白,它们不仅被动地担当着非胞膜窖脂筏的脚架,为蛋白质的相互作用和蛋白质复合体的组装以及信号转导提供平台,而且本身还主动地扮演着信号蛋白的角色,在许多的细胞事件中发挥重要作用。PrPC与flotillin能够发生相互作用,flotillin蛋白为PrPC的跨膜信号转导和PrPC转变成PrPSc提供了环境。本文重点综述了近5年来关于PrPC和flotillin蛋白功能的研究进展,尤其是信号转导方面的研究。

细胞型朊蛋白在阿尔茨海默病及正常脑组织中表达的研究

目的:探讨细胞型朊蛋白(PrPc)在阿尔茨海默病(AD)及正常脑组织中的表达。方法:选取诊断明确的AD病例尸检脑组织标本14例作为观察组,正常中年、老年和高龄各5例、13例、14例分别作为对照组1(NC1)、对照组2(NC2)和对照组3(NC3)。采用免疫组织化学染色,以阳性表达程度和积分光密度(IOD)值观察PrPc在AD病例和正常脑额颞叶中的表达。结果:PrPc在NC2组、NC3组及观察组额叶和海马神经元胞浆中表达阳性。在额叶观察组较NC1组PrPc表达阳性率显著增高(P<0.05);在海马观察组PrPc表达阳性率较NC1组和NC2组显著增高(P<0.05);在额叶和海马,观察组阳性率均高于NC3组,但两组间比较差异不显著(P>0.05)。各组PrPc染色IOD值随年龄递增,观察组与各对照组比较,IOD值显著增高(P<0.05);NC3组与NC1组比较,IOD值显著增高(P<0.05);观察组海马IOD值较额叶显著增高(P<0.05)。结论:PrPc在AD患者脑组织中表达上调,且随着年龄增高其表达亦有所增强,因此,PrPc表达上调与脑老化有一定关系。

细胞型朊蛋白对人胃癌SGC7901和结肠癌HT29细胞株细胞凋亡影响机制研究

目的细胞型朊蛋白(cellular prion protein,PrPC)是一种高度保守且广泛表达的糖磷脂酰基醇(glycosyl phosphatidyl inositol,GPI)锚定糖蛋白,可通过激活相关的信号通路来调控PrPC的表达水平。本研究旨在探讨PrPC的表达水平对人胃癌细胞株(SGC7901)和结肠癌细胞株(HT29)凋亡的影响,及对Caspase-3、Bcl-2和Bax表达的影响。方法通过调控PrPC表达,采用流式细胞术检测SGC7901和HT29凋亡;采用蛋白质印记法检测细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Bcl-2和Bax的表达。结果细胞流式凋亡检测实验结果显示,SGC7901对照+顺铂组细胞凋亡率为(45.95±1.78)%,高于SGC7901对照组(13.48±0.88)%(t=-28.32,P<0.05),表明顺铂可促进SGC7901细胞凋亡;经PrPC低表达后,SGC7901干扰+顺铂组细胞凋亡率为(63.41±1.88)%,明显高于SGC7901对照组(13.48±0.88)%,t=-41.73,P<0.01。HT29对照+顺铂组与HT29对照组细胞凋亡率分别为(37.12±2.23)%和(9.50±0.66)%,差异有统计学意义(t=-20.55,P<0.05),表明顺铂可促进HT29细胞凋亡;经PrPC低表达后,HT29干扰+顺铂组细胞凋亡率为(57.83±1.52)%,明显高于HT29对照组(9.50±0.66)%,t=-50.41,P<0.01。经顺铂处理后促凋亡蛋白Bax和Caspase-3表达上调,抗凋亡蛋白Bcl-2表达下调,进一步将PrPC低表达后,Bax和Caspase-3表达上调和Bcl-2表达下调的幅度更大。结论抑制PrPC的表达可增加顺铂诱导的SGC7901和HT29细胞凋亡,其机制可能与下调Bcl-2、上调Bax和Caspase-3有关。