六君子汤对食管癌细胞株EC9706致血管生成的影响

目的研究六君子汤对食管癌血管生成的影响。方法 MTT法检测六君子汤醇提物对食管癌细胞株EC9706生长抑制作用,收集其500μg/m L质量浓度的EC9706细胞条件培养基用于鸡胚绒毛尿囊膜的血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成的观察。ELISA法检测EC9706细胞和人脐静脉内皮细胞培养基上清中VEGF和IL-6含有量。结果六君子汤醇提物可明显抑制EC9706细胞增殖,具一定剂量依赖性,其IC50值为505.28μg/m L。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞条件培养基所致鸡胚绒毛尿囊膜血管生成、人脐静脉内皮细胞增殖、迁移和小管形成。六君子汤醇提物可减少EC9706细胞和内皮细胞IL-6及内皮细胞VEGF分泌。结论六君子汤醇提物可能通过干预EC9706细胞信号通路从而抑制血管生成的效应。

Notch1基因在食管鳞癌细胞株EC9706中的表达及其对细胞凋亡的影响

背景与目的:早期的研究显示,Notch1信号途径与肿瘤的发生密切相关,在细胞的生长、增殖、分化和凋亡中起着十分重要的作用。本研究旨在研究Notch1基因在食管鳞癌EC9706细胞中的表达及其对EC9706细胞凋亡的影响。方法:通过免疫细胞化学方法检测Notch1基因在EC9706细胞中的表达。采用RT-PCR技术扩增Notch1基因,构建真核表达载体pcDNA3.1-Notch1(命名为pcNICD),转染EC9706细胞,利用RT-PCR及Western blot检测稳定转染pcNICD载体、转染pcDNA3.1空载体及未处理的EC9706细胞中Notch1的表达,另通过流式细胞仪检测未处理、转染pcDNA3.1和转染pcNICD的EC9706细胞的凋亡。结果:EC9706细胞中发现Notch1基因的表达。与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,转染pcNICD的EC9706细胞中Notch1基因的mRNA和蛋白表达水平均明显增加,大约增加3倍(P<0.05);但未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中Notch1的表达差异无统计学意义(P>0.05)。流式细胞检测结果显示,在未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞中,细胞凋亡率差异无统计学意义(P>0.05);但与与未处理的和转染pcDNA3.1的EC9706细胞相比,转染pcNICD的EC9706细胞转染后24h、48h和72h时细胞凋亡率明显增加(P<0.01)。结论:Notch信号途径的激活引起食管鳞癌EC9706细胞的凋亡,提示Notch1基因有可能成为治疗食管鳞癌的新靶点。

健脾和胃法对食管癌细胞株EC9706移植瘤生长的抑制作用

目的:通过观察健脾和胃法及其代表方六君子汤对裸鼠移植瘤的生长和组织中STAT3通路相关因子和蛋白表达的影响,探讨其治疗食管癌的分子机制。方法:用EC9706细胞皮下注射裸鼠制备移植瘤模型,实验分为:正常空白组(C组)、模型组(M组)、六君子汤组(L组)、抑制剂组(S组)、六君子汤加抑制剂组(L+S组),C、M组为空白对照组,灌服生理盐水和腹腔注射生理盐水;L组灌服六君子汤和腹腔注射生理盐水;S组灌服生理盐水和腹腔注射Stattic工作液;L+S组灌服六君子汤水煎液和腹腔注射Stattic工作液。4周后摘除眼球取血和移植瘤,ELISA检测血清中IL-6、VEGF含量;免疫组化检测移植瘤组织中CD34和VEGF表达;Western blot检测移植瘤组织细胞中JAK2、STAT3、p-STAT3蛋白表达。结果:与模型组比较,六君子汤组肿瘤体积较小(P<0.05);各组移植瘤重量及组织中CD34表达均下降(P<0.05);血清中抑制剂组IL-6含量明显降低(P<0.05),其它各组没有明显差异;仅六君子汤组和抑制剂组中JAK2和STAT3表达下降(P<0.05),抑制剂组中p-STAT3明显降低(P<0.05),其它各组无明显差异。与抑制剂组比较,六君子汤组中CD34表达略高于抑制剂组(P<0.05),其它各组无明显差异;STAT3蛋白表达中六君子汤组表达降低(P<0.05),而联合抑制剂组则明显升高(P<0.05);p-STAT3表达中,六君子汤组和及其联合制剂组均明显升高(P<0.05)。与六君子汤组比较,除STAT3表达在联合抑制剂组表达有所增高(P<0.05)外,其它各组无明显差异。结论:健脾和胃法及其代表六君子汤可以抑制食管癌EC9706细胞裸鼠移植瘤的生长,可能与下调移植瘤中CD34、JAK2、STAT3的表达有关。

健脾和胃法通过IL-6/STAT3信号通路对食管癌细胞株EC9706生长的干预作用

目的:通过观察健脾和胃法代表方六君子汤对EC9706细胞增殖以及细胞中IL-6/STAT3通路相关因子和蛋白表达的影响,探讨健脾和胃法及其代表方六君子汤治疗食管癌的分子机制。方法:用MTT法检测六君子汤乙酸乙酯提取物、Stattic、IL-6对EC9706细胞生长的影响;实验设空白组、六君子汤组、Stattic抑制剂组、六君子汤+Stattic抑制剂组、IL-6组、六君子汤+IL-6组、Stattic抑制剂组+IL-6组、六君子汤+Stattic抑制剂+IL-6组,空白组用RPMI 1640培养基,六君子汤组用六君子汤乙酸乙酯提取物和Stattic浓度均为其IC35,所有含IL-6组IL-6加入时间为两药孵育6h后加入,浓度为20ng/mL。利用Western Blot检测六君子汤乙酸乙酯提取物对细胞中STAT3和p-STAT3蛋白表达的影响。结果:六君子汤乙酸乙酯提取物、Stattic可以抑制EC9706细胞的增殖;IL-6可以促进细胞增殖,但无明显量效关系。六君子汤乙酸乙酯/Stattic孵育6h然后加入IL-6培养基,各实验组OD值与空白组比较均显著降低(P<0.05),表现为抑制细胞增殖。六君子汤乙酸乙酯提取物和Stattic及其联合用药可降低p-STAT3蛋白表达(P<0.05)及p-STAT3蛋白占STAT3蛋白比例(P<0.05)。结论:六君子汤乙酸乙酯部位可以干预IL-6/STAT3信号通路抑制EC9706细胞的增殖。

eIF4E反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中eIF4EHPA表达的影响

目的:探讨真核起始因子4E(eIF4E)反义寡核苷酸对人食管癌EC9706细胞中eIF4E及肝素酶(HPA)蛋白、mRNA表达的影响,并观察其对EC9706细胞侵袭力的抑制效果。方法:针对eIF4E mRNA翻译起始区设计经硫代磷酸化修饰的反义寡核苷酸(ASODNS),经脂质体转染食管癌EC9706细胞,采用原位杂交、Western Blot和Boy-den chamber侵袭实验等方法检测抑制前后EC9706细胞中eIF4E及HPA表达情况及细胞侵袭力改变。结果:eIF4EASODNS转染食管癌EC9706细胞24、48、72h后,elF4E及HPA的mRNA与蛋白表达量均较对照组有所降低(P<0.05),且均以转染72h的抑制效应最为明显,在每个时间段内随剂量增加eIF4E ASODNS抑制效应明显增强(P<0.05);eIF4E ASODNS对HPA蛋白、mRNA表达的抑制效应和对eIF4E蛋白、mRNA表达的抑制效应,呈正相关关系(蛋白r=10.02,mRNA r=10.17,P均<0.01);eIF4E ASODNS体外转染食管癌EC9706细胞后,其穿越Matrigel的细胞数明显少于细胞对照组、空白对照组和无关对照组(P均<0.05)。结论:eIF4E ASODNS可抑制食管癌EC9706细胞中eIF4E、HPA蛋白及mRNA表达,且可抑制食管癌EC9706细胞的浸润转移。该研究结果为临床治疗食管癌等恶性肿瘤浸润转移奠定一定的理论基础。

常山水提醇沉物对EC9706细胞周期、凋亡、能量代谢的影响

目的从细胞增殖、凋亡、细胞周期、能量代谢角度,研究常山水提醇沉物抗食管癌细胞EC9706的作用及机制。方法用MTT法检测EC9706细胞活性,流式细胞术检测药物对食管癌EC9706细胞凋亡、周期的影响,能量代谢检测系统检测药物对EC9706细胞能量代谢的影响。结果不同浓度常山水提醇沉物作用48 h后能有效抑制EC9706细胞增殖,呈剂量依赖性(P<0.01),可以有效促进细胞凋亡(P<0.05),将EC9706细胞阻滞于S期和G2/M期(P<0.05),并且明显抑制细胞糖酵解及线粒体代谢能力(P<0.01)。结论以上结果表明,常山水提醇沉物可能通过干预细胞周期、凋亡及能量代谢抑制食管癌EC9706细胞增殖。

脂质体阿霉素热化疗对食管癌细胞的毒性实验研究

目的了解脂质体阿霉素体外不同温度热化疗对食管癌细胞株的细胞毒性作用。方法以体外培养食管癌细胞株EC9706为靶细胞,以游离阿霉素作为阳性对照,未加药物组作为阴性对照,采用WST-1法测定阿霉素和脂质体阿霉素对EC9706的半数抑制浓度(IC50)。再使用此IC50时药物的浓度,在37℃、41℃、43℃下水浴加温1h进行热化疗,同样使用WST-1法测定其细胞杀伤率。结果阿霉素、脂质体阿霉素对食管癌细胞株EC9706的IC50分别为19.064μg/ml、51.359μg/ml(含阿霉素的量为5.707μg/ml)。在37℃条件下,阿霉素与脂质体阿霉素对EC9706细胞株的杀伤率分别为(49.29±2.14)%、(49.39±6.07)%(P>0.05)。在41℃条件下,单纯加热、阿霉素、脂质体阿霉素对EC9706的杀伤率分别为(25.25±2.52)%、(64.80±5.01)%、(76.39±3.42)%,两种药物加热条件下的细胞杀伤作用均较单纯加热组高(P<0.01),且脂质体阿霉素较阿霉素的细胞毒作用提高了11.59%(P<0.01)。在43℃条件下,虽脂质体阿霉素的杀伤作用(79.05±3.09)%较阿霉素(71.89±2.30)%提高了7.16%(P<0.05),但与该药在41℃条件下的杀伤作用比较仅提高2.66%,且差异没有统计学意义(P>0.05)。结论食管癌细胞株EC9706对阿霉素和脂质体阿霉素都很敏感。在热化疗作用上,阿霉素和脂质体阿霉素对食管癌细胞较单纯热疗具有更强的杀伤作用;在37℃条件下,脂质体阿霉素对细胞的杀伤作用与阿霉素相当,在41℃和43℃条件下脂质体阿霉素对细胞的杀伤作用强于阿霉素,但脂质体阿霉素在43℃与41℃对细胞的杀伤作用相当,两种药物联合热疗都具有协同增敏作用。

纯化雄黄体内外抗肿瘤作用

目的:研究纯化雄黄的体内外抗肿瘤作用。方法:建立移植瘤小鼠S180肉瘤模型,观察纯化雄黄高、中、低剂量(2,1,0.5 g.kg-1,灌胃,qd)连续给药14 d对荷瘤小鼠的瘤重、胸腺指数和脾脏指数的影响,实验同时设溶媒对照组和环磷酰胺阳性对照组(CTX,100 mg.kg-1,腹腔注射1次)。另外制备荷瘤小鼠含药血清和正常大鼠的含药灭活血清,通过血清药理学研究方法观察含药血清对人食管癌细胞株Ec9706的体外增殖抑制作用。结果:纯化雄黄可抑制小鼠S180肉瘤的生长,高、中、低剂量组抑瘤率分别为39.1%,29.2%和21.1%,对胸腺指数和脾脏指数无明显影响;荷瘤小鼠含药血清及正常大鼠的含药灭活血清均可抑制人食管癌细胞株Ec9706生长,且在48 h抑制作用达到最强,抑制率分别为42.9%和27.7%。结论:纯化雄黄在体内和体外均有明显的肿瘤抑制作用。

曲古菌素A上调食管癌CAR的表达及增强溶瘤腺病毒转染效率的体外研究

目的通过观察组氨酸去乙酰化酶(histone deacetylase,HDAC)抑制剂曲古菌素(trichostatin A,TSA)对食管癌细胞株EC9706膜表面柯萨奇-腺病毒受体(Coxsackie and adenovirus receptor,CAR)表达水平的影响,观察TSA能否通过上调食管癌EC9706CAR表达而增强其对腺病毒基因转染效率。方法采用免疫细胞组织化学、RT-PCR、Western blot检测食管癌EC9706细胞CAR的表达情况,再用上述方法检测TSA作用EC9706细胞后,CAR mRNA和CAR蛋白表达的改变;同时采用流式细胞术测定病毒转染效率,MTT实验评价腺病毒携带的胸苷激酶(Ad-TK)的体外抗瘤效应。结果 0.5μmol/LTSA处理EC9706细胞12、24、48h后,CAR mRNA和蛋白表达量[分别为(0.44±0.01)、(0.37±0.02),(0.66±0.04)、(0.58±0.01),(0.77±0.05)、(0.70±0.03)]与未加TSA处理组[(0.27±0.02)、(0.22±0.03)]相比,CAR mRNA和蛋白表达水平显著提高(P<0.05,P<0.01),呈现出时间依赖关系。流式细胞仪分析Ad-GFP转染后GFP的表达发现,未加TSA处理细胞转染效率为(1.35±0.11)%,0.5μmol/L TSA作用12、24h和48h后,细胞转染效率分别为(2.58±0.17)%、(4.96±0.14)%、(6.36±0.15)%。MTT检测Ad-TK介导的体外杀伤作用结果显示,0.5μmol/L TSA作用48h比未加TSA增强8倍。结论 TSA通过上调CAR表达量从而增强腺病毒对食管癌细胞的腺病毒基因转染效率。

Inhibition of adenovirus-mediated p27kip1 gene on growth of esophageal carcinoma cell strain

AIM: To investigate the inhibition of p27kip1 gene on the growth of esophageal carcinoma cell strain (EC9706).METHODS: Recombinant adenovirus Ad-p27kip1 was constructed and transfected into esophageal carcinoma cell EC-9706, and its effect on p27kip1 expression, the growth of esophageal carcinoma cell, DNA replication, protein synthesis, cell multiplication and apoptosis were explored by means of cell growth count, 3H-TdR, 3H-Leucine incorporation,flow cytometry, DNA fragment analysis and TUNEL.RESULTS: Recombinant adenovirus Ad-p27kip1 was successfully constructed with a virus titer of 1.24x1012 pfu/ml.p27kip protein expression increased markedly after EC-9706 transfection, while incorporation quantity of 3H-TdR and 3HLeucine decreased significantly. The growth of esophageal carcinoma cell was inhibited obviously. Testing of flow cytometry displayed a typical apoptosis peak, and DNA gel electrophoresis showed a typical apoptosis ladder. TUNEL showed the apoptosis rate of Ad-p27kip1 group and control group to be 37.3 % and 1.26 % (P<0.001) respectively.CONCLUSION: Ad-p27kip1 can inhibit the growth and multiplication of esophageal carcinoma cells and induce apoptosis. Therefore, enhanced p27kip1 expression may be a new way to treat esophageal carcinoma.