晚期糖基化终产物诱导ECV304细胞株氧化增强的可能机制

目的探讨晚期糖基化终产物诱导细胞株ECV304氧化增强的机制。方法取ECV304细胞培养,与不同浓度的晚期糖基化终产物-人血清白蛋白共孵育,或分别经NADPH氧化酶抑制剂Apocynin或蛋白激酶C抑制剂GF109203或酪氨酸蛋白激酶抑制剂Genistein预孵育0.5 h后,再与晚期糖基化终产物—人血清白蛋白共孵育,1h后收集细胞,用细胞色素C法检测O2-.,ThioGlo-1试剂检测还原型谷胱甘肽。结果12.5 mg/L、50 mg/L和200mg/L晚期糖基化终产物—人血清白蛋白可导致ECV304细胞内O2-.从1.37±0.67 nmol/(107.h)增加到3.44±0.40、10.67±0.67和10.93±0.67 nmol/(107.h),使还原型谷胱甘肽从9.54±0.41 nmol/106降低到9.02±0.21、8.41±0.34和8.02±0.18 nmol/106,两者均呈剂量依赖性。Apocynin、GF109203及Genistein均可抑制O2-.的增加及还原型谷胱甘肽的降低。结论晚期糖基化终产物-人血清白蛋白可通过蛋白激酶C和酪氨酸蛋白激酶途径激活NADPH氧化酶,引起ECV304细胞内O2-.产生及还原型谷胱甘肽降低,导致细胞内氧化增强。

Minocycline对rhHGF刺激ECV304细胞株表达MMP9的抑制作用

目的探讨重组人类肝细胞增殖因子(recombinant human hepatocyte growth factor,rhHGF)刺激ECV304细胞株表达基质金属蛋白酶-9(matrjx metalloproteinase-9,MMP-9)的作用及米诺环素(minocycline)的影响作用.方法绘制正常ECV304细胞株生长曲线,明确最适生长浓度及对数生长期;明确rhHGF及minocycline的作用浓度;流式细胞仪(flow cytometer,FCM)检测ECV304细胞株的MMP-9水平.结果①ECV304细胞株的最适生长浓度为1.0E+4/mL,对数生长期为3～5d;rhHCF的作用浓度为8ng/mL,minocycline的作用浓度为1.0E-5mol/L.②对照组MMP-9的表达量为39.74%;培养基中加入rhHGF8ng/mL后,细胞存活率为1.388169±0.102033(P＜0.01),MMP-9的表达量为40.32%;培养基中加入minocycline1.0E5mol/L后,细胞存活率为0.294526±0.076829(P＜0.01),MMP-9的表达量为19.92%.③培养基中加入minocycline 1.0E5mol/L 15min后加入rhHGF 8ng/mL,细胞存活率为0.397291±0.099504(P＜0.01),MMP-9的表达量为22 28%.结论rhHGF可刺激ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量增加;minocycline可抑制ECV304细胞株增殖,使MMP-9的表达量降低;minocycline可拮抗rhHGF所引起的ECV304细胞株增殖,从而使MMP-9的表达量降低.

腺病毒介导的TSP1_f基因转移对脐静脉内皮细胞株EC V304增殖的影响

目的探讨腺病毒介导的凝血酶敏感蛋白1(TSP1)抗血管新生衍生物(TSP1f)基因转移对人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖的影响。方法应用RT-PCR方法从正常人外周血单个核细胞扩增TSP1fcDNA序列构建TSP1f重组腺病毒(ADV-TSP1f);Western blot方法检测ADV-TSP1f介导TSP1f在K562细胞中的表达;台盼蓝拒染检测经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基对ECV304细胞增殖的抑制作用。结果K562细胞经ADV-TSP1f感染可高效表达/分泌TSP1f多肽;经ADV-TSP1f感染的K562细胞条件培养基可显著抑制ECV304细胞增殖,以ADV-LacZ及PBS作对照,抑制率分别为51.6%和53.8%。结论ADV-TSP1f可显著抑制人脐静脉内皮细胞株ECV304增殖,可望成为有效的恶性肿瘤血管新生抑制剂。

Ca^(2+)经钙激活非选择性阳离子通道进入ECV304内皮细胞

目的 研究钙离子进入ECV30 4内皮细胞株的途径和血管紧张素Ⅱ (AⅡ )对钙内流的影响。方法 用膜片钳的细胞贴附式和全细胞方式记录ECV30 4内皮细胞的通道活动。结果 (1 )在记录单通道电流时电极液含 1 2 0mmol·L- 1 CaCl2 ,细胞浴液不含K+ 、Na+ 时 ,Ca2 + 经非选择性阳离子通道 (CAN)内流的电导为γ0 =(1 2 90± 2 1 1 ) pS(n =4)。1× 1 0 - 7mol·L- 1 AⅡ可显著增强通道电流幅度和延长通道开放时 ,其电导增大为γ1 =(2 2 1 8± 2 2 9)pS(n =4)。全细胞记录得到的结果与单通道的一致。 (2 )用全细胞方式记录到ECV30 4内皮细胞的电压依赖性钙通道电流 ,记录到该峰值电流为 (2 9 32± 3 56)pA(n =4) ,2 0 μmol·L- 1 nifedepine能抑制这个峰值电流 ,被抑制后的电流峰值为 (6 0 0± 3 94)pA(n =4)。 2 μmol·L- 1 BayK8644能显著激活通道活动。结论 Ca2 + 经CAN进入ECV30 4细胞 。

他克莫思对rhHGF刺激ECV304细胞株表达MMP-9的抑制作用

目的 :探讨重组人类肝细胞增殖因子 (rh HGF)刺激 ECV30 4细胞株表达基质金属蛋白酶 - 9(MMP- 9)的作用及他克莫思 (Tacrolimus,FK5 0 6 )的抑制作用。方法 :绘制正常 ECV30 4细胞株生长曲线 ,明确最适生长浓度及对数生长期 ;明确 rh HGF及 FK5 0 6的作用浓度 ;流式细胞仪 (FCM)检测 ECV30 4细胞株的 MMP- 9水平。结果 :1ECV30 4细胞的最适生长浓度为 1.0 E+ 4 / ml,对数生长期为 3～ 5 d;rh HGF的作用浓度为 8ng/ ml,IC50 为 8.2 7ng/ ml;FK5 0 6的作用浓度为 5 0 ng/ ml,IC50 为 5 1.6 3ng/ ml。 2对照组 MMP- 9的表达量为 39.74 % ;培养基中加入rh HGF 8ng/ ml后 ,细胞存活率为 1.38816 9± 0 .10 2 0 33(P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 4 0 .32 % ;培养基中加入FK5 0 6 5 0 ng/ ml后 ,细胞存活率为 0 .39876 4± 0 .0 92 4 76 (P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 14 .6 1% ;培养基中加入FK5 0 6 5 0 ng/ ml15 min后加入 rh HGF8ng/ ml,细胞存活率为 0 .76 72 0 3± 0 .0 2 6 39(P<0 .0 1) ,MMP- 9的表达量为 35 .0 8%。结论 :rh HGF可刺激 ECV30 4细胞增殖 ,使 MMP- 9的表达量增加 ;FK5 0 6可抑制 ECV30 4细胞增殖 ,使 MMP- 9的表达量降低 ;FK5 0 6可拮抗 rh HGF所引起的 ECV30 4细胞增殖 ,从而使 MMP-

沙立度胺对ECV_(304)细胞增生的抑制作用研究

目的 在体外探讨沙立度胺 (thalidomide,反应停 )抗血管新生的作用机制。方法 MTT法检测反应停对人脐静脉内皮细胞株 ECV30 4 细胞增殖的抑制率 ;RT- PCR检测血管新生相关基因的表达 ;凝胶电泳迁移率实验(EMSA)检测反应停对 NF-κB活化的影响。结果 反应停对 ECV30 4 细胞增殖的抑制效应与药物浓度呈正相关 (r=0 .999,P<0 .0 0 1) ,当 5 0μg/ ml反应停处理 72小时 ,其抑制率为 34% ;2 5μg/ m l反应停处理 2 4小时 ,ECV30 4 细胞VEGF m RNA相对表达量明显低于对照组 (0 .4 8± 0 .14 vs 0 .98± 0 .18,P=0 .0 0 5 ) ;与对照组相比 ,IL - 8m RNA相对表达量无明显减少 (5 .77± 0 .4 4 vs 5 .99± 0 .5 2 ,P>0 .0 5 ) ;αv 整合素亚基 m RNA相对表达量明显低于对照组(0 .4 7± 0 .13vs 0 .82± 0 .18,P=0 .0 2 9) ,而β5整合素亚基 m RNA相对表达量与对照组相比 ,差异无显著性 (1.5±0 .5 2 vs 1.37± 0 .81,P>0 .0 5 )。当药物浓度为 5 0μg/ m l时 ,NF-κB转录因子活性明显降低 ,且其对 NF-κB活化的抑制与药物浓度有关。结论 反应停抑制血管新生可能与其通过直接抑制内皮细胞增殖、下调 VEGF和αv 整合素亚基表达以及抑制 NF-κB的活化等多个环节有关。

痂囊腔菌素A与竹红菌乙素介导的光动力反应对ECV304细胞杀伤效应的比较研究

目的探讨痂囊腔菌素A光动力学疗法(EA-PDT)对ECV304细胞的杀伤效应,并与竹红菌乙素光动力学疗法(HB-PDT)进行比较。方法以不同浓度的痂囊腔菌素A(elsinochromeA,EA)及竹红菌乙素(hypocrellinB,HB)分别孵育人脐静脉血管内皮ECV304细胞4h,然后分别用波长532nmKTP激光,以20mW/cm2功率密度照射1000s。照光后置于37℃、5%CO2的孵育箱中继续孵育24h后,用MTT法分别测定不同浓度下的细胞存活率,绘制杀伤曲线并拟合曲线方程,根据方程求出不同光敏剂对细胞的半数杀伤浓度(IC50)。结果EA-PDT和HB-PDT对ECV304细胞的IC50分别为50·97ng/ml和85·20ng/ml,二者比较差异有统计学意义(P<0·05),EA-PDT对ECV304细胞有较强的杀伤效应。结论EA-PDT对ECV304细胞株的杀伤效应强于HB-PDT,在血管性病变治疗方面可能有广阔的应用前景。

脂质体介导NF-κB decoy ODN低温缺氧对ECV-304的转染及复氧后对其黏附分子mRNA表达的影响

目的 :探讨在Euro Collin’s(ECs)中 ,低温缺氧条件下脂质体 (invivoliposome)介导NF κB诱捕物寡核苷酸 (NF κBdecoyODN)对人脐静脉内皮细胞株 (ECV 30 4 )的转染效率以及复氧后对其NF κB活性及受其调控的黏附分子mR NA表达的影响 .方法 :应用脂质体 /decoyODN、脂质体 /scrambledODN复合物 ,在低温缺氧的ECs转染ECV 30 4 .应用荧光显微镜和流式细胞仪 ,观察在 4℃条件下 ,decoyODN浓度为 1 .0 μmol/L的ECs缺氧保存ECV 30 4 6h后的平均荧光强度 (MFI)和摄取率以及ODN的胞内分布 ;同时设立裸ODN转染为对照 ,观察脂质体介导decoyODN对ECV 30 4的转染效率 .应用凝胶电泳迁移改变试验 (EMSA)分析ECV 30 4低温缺氧保存 6h/复氧后不同时间的NF κB活性以及decoyODN对NF κB活性抑制效果 .利用RT PCR方法检测各组ECV 30 4的ICAM 1 ,VCAM 1以及P selectin的mRNA表达 .结果 :ECV 30 4在ECs中 4℃缺氧保存 6h后 ,脂质体介导ODN对ECV 30 4转染的MFI为 1 0 72 .7± 33.1 ,是裸ODN转染的 91 .1倍 ,细胞对ODN的摄取率为 (93.1±2 .6 ) % ,是裸ODN转染的 71 .5倍 ;脂质体介导ODN转染的ECV 30 4 ,荧光显微镜下可见部分荧光颗粒分布于胞质 ,胞核内呈强荧光颗粒 ,而裸ODN转染的ECV 30 4 ,胞质内偶见少量荧光 。

高糖对人脐静脉内皮细胞GSH-PX活力、NOS及ICAM-1表达的影响

目的:探讨体外培养条件下高糖状态对血管内皮细胞的影响。方法:培养人脐静脉内皮细胞株ECV3 0 4,分为对照组和高糖组,用分光光度比色法检测谷胱甘肽过氧化物酶(GSH PX)活力,RT- PCR法检测细胞间粘附分子1(ICAM- 1)mRNA水平,免疫细胞化学法观察内皮细胞型一氧化氮合酶(eNOS)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的蛋白表达。结果:高糖组GSH- PX活力明显下降,eNOS、iNOS蛋白表达明显增高,ICAM- 1mRNA水平也显著上升。结论:在较短时间内糖浓度升高可引起血管内皮细胞GSH PX活力下降,ICAM -1mRNA、eNOS和iNOS蛋白表达增高,对糖尿病血管病变早期进展起一定的作用。

加味小陷胸汤对氧化低密度脂蛋白致血管内皮细胞增殖和凋亡的影响

目的:探讨加味小陷胸汤拮抗氧化低密度脂蛋白(OXLDL)对血管内皮细胞(ECV304)增殖和凋亡的影响。方法:采用100μg/ml的OXLDL刺激培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304,诱导细胞凋亡;观察不同浓度小陷胸汤对抗细胞凋亡的作用。结果:100μg/ml的OXLDL在作用一定时间后可明显抑制内皮细胞增殖并诱导其凋亡,加味小陷胸汤含药血清对该细胞毒性有明显拮抗作用,并显示了效果与药物浓度有关。结论:加味小陷胸汤可通过提高内皮细胞生长活性并抑制其凋亡、保护血管内皮细胞。

转tPA基因血管内皮细胞的功能表达

目的 观察组织型纤溶酶原激活剂（tPA）基因转导血管内皮细胞后的功能表达。方法 利用携带tPA基因的假型逆转录病毒转导血管内皮细胞株ECV304，用G418筛选法观察基因是否成功转导，采用发色底物显色法检测转基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性变化。结果 转tPA基因后的血管内皮细胞经G418筛选后2周左右见大量克隆形成；转tPA基因ECV304细胞培养上清液中tPA纤溶活性在转导24h后增高，48h后增高更明显，72-96h浓度达高峰。结论 假型逆转录病毒载体成功介导tPA基因转导血管内皮细胞，并呈有效功能表达，为心血管手术后预防血栓形成的基因治疗提供实验依据。

三七总皂苷对缺氧再给氧血管内皮细胞钙离子浓度及肌浆网Ca^(2+)-ATP酶活性的影响

目的:探讨人脐静脉内皮细胞株(ECV304)缺氧再给氧(H/R)损伤的发生机制及三七总皂苷(tPNS)对该病理生理过程的影响。方法:将体外培养的ECV304分为七组,正常组;模型组;tPNS高、中、低浓度组;维拉帕米组;吡咯烷二硫氨基甲酸酯(PDTC)组,对各组进行相应处理后,分别检测各组细胞内钙离子浓度[Ca2+]i、肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力的变化。结果:模型组、tPNS高、中、低浓度组、维拉帕米组及PDTC组肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力明显低于正常组,[Ca2+]i明显高于正常组,其中tPNS高、中、低浓度组、维拉帕米组及PDTC组肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力明显高于H/R组,[Ca2+]i明显低于H/R组,且呈浓度依赖性改变,tPNS高浓度组肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力明显高于维拉帕米组及PDTC组,[Ca2+]i明显低于维拉帕米组及PDTC组。结论:H/R可激活ECV304,使细胞肌浆网Ca2+-ATP酶活性、一氧化氮(NO)及前列环素(PGI2)含量、细胞活力明显降低,[Ca2+]i明显升高;tPNS能有效改善肌浆网Ca2+-ATP酶活性,减轻细胞内钙超载,减轻H/R损伤,且高浓度tPNS效果优于维拉帕米、PDTC。

晚期糖基化终产物激活内皮细胞核因子κB

目的探讨晚期糖基化终产物对人血管内皮细胞核因子κB的激活及作用机制。方法用晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白与人脐静脉内皮细胞株ECV304体外共同培养。用Westernblot检测核因子κB抑制蛋白水平,凝胶滞留法检测核因子κB的活性。结果晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白可致ECV304核因子κB抑制蛋白降解及核因子κB激活,并且呈时间、剂量依赖关系,抑制核因子κB抑制蛋白的降解,可抑制核因子κB的激活。结论晚期糖基化终产物修饰的人血清白蛋白通过引起核因子κB抑制蛋白降解,导致核因子κB的激活,这一作用机制可能参与动脉粥样硬化的进程。

晚期糖基化终产物诱导血管内皮细胞环氧合酶2表达

目的探讨晚期糖基化终产物对人血管内皮细胞环氧合酶2表达的影响。方法取人脐静脉内皮细胞ECV304与人血清白蛋白修饰的晚期糖基化终产物体外共同培养,然后用Western blot检测环氧合酶2的表达水平。结果内皮细胞环氧合酶2基础表达水平极低,人血清白蛋白修饰的晚期糖基化终产物可诱导环氧合酶2的表达,呈时间与剂量依赖关系;抑制核因子κB的活性可抑制环氧合酶2的表达。结论人血清白蛋白修饰的晚期糖基化终产物可通过激活核因子κB,而引起环氧合酶2的表达。这一作用机制可能参与血管损伤反应。

人血管内皮细胞氧化低密度脂蛋白基因表达谱分析

目的检测内皮细胞中与低密度脂蛋白氧化可能相关的信号传导相关蛋白基因,期望获得阐明氧化机制的有价值的线索。方法利用低密度脂蛋白作用人血管内皮细胞系ECV304,通过基因芯片分析人信号传导相关蛋白的表达谱。结果在被检测的1990个基因中,52个基因的表达变化超过了2倍以上,其中23个基因表达增加,29个基因表达减少。在表达发生改变的基因中,有7个已在最新的报道中认为可能和动脉粥样硬化相关。结论我们的发现可能给内皮细胞氧化低密度脂蛋白的机制的揭示提供全新的思路。

精粹文章摘要

张玉玲，杨光明，李萍，等．四种莲子心生物碱对H2O2诱导血管内皮细胞损伤的保护作用．中国生化药物，2015，35（3）：1-5． 通过测定不同浓度莲心季铵碱（Lot）、莲心碱（Lien）、异莲心碱（Iso）和甲基莲心碱（Nef）对H2O2损伤ECV31M细胞活性的影响，探讨4种生物碱对H2O2诱导人脐静脉内皮细胞株ECV304氧化损伤的保护作用，结果表明，4种生物碱均对H2O2诱导内皮细胞损伤的有一定的保护作用，其作用机制可能是通过增加NOS生成提高血管内皮细胞释放NO，从而发挥保护内皮的功能。