动物细胞永生化研究进展

细胞永生化是指通过各种手段、方式来突破原代细胞衰老的限制,延长细胞寿命,实现细胞无限复制增殖,是当前生物医学领域研究的一个热点与难点。永生化细胞株/系可用于生物制品研发、衰老机制探索以延伸生命等;然而目前永生化细胞种类不多、永生化技术相对较难,肿瘤风险以及动物福利伦理等原因,还不能满足研发需求。目的细胞永生化不仅可以永久保存动物细胞遗传资源,还对多种疾病的诊断、治疗及细胞基质疫苗的研发等提供支持。本文就动物细胞永生化的原理、永生化机制及方法的研究最新进展进行综述,为未来的生物医学研究和应用提供参考。

树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株的建立及鉴定

目的建立树鼩视网膜来源的微血管内皮细胞的体外分离培养技术以及永生化细胞株,为体外利用树鼩视网膜微血管内皮细胞开展相关研究提供新的实验材料。方法利用Ⅱ型胶原酶、分散酶和DNaseⅠ酶消化法分离培养出原代视网膜微血管内皮细胞,利用差速消化法纯化内皮细胞,然后利用携带SV40T基因的慢病毒转染细胞,再挑取单克隆后进行传代培养。对传至50代以上的细胞进行形态学观察、免疫荧光鉴定以及核型鉴定。结果采用混合酶消化法能够分离获得微血管内皮细胞,纯化后的细胞呈不规则多角形和梭形。经慢病毒转染后的细胞传代培养后细胞形态一致,到第50代时细胞形态结构仍较好。细胞免疫荧光结果显示标志性蛋白VWF、CD34、Claudin1、ZO-1和永生化SV40T表达阳性。生长曲线结果显示:细胞生长旺盛,第2~4天时处于对数生长期,第4天进入平台期。细胞核型结果显示:染色体数与树鼩染色体相同,即所获取的细胞为永生化的树鼩视网膜微血管内皮细胞。结论成功建立的树鼩视网膜微血管内皮细胞永生化细胞株具有较好的形态结构与功能,为视网膜病变及眼科相关疾病的研究提供了新的实验材料。

细胞永生化技术及其应用研究进展

细胞永生化是目前细胞生物学研究的热点之一.引起细胞永生化的因素很多,其中端粒酶在这一过程中发挥重要作用.细胞永生化技术在未来的成功应用,不仅为生物制品的研究与开发提供了有力工具,而且也为疾病的诊断与治疗提出了新的思路.就细胞永生化技术的原理、方法、途径及其应用等方面研究进展作一综述.

SV40与细胞永生化

目的 探讨 SV40如何介导细胞永生化 ,与细胞永生化现象相关的因素及它们的作用。方法 复习近十年有关细胞永生化与复制衰老现象研究的文章 ,对 SV40介导的细胞永生化及其相关因素进行综述。结果细胞永生化涉及病毒 DNA的整合 ,端粒酶的活化 ,生长抑制因子的失活等多方面的因素 ,它们的作用机制密切相关。结论 细胞永生化的研究有助于更广义地理解细胞生物学现象 ,并可作为标准细胞在细胞工程及组织工程的研究中发挥作用。

端粒酶反转录酶基因介导的人骨髓基质干细胞永生化研究

目的建立永生化人骨髓基质干细胞系,为组织工程提供种子细胞库及标准化细胞系。方法取单克隆培养的人骨髓基质干细胞,采用脂质体转染法将人端粒酶反转录酶(hTERT)基因导入细胞,G418筛选后获得阳性克隆,体外连续扩增培养,RT-PCR检测转染细胞内hTERT基因的整合与表达。取转染后第100代细胞,用成骨诱导条件培养基(普通培养基加地塞米松、β-甘油磷酸、维生素C)、软骨诱导条件培养基(普通培养基加地塞米松、TGF-β、维生素C)、心肌细胞诱导条件培养基(普通培养基加5-氮胞苷)分别向成骨、软骨、心肌细胞诱导培养。于培养后第7、14、21、28天,采用免疫细胞化学染色观察成骨细胞诱导Ⅰ型胶原、骨钙素的表达;采用茜素红染色观察钙结节形成;采用免疫细胞化学染色观察软骨细胞诱导Ⅱ型胶原的表达,同时进行甲苯胺蓝染色;采用免疫细胞化学染色观察心肌细胞诱导横纹肌肌动蛋白的表达,分析细胞系向成骨、软骨及心肌细胞分化的能力。结果 hTERT稳定转染入人骨髓基质干细胞,转化细胞端粒酶表达阳性。转化细胞在体外长期连续培养下生长良好,已传至136代。取第100代细胞进行诱导分化,结果显示其能向成骨、软骨及心肌细胞分化。结论外源性hTERT的导入可致人骨髓基质干细胞永生化,并维持成体干细胞的多向分化特性,可为组织工程提供种子细胞库并为组织工程种子细胞研究提供标准化细胞。

细胞永生化机制及不同细胞永生化方法研究进展

永生化细胞是一种在理化刺激、基因突变、病毒感染等外界刺激下,可以在体外无限增殖的不衰老细胞株。细胞永生化机制有放射性因素、端粒-端粒酶激活、病毒基因转染及抑癌基因受抑制等学说。作者在总结细胞永生化原理的基础上阐述不同组织细胞永生化的技术方法及生长状态。

脆性X综合征外周血淋巴细胞永生化细胞系的建立与验证

脆性 X 综合征(fragile X syndrome,FXS)是一种 X 连锁不完全外显性遗传病,是引起遗传性智力低下和孤独症谱系障碍最常见的单基因病[1],因细胞中 X 染色体末端在特殊培养基中经诱变剂作用后可显示如同断裂的脆性部位而得名。

端粒酶在细胞永生化及肿瘤诊断中的作用

端粒酶是一种新的肿瘤标记物,细胞永生化是细胞获得持续生长增殖能力的特性,永生化的细胞有无限增殖生长性,可长期传代。综观国内外的研究情况,端粒酶在肿瘤的诊断上尚有可观的价值,已成人类的研究热点,现已确知在85%的人肿瘤组织中发现了端粒酶活性的表达,因此,已把端粒酶作为肿瘤基因诊断的指标和治疗的新靶点。

Epstein-Barr病毒(EBV)及其介导的细胞永生化

Epstein- Barr病毒 (EBV)因其与众多肿瘤的相关性以及其在体外能使 B淋巴细胞永生化形成淋巴母细胞样细胞系 (L CL s)的特性而成为近年来细胞永生化研究的热点之一。研究表明 ,EBV主要是通过其潜伏蛋白激活细胞因子与其受体相互作用的途径而使细胞永生化的 ,但是病毒蛋白的具体作用机制尚无定论。本文综述了 EBV生物学特性方面近年来的研究成果 ,并以 L CL s为切入点初步探讨了 EBV介导的细胞永生化。

无病毒可回复性肝细胞永生化载体的构建和结构鉴定

目的构建不携带病毒基因且可回复的肝细胞永生化载体,优化目前的肝细胞永生化方法。方法构建含人端粒酶逆转录酶(hTERT)基因的无病毒可回复性肝细胞永生化载体,PCR扩增attB1-Kozak-hTERT(前端)-attB2和attB1-hTERT(后端)/E2A/eGFP/F2A/neo-attB2,对相应大小条带切胶回收后,通过Gateway重组克隆技术BR反应和LR反应,以及酶切连接,构建最终目的载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo。结果 PCR及酶切和测序鉴定均证实成功构建了肝细胞永生化载体PB-hTERT/E2A/eGFP/F2A/neo,目的基因序列与GenBank报道一致。结论成功构建不携带病毒基因且可实现回复的肝细胞永生化载体,有望提高永生化肝细胞临床应用的安全性。

自体心肌细胞移植、hTERT与心肌细胞永生化

解决自体心肌细胞移植细胞来源问题的策略之一是实现心肌细胞永生化。本文对永生化的心肌细胞 :AT 1细胞 ,HL 1细胞 ,心脏干细胞以及hTERT与心肌细胞永生化的关系作一综述。

端粒和端粒酶与细胞永生化的关系

端粒和端粒酶与细胞永生化的关系陈铁河印木泉综述第二军医大学分子毒理教研室上海２００４３３正常细胞与恶性肿瘤细胞的生物学特性截然不同，前者呈寿命有限的自主生长，而后者则呈寿命无限的失控生长。是什么因素赋予恶性细胞这种特性呢？这一直是生命科学中亟待解答的...

许旺细胞永生化研究进展

许旺细胞在周围神经损伤神经再生中起主要作用。许旺细胞永生化具有无限传代的特点,有望为周围神经组织工程研究带来突破。该文就许旺细胞永生化机制、生物学特性、永生化方法及在人工神经中的作用研究,作一综述。

舌癌淋巴道转移模型中分离并建立舌癌细胞永生化细胞系

目的:在建立舌癌Tca8113淋巴道转移裸鼠模型的基础上,建立永生化的舌癌细胞系,并进一步探讨舌癌转移淋巴结组织中同源癌细胞相关标记物的表达情况,为舌癌干细胞研究提供基本的研究模型。方法:采用癌细胞足垫注射法建立淋巴道转移模型,4周后取淋巴结进行原代细胞培养并分离、纯化舌癌细胞进行连续传代培养、进行永生化细胞系的生物学特性鉴定。结果:在淋巴道转移模型中,HE染色与EMA免疫组化染色发现淋巴结有散在或灶性鳞状上皮癌细胞转移。进而取转移模型裸鼠的淋巴结组织进行原代细胞培养,经分离和纯化以及连续传代而建立舌癌永生化细胞系,命名为Tca8113-Ml,目前传代100余代,时间近2年,生长稳定,倍增时间为22.51h,染色体众数58,保持人染色体形态,细胞形态与Tca8113细胞相似。Tca8113-Ml在裸鼠体内的成瘤率为100%,裸鼠腋窝皮下成瘤的组织切片显示为典型的鳞状上皮细胞癌。结论:在舌癌淋巴道转移模型中,可分离培养与建立永生化的舌癌细胞系。

可回复性肝细胞永生化载体pCTGTKlox的构建、鉴定、转染与表达

目的构建可回复性永生化逆转录病毒载体,为肝细胞可回复性永生化奠定基础。方法扩增加强型绿色荧光蛋白(EGFP)及胸腺激酶(TK)并采用重叠延伸拼接法(SOE)连接EGFP和TK,将EGFP-TK融合基因亚克隆至pBABE-puro-lox,构建成新载体pBGTKlox,再将永生化基因SV40T连接至pBGTKlox,构成新载体pBTGTKlox,最后将雌激素受体与重组酶融合基因(Cre-ER)连接至pBTGTKlox,构成新载体pCTGTKlox。将pCTGTKlox和pPDF15质粒共转染包装细胞PT67,并在荧光显微镜下观察绿色荧光蛋白的表达。免疫组化染色检测SV40T基因的表达。结果成功构建包含EGFP-TK、SV40T、Cre-ER及重组序列loxP的新载体pCTGTKlox,经酶切鉴定证实为重组阳性体,经测序验证无核苷酸突变。pCTGTKlox转染PT67细胞24h后,荧光显微镜下可见散在多处绿色荧光。免疫组化染色显示细胞胞核呈阳性染色。结论成功构建并表达可回复性永生化逆转录病毒载体pCTGTKlox,为细胞的可回复性永生化提供了一种良好的新型载体。

端粒酶与细胞永生化

建立永生化细胞系是生物学研究的热点和难点之一。位于真核生物细胞染色体末端的端粒可以稳定染色体 ,而由RNA和蛋白质组成的端粒酶以自身RNA为模板合成端粒。因此 ,将外源性端粒酶逆转录酶 (TERT)基因转染至目的细胞 ,则可能通过M 1期 -M 2期机制 ,诱导细胞发生永生化。目前 ,人视网膜色素上皮细胞、肺成纤维细胞等已被此方法永生化 。

细胞永生化技术研究进展

细胞永生化作为细胞生物学研究的热点,在细胞实验中发挥很大的作用,使目的细胞永生化,建立永生化细胞系,可以更好地开展细胞实验。细胞永生化技术的成功应用,不仅为生物实验研究提供了有力的工具,也为有效准确地诊断疾病提供了新道路。本文在细胞永生化基本机制的基础上,就细胞永生化技术方法、检测方法以及存在的问题等方面研究进展进行概述。

瘢痕疙瘩家系外周血淋巴细胞永生化方法探讨

目的探讨建立瘢痕疙瘩家系永生化细胞库的方法,为研究瘢痕疙瘩的发病机制、诊断和治疗提供长期的标本来源。方法采用EB病毒转化技术,分别采用新鲜血法和冻存血法,将瘢痕疙瘩家系外周血B淋巴细胞转化成永生化淋巴母细胞系。结果成功建立了一瘢痕疙瘩家系中27个个体的永生细胞株:新鲜血法较冻存血法可明显提高一次建系成功率。结论 EB病毒转化技术可有效保存原来个体完整的基因组,为以后的相关研究提供了长期的DNA资源。新鲜血法明显优于冻存血法,更适用于永生化细胞库的建立。

细胞永生化的研究进展

永生细胞系具有无限增殖能力,其自我更新能力、增殖分化模式、基因表达调控以及癌症等疾病研究一直以来也是分子细胞生物学领域的研究热点与难点。细胞永生化是指细胞在体外培养的时候,由于自身基因改变或者外界因素刺激,例如细胞周期检查点通路受损、端粒酶的再次激活上调、原癌基因激活等影响,使细胞分裂加快,并突破了自我衰老与凋亡机制,从而实现了无限增殖,可以进行长期传代培养。目前,科研人员已成功建立了很多不同物种、不同组织来源的永生化细胞系,在研究真核细胞发育、分子调控机制等方面发挥了重要作用,但是细胞发生永生化的分子机制和影响细胞永生的因素还需要继续探索。本文综述了目前已发现的部分细胞永生化机制,以及各种不同组织来源永生化细胞系的重要性,为揭示更多的细胞永生化机制和细胞系建立方法提供基础。