通过打破抗原特异性T细胞免疫耐受控制慢性HBV感染

乙型肝炎病毒(HBV)感染诱导机体抗病毒免疫应答,若不能对病毒有效清除,体内抗原特异的CTL降低,出现抗原特异性T细胞免疫耐受,造成慢性肝脏炎症。分析HBV感染时抗原特异性T细胞免疫耐受机制,并通过打破免疫耐受预防HBV感染。

百里醌对95-D细胞的毒性作用

目的探讨百里醌(TQ)对95-D细胞毒性分子机制。方法95-D肺鳞癌细胞接种于96孔板,予20、40、60、80、100μmol/L TQ培养24 h,观察浓度依赖性,计算TQ IC_(50)值;予20和40μmol/L TQ作用于95-D,实验组分别加入JNK(SP600125 5μmol/L)、ERK(U0126 10μmol/L)和p38(SB203580 10μmol/L)抑制剂1 h,再加入含上述浓度抑制剂配制的TQ培养24 h,MTT测细胞活力,Western blot测目标蛋白,观察抑制剂阻断TQ的效果及其分子机制。结果(1)TQ呈浓度依赖性毒杀95-D细胞,降低95-D细胞活率,TQ IC_(50)≈37μmol/L;(2)SP600125和U0126预处理联合20和40μmol/L TQ均可显著降低95-D细胞活力(P<0.05),而SB203580预处理加20μmol/L TQ对95-D有保护作用(P>0.05),当TQ浓度超过IC_(50)时SB203580对95-D保护作用显著下降(P<0.05);(3)TQ呈浓度依赖性磷酸化p38和ERK1/2,TQ发挥细胞毒杀作用不依赖于p53,TQ透过活化caspase9途径诱导95-D细胞凋亡,SB203580可通过减少caspase9磷酸化发挥抗凋亡作用;(4)SB203580预处理1 h后,再加入含SB203580对应浓度的TQ培养24 h,SB203580并不能完全阻断细胞毒杀。结论TQ透过磷酸化p38-caspase9途径介导95-D细胞毒杀作用,而不是ERK1/2和JNK途径。

疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性检测方法的建立

目的建立一种基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性的方法,以完善疫苗及基因治疗药物的评价方法。方法用羧基荧光素二乙酸盐琥珀酰亚胺酯(Carboxyfluorescein diacetate,succinimidyl ester,CFSE)标记淋巴细胞,利用肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNFα)模拟杀伤淋巴细胞,用碘化丙啶(Propidium iodide,PI)染色,流式细胞仪检测,确定CFSE和PI的浓度及作用时间。利用已确知有较强细胞免疫作用的治疗性乙型肝炎疫苗免疫小鼠,分离特异性淋巴细胞并用特异性肽刺激,分离未免疫小鼠的淋巴细胞作为靶细胞,并用特异性抗原肽致敏,并从靶细胞的标记、效应细胞培养时间,效靶作用时间、效靶比几方面进行优化,确定试验方法的操作流程。结果采用CFSE/PI双标记能有效分离实验所需各组群,细胞分为CFSE+PI-、CFSE+PI+、CFSE-PI+、CFSE-PI-4个组群,可区分活细胞和凋亡细胞。CFSE标记靶细胞的时间为6 h;效应细胞培养时间为72 h;效靶作用时间为6 h;效靶比可使用100∶1和50∶1。结论建立了基于流式细胞术的评价疫苗诱导的特异性细胞杀伤活性的方法,该方法可有效和精确地评价CTL杀伤效应,完善了疫苗及基因治疗药物的评价方法。