环氧合酶2 3’-UTR在结肠癌细胞株HT29中的调控作用

目的探讨环氧合酶2（COX-2）3’-UTR各调控元件在结肠癌细胞株HT29中的调控作用。方法以HT29细胞的总RNA为模板，采用RT—PCR法扩增COX-23’-UTR全长2217bp，上下游引物5’端接xbaI酶切位点。通过PCR制备3’端缺失体方法结合荧光素酶报告基因技术构建含COX-23’-UTR不同区域长度的报告质粒（包括3’UTR的全长、前端156bp区域、前端347bp区域、前端1006bp区域、156～347bp区域、157—2217bp区域）。用瞬时转染的方法将含COX-23’-UTR不同区域长度的报告质粒和内参pRL—SV40质粒共转染结肠癌细胞株HT2924h，然后分别测定荧光素酶相对活性。数据分析采用t检验。结果3，_UTR的全长、前端156bp区域、前端347bp区域、156～347bp区域分别可将荧光素酶活性下凋70．4％、37．4％、64．8％、24．2％（t=6．13，7．73，9．75，3．92，P〈0．05）。前端1006bp区域、157～2217bp区域对荧光素酶活性无明显影响（t=0．13，0．01，P〉0．05）。结论在COX-23’-UTR156～347bp区域有-重要调控元件可与ARE元件共同作用下调目的基因表达。结肠癌细胞株HT29中COX-23’-UTR中含多个调节元件，通过协调作用控制基因表达。

肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体基因对人大肠癌细胞株HT29作用的研究

目的 探讨肿瘤坏死因子 (TNF)相关的凋亡诱导配体基因 (TRAIL)用于人大肠癌细胞株HT2 9基因治疗的实验研究。方法 将重组腺病毒载体 (Ad)介导的TRAIL基因作用于人大肠癌细胞株HT2 9,通过相差显微镜、MTT比色法和流式细胞仪 ,研究分析其对HT2 9细胞作用的效果。结果Ad/GT TRAIL能引起HT2 9细胞出现明显的形态学改变 ,对HT2 9细胞的生长抑制率和凋亡诱导率分别为 5 4 .3%和 11.1% ;联合Ad/PGK GV16后 ,生长抑制率和凋亡诱导率均显著提高 (P <0 .0 5 ) ,分别为 82 .7%和 2 4 .6 %。结论 Ad/GT TRAIL能有效诱导HT2 9的凋亡从而抑制HT2 9的生长 ,联合Ad/PGK GV16后将显著提高其疗效。

Rho A蛋白通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制

目的:探讨Rho A蛋白通路在DLC-1(frequently deleted in liver cancer-1)基因调控人结肠癌HT29细胞周期中的作用及其机制。方法:构建pcDNA3.1-DLC1质粒载体,脂质体法转染HT29细胞,筛选稳定细胞系;pull-down方法分析Rho A蛋白活性;实时定量PCR检测细胞周期相关蛋白Cyclin D1、p21的表达变化;流式细胞仪检测细胞周期分布。结果:野生型人结肠癌HT29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系。与野生型及空载组HT29细胞相比,转染组细胞RhoA蛋白活性下降;Cyclin D1表达下调,p21表达上调;G1期及凋亡细胞数增加,而G2期细胞数下降。结论:转染DLC-1基因引起人结肠癌HT29细胞Rho A蛋白活性下调,进而可能通过对Cyclin D1、p21表达的调控使细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,同时分裂前期细胞数减少,细胞增殖受抑。

RhoGAP结构域在DLC-1基因抑制人结肠癌HT29细胞增殖、侵袭中的作用

目的:探讨Rho蛋白GTP酶活化蛋白(Rho GTPase activation protein,RhoGAP)结构域在肝癌缺失基因1(frequentlydeleted in liver,DLC-1)抑制人结肠癌HT29细胞的增殖、侵袭中的作用。方法:脂质体转染DLC-1基因及RhoGAP结构域缺失的ΔDLC-1亚克隆至大肠癌HT29细胞株;应用MTT、平板克隆实验检测细胞增殖的改变;Transwell实验观察细胞侵袭迁移能力的改变;流式细胞术检测细胞周期。结果:转染成功后,全长DLC-1基因转染组(pcDNA3.1-DLC1-HT29)与野生型及空载组相比,细胞增殖能力下降,侵袭能力减弱,细胞周期G1期阻滞并诱导凋亡,而ΔDLC-1亚克隆转染组(pcDNA3.1-ΔDLC1-HT29)对细胞增殖、侵袭及细胞周期均无明显影响。结论:DLC-1基因可能是通过其内在的RhoGAP结构域抑制人结肠癌细胞HT29的增殖和侵袭。

表没食子儿茶素没食子酸酯对结肠癌HCT-8和HT29细胞株的作用及对Notchl与Notch2的基因表达的影响

表没食子儿茶素没食子酸酯（EGCG）是茶多酚中含量最高、活性最强的单体，具有抗癌作用。本研究旨在观察EGCG对结肠癌细胞HCT-8和HT29细胞增殖的抑制作用及对Notch1与Notc2基因的影响，探讨其抑癌机制。

慢病毒介导小干扰RNA沉默人结肠癌HT-29细胞芳香烃受体核转位蛋白基因的研究

目的获取有效沉默人结肠癌HT29细胞的芳香烃受体核转位蛋白基因（ARNT）的短发卡RNA（shRNA）重组慢病毒。方法构建4组表达ARNT—shRNA的慢病毒载体和1组无效干扰慢病毒载体并测序鉴定。用合成的5组重组慢病毒转染HT29细胞，通过克隆稀释扩大培养获取5组稳定转染细胞株，实时荧光定量聚合酶链反应（FQ—PCR）和Westernblot检测沉默效率。结果成功构建4组表达ARNT．shRNA的重组慢病毒，其中1组（LV—ARNT—RNAi一3）转染HT29细胞后能有效沉默ARNT基因，mRNA相对表达下降70％（P〈0．05），蛋白水平表达下降60％（P〈0．05）。结论重组慢病毒LV—ARNT—RNAi一3可以下调人结肠癌HT29细胞ARNT基因的表达。

5-Aza-CdR对HT29细胞DLC-1基因表达及生物学行为的影响

目的研究去甲基化药物5-氮杂胞苷(5-Aza-CdR)对人结肠癌HT29细胞株生物学行为及肝癌缺失基因1(DLC-1)表达的影响。方法5-Aza-CdR处理HT29细胞72 h;RT-PCR检测DLC-1 mRNA的表达;MTT、平板克隆实验、Transwell小室实验分别检测药物处理前后的HT29细胞增殖、侵袭、迁移能力的变化。结果经5-Aza-CdR作用后,HT29细胞DLC-1恢复表达,细胞增殖活性降低,侵袭能力与迁移能力下降。结论5-Aza-CdR可抑制HT29细胞增殖、侵袭、迁移,可能与DLC-1基因恢复表达有关。

ROCK通路在DLC-1基因调控人结肠癌HT29细胞侵袭中的作用

目的观察肝癌缺失基因1(DLC-1)对HT-29细胞侵袭能力的影响。方法用脂质体法将重组质粒pcDNA3.1-DLC-1转染HT-29细胞;应用Rho激酶(ROCK)特异性抑制剂Y27632处理HT-29细胞;Westernblot检测p-MLC蛋白表达;Transwell小室实验检测细胞侵袭能力。结果野生型HT-29细胞DLC-1基因表达呈阴性,经转染获得DLC-1稳定表达细胞系;与对照组及空载组HT-29细胞相比,转染组和ROCK抑制剂组p-MLC蛋白表达均下调,细胞侵袭能力受到抑制(P<0.05)。结论转染DLC-1基因可能通过抑制ROCK活性,从而抑制HT-29细胞的侵袭能力。