死亡相关蛋白激酶1在慢性淋巴细胞白血病中的表达

目的:研究死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)在慢性淋巴细胞白血病中的表达水平。方法:用慢性淋巴细胞白血病MEC1细胞系及慢性淋巴细胞白血病患者血液标本提取的B淋巴细胞以研究DAPK1基因表达水平,应用mRNA定量检测和免疫蛋白印迹方法检测mRNA的转录和蛋白的表达情况。结果:mRNA定量和免疫蛋白印迹方法结果表明,慢性淋巴细胞白血病患者体内的DAPK1基因沉默。因此,无论细胞有或没有进行INF-γ处理,MEC1细胞系中DAPK1和自噬相关基因蛋白表达均无明显差异。结论:慢性淋巴细胞白血病中DAPK1基因沉默性表达,使得自噬行为异常。

miR-153-3p靶向下调Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)基因抑制乳腺癌细胞增殖及迁移

目的探究miR-153-3p调节乳腺癌细胞的增殖、迁移及侵袭的分子机制。方法利用生物信息学软件检索预测miR-153-3p的候选靶基因;采用双荧光素酶报告实验分析miR-153-3p与候选基因的靶向关系;应用实时荧光定量PCR和Western blot法检测miR-153-3p对MDA-MB-231细胞mRNA和蛋白质表达水平的影响;通过噻唑蓝(MTT)法检测细胞增殖能力,划痕实验检测细胞迁移能力,并以TranswellTM检测细胞的迁移和侵袭能力。结果软件预测显示miR-153-3p与Rho相关螺旋蛋白激酶1(ROCK1)有连续的结合区域;共转染miR-153-3p模拟物(miR-153-3p mimics)与ROCK1野生型报告载体的细胞相对荧光素酶活性降低;转染hsa-miR-153-3p-mimics后,MDA-MB-231细胞的miR-153-3p表达水平显著增高,且ROCK1蛋白的表达量明显降低。与对照组相比,转染组MDA-MB-231细胞的增殖、迁移和侵袭能力均减弱。结论miR-153-3p通过靶向下调ROCK1的表达来抑制乳腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭。

脂肪分化相关蛋白通过蛋白激酶C和酰基辅酶A：胆固醇酰基转移酶1促进THP-1巨噬细胞蓄积脂质

目的:探讨脂肪分化相关蛋白促进THP-1巨噬细胞蓄积脂质的机制。方法:使用高胆固醇饲料喂养新西兰兔12周,复制动脉粥样硬化动物模型。然后用Western blotting和免疫组织化学染色观察兔主动脉脂肪分化相关蛋白及蛋白激酶C的表达。THP-1巨噬细胞与氧化低密度脂蛋白孵育不同的时间,使细胞负荷胆固醇酯后,用RT-PCR的方法观察脂肪分化相关蛋白及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1的表达,用PepTag assay琼脂糖凝胶电泳及分光光度法观察蛋白激酶C的活性。在负荷胆固醇酯的THP-1巨噬细胞中分别加入蛋白激酶C的激动剂佛波酯和抑制剂钙磷酸结合蛋白,观察脂肪分化相关蛋白的表达,同时使用油红O染色和高效液相色谱法测定细胞内脂质的变化。瞬时转染pcDNA3.1-HA-adi表达载体到THP-1巨噬细胞,复制高表达脂肪分化相关蛋白的细胞模型。在负荷、不负荷胆固醇酯或ACAT抑制剂存在的状态下,观察酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达及细胞内胆固醇酯的改变。结果:与对照组相比,兔主动脉病变处脂肪分化相关蛋白及蛋白激酶C表达均显著增加。负荷胆固醇酯的THP-1巨噬细胞中脂肪分化相关蛋白及酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达上调,蛋白激酶C的活性升高。荷脂细胞与蛋白激酶C激动剂共孵育后,可以协同增强上调脂肪分化相关蛋白的效应,细胞内脂质增多;如果荷脂细胞同时与蛋白激酶C抑制剂共孵育,可以有效抑制荷脂所致的脂肪分化相关蛋白高表达,细胞内脂质减少。高表达脂肪分化相关蛋白的THP-1巨噬细胞能够使酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1表达增加,促进细胞内胆固醇酯蓄积。加入酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶抑制剂后,这些作用被减弱。结论:脂肪分化相关蛋白可能是通过蛋白激酶C活性的改变影响酰基辅酶A:胆固醇酰基转移酶1的活性,从而影响细胞内脂质的蓄积。

蛋白激酶Cα对人正常肝和肝癌细胞周期及G_1期相关调控因子cyclinD1、cyclinE的影响

目的 探讨蛋白激酶Cα(PKCα)对人正常肝和肝癌细胞周期的作用和对G1 期相关调控因子的影响。 方法 通过细胞转染技术将PKCαcDNA正向插入的真核表达质粒PXJ4 1 PKCα导入正常肝细胞 (L 0 2 ) ,并利用本室已构建的表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )检测细胞的生长曲线 ,细胞周期以及细胞对G1 期相关调控因子cylinD1和cyclinE的影响。 结果 构建了稳定过表达PKCα的人正常肝细胞模型 (LT3) ,过表达PKCα可促进L 0 2细胞增殖 ,促进细胞由G1 期向S期的过渡 ;cyclinD1和cyclinE的蛋白水平上升 ,反之表达反义PKCα的BEL 74 0 2细胞 (HT6 )增殖被抑制 ,阻抑细胞由G1 期向S期的过渡 ,cyclinD1和cyclinE的蛋白水平下降。 结论 从正反两个方面表明 ,PKCα可通过作用于G1 期相关周期蛋白的水平影响G1 S期的进程。

死亡相关蛋白激酶1基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义

目的研究死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)基因启动子甲基化在宫颈癌中的临床意义。方法应用甲基化特异性聚合酶链反应(PCR)检测宫颈癌癌组织和癌旁正常组织中DAPK1基因启动子甲基化,比较在二者间的差异及其与临床病理因素之间的关系。结果宫颈癌组织中DAPK1基因启动子甲基化率为62.5%,癌旁组织中甲基化率为5.0%,宫颈癌组织中DAPK1基因启动子甲基化率显著高于宫颈癌癌旁组织,差异有统计学意义(P<0.05)。宫颈癌癌组织DAPK1基因启动子甲基化率在组织学分级、肿瘤最大径、淋巴结转移、器官转移、FIGO分期中的差异有统计学意义(P<0.05)。结论 DAPK1基因启动子在宫颈癌中呈高甲基化状态,可作为宫颈癌的病情和预后评估的生物学标志物。

口腔鳞状细胞癌组织中死亡相关蛋白激酶的甲基化及其蛋白的表达

目的:探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因的表达、甲基化状态及与口腔鳞状细胞癌(OSCC)的关系,为研究DAPK基因在OSCC组织中表达改变的机制及肿瘤基因治疗方法打下基础。方法:采用甲基特异性PCR和免疫组织化学方法分别检测23例正常口腔黏膜组织和53例OSCC组织中DAPK基因甲基化率、DAPK蛋白表达率。结果:23例正常口腔黏膜组织中无一例检测到DAPK基因启动子区甲基化,53例OSCC患者30例(56.60%)口腔黏膜组织中DAPK基因启动子区完全甲基化,8例(15.09%)DAPK基因部分甲基化,总甲基化率为71.69%(38/53),与正常口腔黏膜组织甲基化率比较差异有显著性(P<0.01)。在23例(100%)正常口腔黏膜组织中DAPK蛋白表达均呈阳性,53例OSCC患者中36例(67.92%)口腔黏膜组织中DAPK蛋白表达下调,二者比较差异具有显著性(P<0.01);OSCC患者口腔黏膜组织中DAPK蛋白低表达组DAPK基因甲基化率(32/36,88.89%)高于正常表达组(6/17,35.29%)(P<0.01)。结论:DAPK基因启动子区甲基化是该基因在OSCC组织中表达降低的机制之一,DAPK基因甲基化引起的基因功能静默可能与OSCC的发生有关。

死亡相关蛋白激酶1、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶甲基化状态检测及与宫颈癌人乳头瘤病毒16感染的关系

目的检测宫颈癌组织死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)、KLF4、6-氧-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)启动子区域甲基化状态,初步探讨其甲基化状态与宫颈癌人乳头瘤病毒16(HPV16)感染的关系。方法选取宫颈癌患者103例为宫颈癌组,另选取同期年龄相匹配的慢性子宫颈炎患者110例为对照组。检测2组宫颈脱落组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化状态。通过人乳头瘤病毒检测HPV16感染情况,分析宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT基因甲基化与HPV16感染相关性。结果与对照组相比,宫颈癌组患者HPV16感染阳性率升高,差异有统计学意义(P<0.05);与对照组相比,宫颈癌组DAPK1、KLF4、MGMT基因异常甲基化率升高,差异有统计学意义(P<0.05)。分化程度低、TNM分期Ⅲ~Ⅳ期、有淋巴结转移及有远处转移患者宫颈癌组织DAPK1、KLF4、MGMT甲基化率高于分化程度高、中及TNM分期Ⅰ~Ⅱ、无淋巴结转移、无远处转移患者,差异有统计学意义(P<0.05)。与HPV16感染阴性相比,HPV16感染阳性患者中APK1、KLF4、MGMT甲基化比例升高,差异有统计学意义(P<0.05)。HPV16感染情况与APK1、KLF4、MGMT甲基化相关(r=0.454,0.497,0.307,P<0.05)。结论HPV16感染可能与APK1、KLF4、MGMT甲基化有关,HPV16感染可能通过影响APK1、RAR-β、MGMT基因甲基化促进宫颈癌的发展。

半定量RT-PCR检测口腔鳞状细胞癌死亡相关蛋白激酶的表达

采用半定量RT-PCR的方法检测死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)基因在口腔鳞状细胞癌(Oralsquamous cell carcinoma,OSCC)中的表达,探讨DAPK基因的表达与OSCC的关系,结果显示DAPK基因的表达在OSCC组织中显著降低,该基因可能与OSCC的发生、发展有关,可作为OSCC诊断的检测指标。

死亡相关蛋白激酶C末端对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的抑制作用研究

目的观察死亡相关蛋白激酶(DAPK)蛋白C-末端多肽(DCTP)对谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞凋亡的作用,探讨DCTP抑制DAPK功能的机制。方法采用PCR法扩增DCTP核酸片段,定向连接至质粒pEGFPN1、pIRES2-EGFP和pcDNA3.1(-),将重组质粒[pEGFPN1-DCTP、pIRES2-DCTP-EGFP和pcDNA3.1(-)-DCTP]转染至SH-SY5Y细胞中,筛选稳定细胞株。分析pEGFPN1-DCTP的表达产物在细胞中的定位。建立稳定表达DCTP的SH-SY5Y细胞。用MTT法、Hoechst33258染色法和流式细胞仪检测SH-SY5Y细胞对谷氨酸的敏感性,用Westernblotting检测细胞内DAPK的表达量以及磷酸化DAPK(p-DAPK)水平的变化。结果谷氨酸对SH-SY5Y细胞生长的抑制作用具有浓度依赖性,40mmol/L的谷氨酸对细胞的抑制率为51.7%。流式细胞仪检测结果显示,40mmol/L谷氨酸处理后细胞的凋亡率和坏死率分别为26.1%和27.7%,而正常培养细胞分别为0.08%和0%。谷氨酸诱导细胞凋亡时,p-DAPK表达下降。荧光显微镜观察可见DCTP定位于细胞质。用40mmol/L谷氨酸分别诱导转染pcDNA3.1(-)-DCTP和pcDNA3.1(-)质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞,流式细胞仪检测结果显示,前者凋亡率为43.7%,而后者凋亡率为62.2%。Westernblotting检测结果显示,在谷氨酸诱导下,与转染pIRES2-EGFP质粒(对照质粒)的SH-SY5Y细胞相比,转染pIRES2-DCTP-EGFP质粒的细胞内DAPK和p-DAPK水平均无明显变化。结论 DCTP基因的表达产物定位于SH-SY5Y胞质。DCTP可以抵抗谷氨酸诱导的SH-SY5Y细胞的凋亡,但并不影响DAPK的磷酸化及其表达水平。

建立稳定抑制死亡相关蛋白激酶表达的细胞系

目的筛选稳定抑制DAPK表达的PC12细胞系,并观察这些细胞系的生长特性。方法设计、合成4条RNA干扰序列,连接到pDsRed1-N1-U6质粒载体上,扩增后提取质粒转染到PC12细胞,并同时转染1株空载质粒作为对照,然后通过G418筛选细胞克隆,建立稳定增殖细胞系,再通过Western blot筛选最为有效的干扰序列,最后用MTT、流式细胞术等检测转染细胞系的生长特性。结果4条干扰序列均已成功转染并筛选出单克隆细胞系,Western blot实验结果证实,4条干扰序列中有3条对DAPK的表达有明显的抑制作用,其中以第2条干扰序列的抑制效果最为明显。结论成功建立稳定增殖和抑制DAPK表达的细胞系。

非小细胞肺癌患者血清死亡相关蛋白激酶基因启动子甲基化的分析

目的:分析非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子区域甲基化的改变状况及其临床意义。方法:运用甲基化特异性PCR技术,检测65例NSCLC组患者血清DAPK基因启动子区域甲基化的改变情况,并分析与临床病理资料的关系。结果:NSCLC组患者血清DAPK基因甲基化检出率为30.8%(20/65),而对照组未检出,DAPK基因甲基化检出率与NSCLC病理类型、分期及转移状态无明显相关性。结论:DAPK基因启动子区域异常甲基化是NSCLC早期辅助诊断的分子标记物之一。

死亡相关蛋白激酶1及结节性硬化复合物蛋白2基因在胰腺癌组织中的表达及与预后的关系

目的通过生物信息学方法研究死亡相关蛋白激酶1(DAPK1)和结节性硬化复合物蛋白2(TSC2)基因在胰腺癌中的表达情况,并探讨分析其与预后的关系。方法利用来自癌症和肿瘤基因图谱(TCGA)数据库的胰腺癌患者数据进行Kaplan-Meier分析,进而深层次探讨DAPK1和TSC2基因表达水平与患者总生存期或无进展生存期(PFS)的关系,同时,对影响预后的因素进行Cox多因素分析,以及分析胰腺癌中DAPK1和TSC2基因启动子的甲基化水平。此外,通过双荧光素酶报告基因检测系统,验证靶向DAPK1的微小RNA(miR),并应用定量逆转录聚合酶链反应和蛋白质免疫印迹法验证在胰腺癌细胞中miR-324-5p负调控DAPK1的表达。结果多因素分析显示,肿瘤分级(P=0.005)、R0切除(P<0.001)及TSC2表达情况(P=0.005)是影响胰腺癌患者PFS的独立危险因素;肿瘤部位(P=0.006)、病理类型(P=0.002)及分子靶向治疗(P<0.001)是影响胰腺癌患者总生存期的独立危险因素。DAPK1基因低表达且TSC2基因高表达的胰腺癌患者具有更好的总生存期(P=0.024)。DAPK1和TSC2甲基化水平与相应的mRNA表达水平均呈负相关(r=-0.69、-0.37,均P<0.05)。体外实验结果证实,过表达的miR-324-5p显著抑制了胰腺癌Pa Ca-2和PANC-1细胞DAPK1 mRNA和蛋白的表达[mRNA:(0.37±0.02)比(1.00±0.02)、(0.53±0.01)比(1.00±0.06);蛋白:(0.54±0.06)比(1.04±0.12)、(0.63±0.11)比(1.01±0.11)](均P<0.05)。结论DAPK1基因联合TSC2基因的表达情况可以预测胰腺癌患者的预后;在胰腺癌组织中,DAPK1和TSC2启动子的低甲基化水平是DAPK1和TSC2高表达的重要因素;miR-324-5p负调控DAPK1的表达,有望成为胰腺癌靶向治疗的新靶点。

非小细胞肺癌患者血清死亡相关蛋白激酶基因异常甲基化的检测及意义

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)患者血清中死亡相关蛋白激酶(DAPK)基因启动子区域甲基化状况及其临床意义。方法采用基因测序法检测62例NSCLC、30例肺部良性疾病患者、16例健康体检者血清中DAPK启动子区域甲基化状况,分析其与临床特征的关系。结果NSCLC患者DAPK甲基化检出率为37.10%(23/62),而肺部良性疾病患者和健康体检者未检出(P<0.05)。DAPK基因甲基化与患者年龄、性别、吸烟指数、临床分期、病理类型、分化程度无关(P均>0.05)。结论DAPK异常甲基化可能在NSCLC发生、发展中起重要作用,有望成为NSCLC辅助诊断和预后判断的分子标记物。

急性脑梗死患者血清死亡蛋白激酶1(DAPK1)与N-甲基-D-天门冬氨酸盐(NMDA)受体相关性的研究

目的联合应用抗血小板聚集(拜阿司匹林片)、和(或)抗凝(法安明)、和(或)降脂(辛伐他汀)和(或)溶栓(rt-PA)治疗急性脑梗死,同时观察血清死亡蛋白激酶1(death-associated protein kinase1,DAPK1)含量的变化,进一步探讨NMDA受体和死亡蛋白激酶(DAPK1)在脑梗死的相互作用,为缺血性脑血管疾病的防治提供临床依据。方法选择发病在72h以内住院急性脑梗死患者,分为溶栓组11例、常规治疗组56例,并选择我科因后循环缺血住院患者46例做为对照组。溶栓组除了给予rt-PA溶栓外,与常规治疗组均联合应用抗血小板聚集(阿司匹林肠溶片100mgqd)、和(或)抗凝(低分子肝素5000u皮下注射,每日2次)、和(或)降脂(辛伐他汀片20mgqN)及活血化瘀(奥扎格雷钠40mgqd)、清除自由基(依达拉奉30mg bid)等治疗,对照组仅给予常规的活血化瘀、营养神经等治疗,观察治疗前和治疗10d后患者的血清死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量的变化,以及肝功能、血小板、凝血机制及临床神经功能缺损评分进行评定,进一步探讨NMDA受体和死亡蛋白激酶1(DAPK1)在缺血性脑血管疾病的相互作用机制。结果溶栓组及常规治疗组患者的死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量均高于对照组,治疗10天后溶栓组及常规治疗组患者的死亡蛋白激酶1(DAPK1)含量均降低,常规治疗组更明显(P<0.05),溶栓组的神经功能缺损评分(NIHSS)明显降低(P<0.05),临床疗效明显优于常规治疗组(P<0.05),肝功能、血小板、凝血功能、血脂的指标均在正常范围内。结论死亡蛋白激酶1(DAPK1)通过与NMDA受体的NR2B亚型结合激活神经细胞死亡通路,激发神经细胞死亡,形成卒中[2],为缺血性脑血管病的防治提供临床依据。

肺鳞状细胞癌中死亡相关蛋白激酶的表达

目的 检测肺鳞状细胞癌中死亡相关蛋白激酶 (DAP K)mRNA表达及细胞凋亡 ,探讨DAP K与细胞凋亡的关系及其在肺鳞状细胞癌发生、发展中的作用。方法 用原位分子杂交法检测 6 0例肺鳞状细胞癌、9例癌旁肺组织DAP KmRNA表达 ;用原位末端标记TUNEL法检测相应组织中细胞凋亡 ,计算凋亡指数 (AI)。结果 肺鳞状细胞癌的DAP KmRNA阳性表达率为 4 6 7% ,癌旁肺组织为 6 7 7% ,其阳性率高于肿瘤组织 (P <0 0 1 )。在肺鳞状细胞癌中 ,高分化癌DAP KmRNA阳性率为 70 % ,低分化癌为 2 3 3% ,高分化癌的DAP KmRNA阳性率高于低分化癌 (P <0 0 1 )。肺鳞状细胞癌的细胞AI为(0 6 72 8± 0 4 2 6 1 ) % ,癌旁肺组织中支气管肺泡上皮细胞AI为 (1 0 2 89± 0 2 4 33) % ,癌旁肺组织的AI高于肿瘤组织 (P<0 0 1 )。在肺鳞状细胞癌中 ,高分化癌的AI为 (0 5 82 3± 0 1 92 2 ) % ,低分化癌为 (0 4 4 6 0± 0 1 92 5 ) % ,高分化癌的AI高于低分化癌 (P <0 0 1 )。DAP KmRNA呈阳性表达的肺癌 ,其AI为 (0 5 31 7± 0 2 0 97) % ;DAP KmRNA呈阴性者 ,其AI为 (0 4 872± 0 1 91 8) % ,两组间差异有显著性 (P <0 0 5 )。在连续切片上 ,DAP KmRNA阳性细胞的分布区域与凋亡阳性细胞的分布相似。DAP KmRNA呈阳性表达?

死亡相关蛋白激酶在肝细胞癌中的表达及其临床意义

目的研究死亡相关蛋白激酶(death associated protein kinase,DAPK)在原发性肝细胞癌(HCC)组织中的表达及其与HCC临床病理特征的关系。方法应用免疫组织化学SP法检测DAPK在50例HCC组织及其癌旁组织和5例正常肝脏组织中的表达。结果 DAPK在HCC组织中的阳性率为36%,明显低于癌旁组织62%及正常肝组织100%(P<0.05);DAPK低表达与HCC组织分化程度、淋巴结转移有关(P<0.05)。结论 DAPK表达下调在HCC的发生发展中可能起重要作用。

5-氮杂-2'-脱氧胞苷对人胃癌细胞株BGC803生长及死亡相关蛋白激酶基因表达的影响

目的探讨去甲基化药物5-氮杂-2'-脱氧胞苷(5-Aza-Cd R)对人胃癌细胞BGC803增殖、凋亡及对死亡相关蛋白激酶(DAPK)m RNA表达水平的影响。方法用不同浓度的5-Aza-Cd R处理BGC803细胞,设立不含5-Aza-Cd R的对照组及3个实验组:5-Aza-Cd R 1μmol/L组、5-Aza-Cd R 5μmol/L组、5-Aza-Cd R 10μmol/L组。CCK-8检测细胞的增殖情况,AnnexinⅤ/PI双染及流式细胞术检测药物处理后细胞凋亡的情况,RT-PCR检测用药前后DAPK m RNA的表达水平变化。结果实验组BGC803细胞增殖速度显著低于对照组,细胞凋亡率显著升高(P<0.05)。RT-PCR结果显示,BGC803细胞中DAPK基本无表达,5-Aza-Cd R处理后,细胞中DAPK m RNA表达量显著高于对照组(P<0.05)。结论 5-Aza-Cd R抑制BGC803细胞增殖,并促进细胞凋亡,可能与其诱导DAPK基因表达有关。

死亡相关蛋白激酶在急性白血病细胞中的表达及临床意义

目的探讨死亡相关蛋白激酶(DAPK)表达与急性白血病(AL)患者临床特征之间的关系。方法应用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)法检测DAPK mRNA在54例AL患者(AL组)及18例骨髓移植供者和健康体检者(对照组)骨髓细胞或外周血中的相对表达量。结果 AL组DAPK mRNA表达量(0.104 8±0.094 1)明显低于对照组(0.356 7±0.106 1),差异有统计学意义(P<0.01)。急性淋巴细胞白血病(ALL)患者DAPK mRNA表达(0.057 7±0.099 5)低于急性髓系白血病(AML)患者(0.119 80±0.088 42),差异有统计学意义(P=0.003 7)。DAPK mRNA表达改变与患者WBC计数、纤维蛋白原呈正相关(P<0.05);与患者的性别、年龄、AML亚型、初诊AL第一次诱导缓解治疗疗效等结果均无相关性(P>0.05)。结论 DAPK mRNA表达在白血病细胞中显著降低。

肺腺癌转移相关转录本-1沉默对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶通路的影响

目的 探讨RNA干扰技术(RNAi)沉默肺腺癌转移相关转录本-1(MALAT-1)基因对喉癌细胞增殖、凋亡及丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路影响。方法体外培养人喉癌细胞Hep-2、正常永生化表皮细胞Hacat,采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测细胞中MALAT-1mRNA表达水平。采用RNAi技术将MALAT-1阴性对照质粒、si-MALAT1分别转染至Hep-2细胞,命名为si-NC组、si-MALAT1组,未处理组作为空白对照组,分别检测三组Hep-2细胞中MALAT-1及B淋巴细胞瘤-2基因(Bcl-2)、Bax、caspase-3mRNA表达水平、Bcl-2、Bax、caspase-3、磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)及其磷酸化蛋白(p-PI3K)、Akt及其磷酸化蛋白(p-Akt)蛋白表达情况以及细胞增殖及凋亡情况。结果 与正常细胞相比,喉癌Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(3.24±1.02)升高(P<0.05);与空白对照组、si-NC组相比,si-MALAT-1组Hep-2细胞中MALAT-1mRNA表达水平(0.47±0.08)及Bcl-2mRNA(0.56±0.09)及蛋白(0.31±0.05)表达降低,细胞增殖抑制率及凋亡率[(20.48±3.41)%]均升高,Bax、caspase-3mRNA(3.02±0.50、2.58±0.43)及蛋白表达(0.86±0.14、0.94±0.16)均升高,p-PI3K、p-Akt蛋白表达(0.57±0.10、0.51±0.08)均降低(P均<0.05)。结论 MALAT-1沉默可抑制人喉癌细胞系Hep-2细胞增殖并提高其凋亡率,推测可能通过影响Akt信号通路诱导癌细胞凋亡。

p38和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1在内膜损伤后血管平滑肌细胞表型转化过程中的表达变化

目的观察动脉内膜损伤后血管平滑肌细胞表型转化和p38及丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1表达的动态变化。方法分别用免疫组织化学、免疫印迹和逆转录聚合酶链反应方法检测假损伤组和损伤后不同时间点血管壁中增殖细胞核抗原、平滑肌a肌动蛋白、p38蛋白和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1蛋白及其mRNA的表达。结果假损伤组血管中膜平滑肌细胞及内皮细胞增殖细胞核抗原为阴性表达；损伤后5～14天，新生内膜阳性细胞率逐渐增加．28天后开始逐渐减少，且新生内膜阳性率均略高于中膜。假损伤组血管中膜平滑肌a肌动蛋白表达为阳性，内皮为阴性：中膜阳性面积于损伤后1天开始减少，3天最为明显，5天后开始逐渐增加，且新生内膜阳性表达略低于中膜。假损伤组血管中膜p38呈阴性或弱阳性着色；损伤后1～35天呈持续高表达，新生内膜阳性表达高于中膜。p38表达变化与增殖细胞核抗原表达变化呈正相关。假损伤组血管中膜丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1呈弱阳性或阳性表达；损伤后1天即开始下降，14-28天稍有回升，至35天仍未回到假损伤组水平，且新生内膜阳性面积稍低于中膜。其表达变化与增殖细胞核抗原表达变化呈负相关。结论内膜损伤后血管平滑肌细胞增殖能力与其表型转化密切相关，p38和丝裂原活化蛋白激酶磷酸酶1参与了损伤后血管平滑肌细胞表型转化的信号转导及调节。