ROCK抑制剂Y-27632在角膜保存时对角膜缘干细胞活性的促进作用

背景 角膜缘干细胞（LSCs）对维持角膜上皮的稳定和角膜组织透明性有重要作用.Rho关联卷曲螺旋蛋白激酶（ROCK）抑制剂Y-27632能够促进人胚胎干细胞、角质上皮细胞等的增生,减少细胞凋亡.目的 探讨Y-27632对离体兔角膜保存和体外LSCs扩增能力的影响. 方法 在细胞培养基MEM中加入质量分数12.5％硫酸软骨素、质量分数10.0％低分子右旋糖酐、20.0 mg/L地塞米松、100 mg/L妥布霉素注射液、9.5 g/L Hepes,使用时添加0.375 mg/L L-谷氨酰胺,制备成角膜活性保存液.将新西兰大白兔的角膜组织片分别置于含或不含Y-27632的角膜活性保存液中保存4、7、14d,采用质量分数0.25％锥虫蓝和质量分数0.2％茜素红染色法观察角膜内皮细胞密度及形态,采用Giemsa染色法并使用Image J图像分析软件计数克隆球数量和LSCs活性,计算LSCs存活率和克隆形成效率. 结果 角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞形态无明显差别,角膜片保存7d时,Y-27632保存液组角膜内皮细胞形态仍保持规则的六边形,而单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞的细胞膜轻微皱缩,少数细胞体积变大.角膜片保存14 d时单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞可见较多的茜素红斑.单纯角膜中期保存液组角膜内皮细胞计数为（2 262±75）/mm2,Y-27632保存液组角膜内皮细胞计数为（2 425 ±95）/mm2,差异有统计学意义（P＜0.001）.新鲜角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组和单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆球均较大,其内细胞数较多,而保存7d和14 d时,与Y-27632保存液组比较,单纯角膜中期保存液组LSCs克隆球直径明显缩小.新鲜分离的角膜片和角膜片保存4d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成率和角膜上皮细胞存活率的差异均无统计学意义（均P＞0.05）;角膜片保存7d和14d时,角膜缘上皮细胞的活性率分别为（73.00±2.12）％和（56.00±0.71）％,明显高于单纯角膜中期培养液组的（66.00±4.00）％和（49.00±0.71）％,差异均有统计学意义（t=3.098,P=0.018;t=9.798,P=0.000）;角膜片保存7d和14 d时,Y-27632保存液组与单纯角膜中期保存液组LSCs的克隆形成效率分别为（11.05±0.21）％和（3.10±1.97）％,明显高于单纯角膜中期保存液组中的（2.05±1.20）％和（0.40±0.14）％,差异均有统计学意义（t=18.107,P=0.000;t=3.184,P=0.017）.结论角膜保存液中添加Y-27632可明显提高离体角膜保存的效果,同时可维持LSCs的活性及克隆形成能力.Y-27632可作为角膜保存液的有效添加成分。

银杏叶提取物对体外培养的人Müller细胞氧化损伤的保护作用

背景 氧化应激是视网膜损伤中重要的病理生理过程,探讨保护视网膜免受氧化应激损伤的方法具有重要的临床意义.研究证实银杏叶提取物具有抗氧化、抗凋亡、抗血栓、抗炎等多种功能,但其对人Müller细胞的抗氧化作用研究较少. 目的 研究银杏叶提取物（EGb）对氧化剂三氧化二砷（As2O3）诱导的人Müller细胞氧化应激损伤的保护作用及其机制. 方法 人Müller细胞株用含体积分数10％胎牛血清（FBS）、2μmol/L谷氨酰胺和质量分数1％青链霉素双抗的DMEM/F12培养液进行培养和传代,取对数生长期的Müller细胞分为5个组,阴性对照组细胞采用常规培养法进行培养,在培养基中加入终质量浓度为5 mg/L的As2 O3处理细胞24 h以建立细胞氧化损伤模型,然后将5、10和20 mg/L EGb分别加入模型细胞培养液中作用24 h,采用MTT法检测各组细胞的活力;采用CM-H2DCFDA荧光探针法测定各组细胞活性氧簇（ROS）含量;采用逆转录PCR（RT-PCR）法检测细胞中easpase-3 mRNA的相对表达量;采用Western blot法分别检测细胞质和细胞核中Nrf2蛋白的表达. 结果 Müller细胞接种至培养瓶后24 h,倒置显微镜下可见接种细胞贴壁良好,培养6～7d时Müller细胞的细胞体积较大,细胞质丰富,呈镶嵌样排列.As2O3处理组部分细胞凋亡,呈卵圆形悬浮在培养液中.MTT法测定结果表明,阴性对照组细胞活力（A值）最高,As2 O3处理组细胞活力最低,而As2O3 ＋5 mg/L EGb组、As2O3＋10 mg/L EGb组和As2O3＋20 mg/L EGb组A值随着EGb质量浓度的增加而逐渐增加,各组间总体比较差异有统计学意义（F=163.57,P=0.00）.阴性对照组细胞中ROS荧光强度最弱,As2O3处理组最强,As2O3 ＋5 mg/L EGb组、As2O3＋10 mg/L EGb组和As2 O3 ＋20 mg/L EGb组细胞中ROS荧光强度值随着EGb质量浓度的升高而逐渐减弱,各组间细胞中ROS荧光强度值的总体比较差异有统计学意义（F=4 013.61,P=0.00）.细胞内caspase-3 mRNA的相对表达量随EGb质量浓度的升高逐渐下降,各组间总体比较差异有统计学意义（F=2 199.72,P=0.00）.各组细胞质中Nrf2蛋白的表达比较,差异无统计学意义（F=15.42,P=0.40）;阴性对照组、As2O3处理组及As2O3＋5 mg/L EGb组、As2O3＋ 10 mg/L EGb组和As2 O3 ＋20 mg/L EGb组细胞核Nrf2蛋白表达量（灰度值）分别为100.01±0.04、46.59±0.63、54.51 ±0.62、59.93±0.17和67.60±0.24,总体比较差异有统计学意义（F=7271.72,P=0.00）,其中阴性对照组细胞核Nrf2蛋白表达量最低,而As2O3处理组最高,差异均有统计学意义（均P＜0.05）. 结论 EGb以剂量依赖的方式减轻体外培养的人Müller细胞的氧化应激损伤,其机制与抗氧化和抗凋亡作用有关,其减轻Müller细胞氧化应激损伤的调控主要发生在细胞核。