新城疫病毒M蛋白细胞核定位的机制与功能研究进展

新城疫病毒(Newcastle disease virus, NDV)M蛋白一种非糖基化膜相关蛋白,主要位于病毒囊膜内表面,构成了病毒囊膜和核衣壳连接的支架。研究表明,M蛋白是一种细胞核-细胞质穿梭蛋白。在NDV感染早期,M蛋白可通过自身携带的核定位信号进入细胞核。根据已报道的相关RNA病毒M蛋白功能的研究结果,推测NDV M蛋白早期的细胞核定位有利于细胞质中病毒基因组的复制和转录,并且可能会抑制细胞基因的转录和蛋白质合成。目前,国内外对M蛋白的研究主要集中在M蛋白与NDV毒力和复制的关系以及以M蛋白为核心的病毒样颗粒形成机制和利用方面,而对M蛋白细胞核定位的机制和功能研究相对较少。鉴于M蛋白细胞核定位在NDV复制和致病过程中的重要作用,本文主要从NDV M蛋白的细胞定位特征、M蛋白细胞核定位的分子机制和功能方面进行阐述,以期为NDV M蛋白细胞核定位的功能及其作用机制研究提供理论参考。

介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点鉴定

BLM解旋酶是人Rec Q DNA解旋酶家族重要成员之一,在机体的DNA复制、重组、损伤修复以及维护基因组稳定性等方面发挥重要作用。早期研究表明,BLM解旋酶通过自身携带的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)进入细胞核,但是介导其细胞核定位的关键氨基酸位点尚不清楚。本研究构建了BLM解旋酶C端(aa642-1417)截短体克隆,首先通过截短表达的方法确证其NLS结构域。在此基础上,构建重组真核表达载体p EGFP-NLS/BLM-NES/Rev,通过观察BLM NLS碱性氨基酸位点突变对EGFP-NLS/BLM-NES/Rev融合蛋白细胞核定位的影响,以此快速鉴定NLS中介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。结果表明,BLM(aa642-1417)C端截短体具有与全长BLM解旋酶相同的细胞核定位,同时确证1344RSKRRK1349是BLM解旋酶NLS结构域的活性位点,且具有与SV40 NLS相同的核输入能力。氨基酸位点突变试验结果表明,R1344A、K1346A、R1348A和K1349A点突变均减少了EGFP-NLS/BLM-NES/Rev和EGFP-BLM(642-1417)融合蛋白的细胞核定位。因此,这4个位点是介导BLM解旋酶细胞核定位的关键氨基酸位点。此结果为后续研究BLM解旋酶细胞核定位的分子机制奠定了基础。

冠状病毒核衣壳蛋白细胞核定位特征的研究进展

冠状病毒属于尼多病毒目（Nidovirales），冠状病毒科（Coronaviridae），冠状病毒属（Coronavirus）成员，为单股正链RNA病毒，根据其基凶组和抗原性的特征又分为3个群：第1群主要包括猪传染性胃肠炎病毒（Transmissible gastroenteritis virus，TGEV）、

水稻OsWrky基因的细胞核定位研究

绿色荧光蛋白 (GFP)基因是一种被广泛应用的报告基因。为了了解克隆的水稻WRKY(OsWrky)基因的核定位性质 ,将OsWRKY与GFP基因融合 ,并构建在Ubiquitin启动子控制的pCambia130 1载体上 (pCU -OsWrkyGFP)。利用基因枪介导的方法将pCU -OsWrkyGFP导入洋葱内表皮后 ,荧光显微镜观察GFP的发光部位仅在细胞核内 ,而作为对照的没有融合OsWRKY基因的载体 (pCU -GFP)轰击后细胞质和细胞核中都有荧光。

5-脂氧合酶基因打靶小鼠及细胞核定位研究

简要介绍了5-脂氧合酶基因打靶小鼠模型的性质,在各种疾病模型中的表型,以及5-脂氧合酶细胞核定位研究的新进展。

非晶状体βγ-晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物的细胞核转运及其选择性杀伤肿瘤细胞机制的研究

非晶状体βγ晶状体蛋白与三叶因子蛋白复合物(βγ-CAT)是从大蹼铃蟾(Bombina maxima)皮肤分泌物中分离的分子量为72kDa的天然蛋白复合物。本研究通过激光共聚焦显微镜和Western blot分析βγ-CAT在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)中的细胞核转运机制,以及βγ-CAT对多株肿瘤细胞(HCT116,HT29,A375,Hela,THP-1等)的细胞毒效应。结果表明:βγ-CAT的α亚基中含有典型的GTP/ATPase的保守结构模体Walker A和Walker B,体外检测到βγ-CAT具有GTP/ATP水解酶和GTP/ATP结合活性。在细胞核转运过程中,βγ-CAT的α亚基和β亚基参与形成约150kDa含有泛素化修饰信号的大分子复合物,且泛素化修饰信号和βγ-CAT的α亚基和β亚基共定位于细胞内和融合于细胞核区域的转运囊泡小体中。βγ-CAT能够选择性的杀伤肿瘤细胞,诱导肿瘤细胞脱落和发生凋亡。上述结果为进一步深入研究βγ-CAT的细胞核转运和调节细胞功能的分子作用机制提供思路和线索。

卵母细胞核移植中去核技术的探讨

目的 :了解卵母细胞进行去核手术时其去核方法的可靠性。方法 :通过 2步法对 175 6枚卵母细胞进行去核操作。结果 :存活 12 46枚 ,存活率 71 1% ,将存活卵子进行固定、染色后观察 ,去核完全的卵母细胞有 10 70枚 ,去核率为85 9% ,总去核率为 6 1 0 %。结论 :此法去核有一定可靠性。细胞核的定位是手术成功的关键 ,固定针、去核针。

DADS对DJ-1核定位高表达人白血病HL-60细胞的影响（英文）

最近研究表明,DJ-1在许多肿瘤中过表达,而且DJ-1的核表达与肿瘤的生物学行为有关.本文主要研究二烯丙基二硫(DADS)对DJ-1核定位高表达人白血病HL-60细胞生物行为学的影响,阐明DJ-1在细胞核内的功能,为临床诊断及治疗过程提供一个潜在的治疗靶点.通过基因转染技术建立核内高表达HL-60细胞株(DJ-1/HL-60),利用软琼脂集落形成实验、 MTT法、间接免疫荧光细胞化学实验、硝基蓝四氮唑(NBT)还原比色实验评估HL-60细胞的增殖与分化,DJ-1核定位过表达促进HL-60细胞的增殖并抑制其分化. Transwell迁移侵袭小室实验表明DJ-1核定位过表达可以促进HL-60的迁移和侵袭能力. Western blot结果表明DADS具有抑制HL-60细胞中核内DJ-1蛋白表达的能力.说明DJ-1核定位高表达具有促进HL-60细胞增殖和迁移侵袭及抑制HL-60细胞分化的作用,DADS可以诱导DJ-1核定位高表达HL-60细胞分化及抑制迁移侵袭, DJ-1核定位高表达可减弱DADS抑制HL-60细胞增殖的作用.

细胞核受体酪氨酸激酶研究进展

受体酪氨酸激酶(receptor tyrosine kinases,RTKs)通过其下游信号转导途径发挥了重要的生物学功能。在肿瘤中,由于众多RTKs家族分子作为驱动基因发挥作用,因此,RTKs一直肿瘤研究的热点。目前,一些针对RTKs家族成员的靶向药物相继研发成功,使众多患者获益。但是,治疗抵抗、获得性耐药等很多问题仍未得到有效解决,仍需对RTKs家族分子的生物学机制进一步探索。近年来,越来越多的研究发现,RTKs分子可通过多种机制转位至细胞核内,通过非经典的机制发挥生物学功能。本文对核定位RTKs(nuclear receptor tyrosine kinases,n-RTKs)的形成、作用机制、研究现状进行综述,并对治疗策略的优化和发展方向进行展望。

鸡基质蛋白3核定位信号的预测与鉴定

本研究旨在预测和鉴定鸡基质蛋白3(matrin 3,MATR3)的核定位信号(nuclear localization signal,NLS)。通过核定位信号在线预测软件预测鸡MATR3蛋白中存在的假定NLS(putative NLS,pNLS),根据预测结果构建鸡MATR3蛋白pNLS缺失的重组真核表达载体,转染细胞后通过观察缺失体重组蛋白的亚细胞定位来确定其NLS。根据鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸序列特征,构建NLS邻近氨基酸缺失的重组真核表达载体,转染细胞后通过荧光观察和亚细胞定位分析来确定NLS邻近碱性氨基酸是否参与鸡MATR3蛋白的细胞核定位。另外,对鸡MATR3蛋白NLS在不同物种间的保守性以及对外源蛋白的核输入能力进行分析和检测。结果表明,鸡MATR3蛋白中存在4个pNLS,其中pNLS2(^(596)PSDKKSK^(602))缺失导致鸡MATR3蛋白丧失细胞核定位特征。将构建的鸡MATR3蛋白NLS邻近碱性氨基酸缺失的重组真核表达载体转染细胞,通过荧光观察和亚细胞定位分析,发现鸡MATR3蛋白NLS邻近的碱性氨基酸不参与NLS介导的MATR3蛋白细胞核定位。此外,笔者发现该NLS基序在不同物种的MATR3蛋白中均保守,并且与SV40大T抗原NLS具有相同的核输入能力。鸡MATR3蛋白中存在一个高度保守的NLS(^(596)PSDKKSK^(602)),其邻近的碱性氨基酸位点不参与MATR3蛋白的细胞核定位。

蓝舌病病毒NS4蛋白亚细胞定位对Ⅰ型干扰素应答的影响

在前期仙台病毒诱导干扰素通路基因表达的研究基础上,通过免疫荧光及激光共聚焦显微镜观察,分析蓝舌病病毒(bluetongue virus, BTV)NS4蛋白在仙台病毒诱导下表达及亚细胞定位特征;通过双荧光素酶报告系统和ELISA方法分析NS4蛋白对Ⅰ型IFN-β启动子活性的影响,Western blot分析对NS4 IFN通路中MDA5、TRAF6和ISG15蛋白表达的影响。免疫荧光共聚焦显微镜观察及Western blot结果显示,发现在仙台病毒诱导下在HEK-293T细胞内转染pcDNA3.1-NS4-eGFP重组质粒48 h时发现强的绿色荧光信号,至72 h时绿色荧光信号主要集聚于细胞核内;Western blot分析结果显示在转染后的24,48及72h NS4蛋白的表达量呈时间依赖性上调表达,且在48和72 h抽提的细胞核蛋白中检测到大量的NS4重组蛋白;双荧光素酶报告系统试验显示NS4能显著抑制IFN-β启动子活性,ELISA结果显示NS4能显著抑制IFN-β蛋白的表达;Western blot分析干扰素信号通路MDA5、TRAF6及ISG15蛋白的表达,结果显示,NS4蛋白表达可下调SeV诱导的IFN信号通路中TRAF6、ISG15蛋白表达;灰度分析显示NS4表达极显著下调ISG15的表达。结果表明BTV NS4重组蛋白呈明显的核内定位特征,具有拮抗Ⅰ型IFN应答功能,为进一步研究BTV NS4蛋白拮抗宿主天然免疫应答的分子机制研究提供参考。

基于深度学习的宫颈癌智能辅助检测系统构建

目的:探索基于深度学习的图像语义分割和图像识别技术在宫颈癌早筛中的应用,并构建基于全切片宫颈细胞涂片的宫颈癌智能辅助检测系统。方法:联合图像语义分割和图像识别技术构建宫颈癌智能辅助检测系统。首先通过语义分割完成对宫颈细胞核的分割定位,进而识别异常细胞。结果:在细胞核定位阶段,平均像素精确度(Mean Pixel Accuracy,MPA)达到87.85%,频权交并比(Frequency Weighted Intersection over Union,FWIoU)达到96.69%。在异常细胞识别阶段,灵敏度达到95.00%,准确率96.00%,与此同时,辅助检测系统还能实现细胞计数功能。结论:基于深度学习的宫颈癌智能辅助检测系统能够为临床宫颈癌早筛提供良好的辅助功能,降低检测成本,提升检测效率,减轻病理医生的阅片工作量。

HIV-1Vpr基因在肿瘤细胞中诱导G2期停滞、细胞致死效应及其核定位功能研究

目的 通过研究HIV - 1Vpr基因在宫颈癌细胞HeLa中诱导细胞周期G2停滞、细胞致死效应及其核定位功能 ,探讨将Vpr用于肿瘤治疗的可能性。方法 用脂质体转染的方法 ,将携带Vpr或其突变体VprX基因的质粒转入HeLa细胞内 ,用流式细胞仪分析Vpr诱导的G2停滞和细胞致死性 ;用荧光显微镜观察GFP -Vpr融合蛋白的荧光确定其核定位功能。结果 Vpr具有核定位功能。Vpr和VprX蛋白都具有细胞致死性 ,但是VprX蛋白不能使细胞停滞到G2期。结论 首次报道了Vpr的G2期停滞和细胞致死功能在哺乳动物细胞中是互相独立的。

小麦黄花叶病毒编码VPg蛋白N端结构是VPg与核仁蛋白Fibrillarin互作区域

小麦黄花叶病毒(Wheat yellow mosaic virus,WYMV)属于马铃薯Y病毒科大麦黄花叶病毒属成员,其基因组是由两条正义单链RNA组成,共编码10个蛋白。其中,VPg(Viral protein genome-linked)作为病毒末端结合蛋白,与病毒基因组RNA 5’端共价连接。利用软件分析WYMV VPg蛋白氨基酸序列发现其N端具有核定位信号(NLS)序列,C端具有核输出信号(NES)序列。通过激光共聚焦显微镜观察VPg与GFP融合蛋白在烟草细胞中的表达情况发现,GFP-VPg主要定位于细胞核中。利用eYFP(n)标记核仁结构蛋白Fibrillarin与VPg进行双分子荧光互补实验发现,VPg与Fibrillarin互作且定位于细胞核中。根据VPg结构特点构建一系列缺失突变体与Fibrillarin的互作实验验证了它们之间的互作区域发生在N端NLS区域。

新型环形病毒AGV7VP3基因克隆、表达及其多抗制备

研究对新型环形病毒AGV7 VP3基因进行了克隆、表达以及多克隆抗体的制备。利用原核表达系统获得了可溶性重组GST-VP3蛋白,纯化后免疫小鼠制备了抗GST-VP3多克隆抗体。同时构建pcDNA3.1+EGFP-VP3真核表达载体。通过共聚焦显微镜观察发现,AGV7 VP3与EGFP融合蛋白在HCT116肿瘤细胞中集中表达于细胞核,且呈散在点状分布,类似凋亡小体。研究为进一步研制AGV7血清学诊断方法提供了材料,同时为探究AGV7VP3的生物学功能打下了基础。

神经母细胞瘤SK-N-SH细胞内DHRS4L2基因一种新选择性剪接亚型S4的克隆和亚细胞定位

目的 神经母细胞瘤SK-N-SH细胞系脱氢酶/还原酶（SDR家族）成员4类2[dehydrogenase/reductase（SDR family）member 4 like 2,DHRS4L2]基因的一种新的选择性剪接亚型克隆、生物信息学分析及其亚细胞定位.方法 以SK-N-SH细胞cDNA为模板,PCR扩增DHRS4基因簇Ea1转录本.将PCR产物A-T克隆至pGEMT-Easy质粒,对质粒进行DNA Sanger测序.将测序所得序列用NCBI ORF finder分析其编码区,用Motif Scan分析预测蛋白氨基酸序列.用Clustal Omega进行蛋白序列比对分析.将新亚型完整编码框cDNA以及删除偶核定位信号的编码框分别插入pEGFP-C1质粒,所得质粒和空质粒分别转染SK-N-SH细胞,在荧光显微镜下观察转染表达蛋白亚细胞定位.结果 用RT-PCR和Sanger测序方法发现,SK-N-SH表达DHRS4L2 Ea1转录本,未检测到其表达脱氢酶/还原酶（SDR家族）成员4类1[dehydrogenase/reductase（SDR family）member 4 like 1,DHRS4L1]的Ea2转录本.DHRS4L2 Ea1表达一个新的选择性剪接亚型DHRS4L2-S4（KU141377）,由AY616183基础上在Ea1与E2外显子之间插入新外显子Ej形成,外显子Ej含有新亚型翻译起始密码子ATG.转录本KU141377预测蛋白羧基端具有偶核定位信号（bipartite nuclear localization signal,NLS）,提示其可能定位于细胞核.绿色荧光蛋白融合蛋白实验显示,在SK-N-SH细胞该蛋白定位于细胞核.该蛋白还含有一个甘氨酸密集区（glycine-rich region）和阿片样生长因子受体重复（opioid growth factor receptor repeat）序列.结论 研究发现SK-N-SH细胞表达的一种DHRS4L2新选择性剪接亚型KU141377,其预测编码蛋白含有细胞偶核定位信号,融合荧光蛋白实验显示该新亚型定位于细胞核,这为后续研究DHRS4L2在神经母细胞瘤中的潜在功能奠定基础.

叶酸偶联表阿霉素脂质体的构建及其增强侵袭性乳腺癌细胞摄取和核定位效应的研究（英文）

侵袭性乳腺癌对蒽环类药物表现出较强的抗药性,其原因与药物在癌细胞摄取减少、难以定位到细胞核相关。本研究旨在构建一种叶酸偶联表阿霉素脂质体,将新合成的叶酸–脂质衍生物修饰到脂质体上,以增强侵袭性乳腺癌细胞的药物摄取和细胞核共定位,从而达到清除癌细胞的效果。研究以侵袭性乳腺癌细胞MDA-MB-435S细胞为模型展开。本研究合成了新型叶酸-PEG_(2000)-DSPE共聚物,并构建了叶酸偶联表阿霉素脂质体,载药脂质体的平均粒径约为100 nm;体外试验表明,同对照组相比,叶酸偶联表阿霉素脂质体表现出最强的癌细胞摄取效应和癌细胞核定位效应;并且,构建的载药脂质体表现最强的杀伤侵袭性乳腺癌细胞效应、抑制侵袭性乳腺癌细胞损伤修复效应和对体外乳腺癌肿瘤球最强的穿透效应。因此,构建的叶酸偶联表阿霉素脂质体可通过增加侵袭性乳腺癌细胞摄取及细胞核共定位效应,达到杀伤侵袭性乳腺癌细胞的效果。通过后续开发,叶酸偶联表阿霉素脂质体可望成为一种治疗侵袭性乳腺癌的新型制剂,该研究也为侵袭性乳腺癌治疗提供了潜在的新策略。

鸭源新城疫病毒M蛋白核定位信号突变影响病毒的毒力和复制能力

【目的】研究鸭源新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)M蛋白核定位信号(nuclear localization signal,NLS)突变对其毒力和复制能力的影响。【方法】利用鸭源NDV SS1株P基因和F基因上的AgeⅠ和Bstz17Ⅰ酶切位点,将overlapPCR方法获得的M蛋白NLS突变的片段替换到p NDV/SS1GFP中获得全长质粒pNDV/SS1GFP-M/NLSm。通过反向遗传学技术拯救M蛋白NLS突变体病毒,并对拯救的病毒进行血凝(hemagglutination,HA)试验、荧光试验和M基因测序鉴定。另外,对突变体病毒进行M蛋白的亚细胞定位观察,以及病毒的生物学特性、空斑形成能力和体外增殖能力测定。【结果】成功构建M蛋白NLS突变的全长质粒pNDV/SS1GFP-M/NLSm。细胞转染物接种鸡胚后的第1代尿囊液无HA效价,盲传3代才能检测到拯救病毒的HA效价。进一步的荧光试验和M基因测序确定拯救的病毒是突变体病毒r SS1GFP-M/NLSm。与亲本病毒rSS1GFP相比,突变体病毒M蛋白由细胞核定位变为细胞质定位。此外,突变体病毒的毒力、在鸡胚上的复制能力以及在细胞中的空斑形成能力显著降低,并且感染细胞后产生的细胞病变轻微,M蛋白和绿色荧光蛋白的表达量均降低,说明M蛋白NLS突变使病毒的体外增殖能力受到抑制。【结论】NLS突变导致的M蛋白细胞核定位功能丧失可明显降低鸭源NDV的毒力和复制能力。

短葶山麦冬皂苷C的细胞内分布研究

制备纯化短葶山麦冬皂苷C(DT-13)单克隆抗体,选用人脐静脉内皮细胞(HUVEC)及人宫颈癌细胞(HeLa)为研究对象,通过MTT法筛选给药浓度,以细胞免疫荧光定位法探索DT-13在细胞内的作用分布和蓄积情况及其特点。结果显示,在对细胞无显著毒性作用的DT-13浓度下,DT-13能迅速透过细胞膜进入胞浆,逐渐进入细胞核并长时间蓄积。DT-13(5.0μmol/L)在给药30 min前主要分布于人脐静脉内皮细胞(HUVEC)细胞的胞浆,给药12 h后主要蓄积于细胞核内且持续时间可达24 h。而对人宫颈癌细胞(HeLa),与HUVEC细胞相比,DT-13(2.5μmol/L)能更快进入并蓄积于细胞核。提示DT-13可能通过作用于细胞核而发挥其主要的生物活性。该方法能直观、可靠、便捷地观察DT-13在细胞内的定位及动态变化,为中药皂苷类活性成分的药效及作用机理研究提供新的技术方法。

新型载体preS1-tp融合蛋白介导乙型肝炎病毒靶向定位序列小干扰RNA有效抑制乙型肝炎病毒复制和cccDNA合成

目的使用preS1-tp融合蛋白作为新型的载体,介导针对乙型肝炎病毒(HBV)核心蛋白羧基端核定位信号(NLS)区的小干扰RNA(siRNA)进入感染HBV的肝细胞,从而抑制HBV复制和共价闭合环状DNA的形成。方法以慢病毒感染系统为基础,建立表达人牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽的HepG2.2.15细胞;针对HBV NLS区设计合成siRNA;表达纯化preS1-tp融合蛋白,检测其进入细胞和与DNA结合的能力;以preS1-tp融合蛋白为载体,介导NLS siRNA递送至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞中,观察其对HBV复制和共价闭合环状DNA水平的影响。多组间比较采用方差分析,计量资料用t检验分析组间差异。结果成功构建HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞株并合成筛选出显著抑制HBV复制的HBV NLS siRNA。纯化并大量表达preS1-tp融合蛋白,以该融合蛋白为载体靶向输送HBV NLS siRNA,结果显示,融合蛋白可以有效靶向输送siRNA至HepG2.2.15-牛磺胆酸钠共转运蛋白多肽细胞,不仅可有效抑制细胞中HBV mRNA,HBsAg和HBeAg表达,还能显著降低HBV DNA和共价闭合环状DNA的水平。结论preS1-tp融合蛋白利用preS1与肝细胞HBV受体结合,tp与核酸结合的双功能特点,将针对HBV NLS的siRNA靶向至感染HBV的靶细胞,靶向阻断rcDNA转运入细胞核,使siRNA发挥抑制HBV复制和共价闭合环状DNA合成的作用,为HBV感染所致慢性乙型肝炎治疗提供新策略,为彻底清除体内HBV提供新的研究视角。