重叠延伸PCR法构建VPS4B基因定点突变真核表达载体

目的构建含液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)基因定点突变的真核表达载体。方法用RT-PCR法从HuH-7细胞中扩增VPS4B基因,并克隆到真核载体pXF3H上。采用重叠延伸PCR定点突变技术,构建K180Q和E235Q两种突变质粒,经DNA测序确证定点突变的结果,再将VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞,western blot检测融合蛋白表达。结果克隆了VPS4基因,构建了真核载体pXF3H-VPS4B,经重叠延伸PCR得到突变体。DNA测序结果显示,编码180位氨基酸的538～540位碱基由AAG突变为CAG;编码235位氨基酸的703～705位碱基由GAA突变为CAA,其他碱基均无突变。VPS4B及两种突变载体转染HepG2细胞可检出HA-VPS4B融合蛋白表达。结论成功构建了VPS4以及K180Q和E235Q两种突变的真核表达载体。

VPS4B显性负性突变体抑制乙型肝炎病毒复制

目的观察细胞液泡蛋白质分选因子4B(VPS4B)显性负性突变体VPS4B-K180Q在体外抑制乙型肝炎病毒(HBV)复制的效应。方法用不同剂量野生型VPS4B真核表达质粒pXF3H-VPS4B和K180Q突变型真核表达质粒pXF3H-K180Q与pHBV1.3共转染Huh7细胞,时间分辨荧光免疫分析法(TRFIA)定量检测细胞培养上清中的HBsAg和HBeAg含量,Southernblot分析细胞内HBV核衣壳相关DNA水平,实时定量PCR检测HBV相关mRNA水平变化。结果野生型VPS4B可抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较弱;低剂量突变型VPS4可显著抑制HBsAg和HBeAg的分泌,对细胞内HBV核衣壳相关DNA和mRNA的抑制作用较强,且均呈剂量依赖的抑制效应。结论 VPS4B及其显性负性突变体可在体外表现出抗HBV的作用,突变型VPS4B抑制HBV能力高于野生型VPS4B。