人H1启动子转录shRNA的细胞种属特异性研究

利用siDirect软件预测绿色荧光蛋白(GFP)基因特异性小干扰RNA(siRNA),将人工合成的相应shRNA插入含人H1启动子的pSuper载体,获得表达载体pSuper-shRNA,再将H1-shRNA插入表达GFP基因的peGFP-N1载体,获得表达载体peGFP-H1-shRNA。分别以pSuper-shRNA+peGFP-N1和peGFP-H1-shRNA转染COS-1、293-T、鸡胚肝(CEL)和鸡胚成纤维(CEF)细胞,根据相同条件下GFP阳性细胞数及荧光强度变化判断产生的siRNA对GFP基因表达的沉默作用,比较人H1启动子在哺乳动物和禽源细胞中的转录活性。结果表明:人H1启动子在2种哺乳动物细胞中能有效转录shRNA,但在2种禽源细胞中的转录活性很弱,提示在禽源细胞中表达siRNA和进行基因沉默研究应选用禽源启动子。

禽源细胞中miRNA表达方法建立及基因沉默效率检测

从Genscript软件预测的10个GFP报告基因序列特异性miRNA中随机选择1个,通过PCR法合成相应双链寡核苷酸,插入含鸡U6启动子的pRFPRNAiC载体,获得pRFPRNAiGFP;将pRFPRNAiGFP与peGFP-N1共转染COS-1、293-T、CEL和CEF细胞,在RT-PCR法确定miRNA表达后,根据转染细胞中GFP阳性细胞数及荧光强度变化,比较鸡U6启动子在哺乳动物源和禽源细胞中介导的miRNA沉默效率。结果显示,pRFPRNAiGFP在哺乳动物和禽源细胞中都能表达抑制性miRNA,但在禽源细胞中的基因沉默效率较高。因此,pRFPRNAiC可作为禽源细胞中表达miRNA的载体,GFP则是检测沉默效率的很好的报告基因,本研究为在禽源细胞中进行RNAi研究创建了平台。