幽门螺杆菌及其毒力因子空泡细胞毒素A对人胃腺癌细胞DNA同源重组修复和细胞周期的影响

目的研究幽门螺杆菌(Hp)标准株Hp P12和其毒力因子空泡细胞毒素A(VacA)对人胃腺癌细胞DNA损伤、同源重组修复和细胞周期的影响。方法取对数生长期的人胃腺癌AGS细胞,应用Hp标准株(Hp P12)和其VacA基因敲除株(Hp P12ΔVacA)以感染复数(multiplicity of infection,MOI)100分别感染AGS细胞,使用Western Blot方法检测DNA损伤标记蛋白γH2AX、HR修复关键蛋白(Rad51、CtIP、pCtIP)、细胞周期检测点激酶2(pCHK2)的表达水平,进一步用流式细胞术检测细胞周期,验证Hp P12及其毒力因子VacA对HR修复和细胞周期的影响。结果DNA损伤标记蛋白γH2AX的表达,在Hp P12感染组较未感染组上调(6 h:t=4.870,P=0.001;12 h:t=4.118,P=0.003),在Hp P12ΔVacA感染组较Hp P12感染组下调(6 h:t=4.669,P=0.002;12 h:t=3.117,P=0.013)。Rad51、CtIP、pCtIP和pCHK2的表达在Hp P12感染12 h组较未感染组下调(Rad51:t=22.740,P<0.001;CtIP:t=31.970,P<0.001;pCtIP:t=3.777,P=0.020;pCHK2:t=10.740,P<0.001),而Rad51、pCHK2的表达在Hp P12ΔVacA感染12 h组均较Hp P12感染12 h组上调(Rad51:t=5.637,P=0.005;pCHK2:t=3.726,P=0.006)CtIP的表达在Hp P12ΔVacA感染6 h组较Hp P12感染6 h组上调(t=4.580,P=0.002)。进一步采用流式细胞术检测细胞周期发现Hp P12感染组G 1期细胞数较未感染组下调(t=11.530,P<0.001),S期细胞数上调(t=8.583,P=0.001)。而Hp P12ΔVacA感染组G 1期细胞数较Hp P12感染组上调(t=5.781,P=0.004),S期细胞数下调(t=5.481,P=0.005)。结论Hp P12标准株感染人胃腺癌细胞后引起DNA损伤,抑制了细胞HR修复,并引起细胞周期阻滞,其中VacA毒力因子起到了重要作用。

幽门螺杆菌空泡细胞毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)研究进展

1988年Leunk等发现幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,H.pylori)肉汤培养基的上清液含有一种使多种体外培养的真核细胞系发生空泡样变性的毒素,1992年这种毒素得以纯化并被命名为空泡细胞毒素(Vacuo-1ating cytotoxin,VacA).1994年完成了编码VacA的基因vacA的克隆和序列分析,由此VacA作为H.pylori致病的主要毒力因子引起了研究者的广泛兴趣和关注,本文将综述近十年有关VacA的研究进展.

幽门螺杆菌vacA基因及其细胞空泡毒素的研究进展

幽门螺杆菌（H.pylori,HP）是引起人类上消化道疾病的主要致病菌。近20多年来,随着分子流行病学、分子免疫学、分子生物学等相关学科的建立及相关技术的出现,人们对H.pylori毒力的研究也越来越深入,现已发现H.pylori有许多致病因子,如细胞空泡毒素（vacuolating cytotoxin A,VacA）、细胞毒素相关蛋白（CagA）、热休克蛋白、尿素酶等。

幽门螺杆菌细胞毒素相关蛋白、空泡毒素基因与儿童胃十二指肠疾病的关系

目的 探讨幽门螺杆菌 (Hp)细胞毒素相关蛋白 (cagA)、空泡毒素 (vacA)与儿童胃十二指肠疾病类型及胃黏膜炎症程度的关系。方法 采用免疫印迹法测定 88例Hp相关性慢性胃炎 (CG)、4 6例Hp相关性消化性溃疡 (PU)患儿血清cagA、vacA抗体 ,并观察胃黏膜病理变化。 结果 1.CagA、vacA抗体总检出率分别为 85 .0 7%、91.0 4 % ,cagA抗体在CG与PU中检出率分别为 84 .0 9%与 86 .96 % ,两组相比无显著性差异 (P>0 .0 5 ) ;vacA抗体在CG与PU中检出率分别为 89.77%与 93.4 8% ,两组相比无显著性差异 (P >0 .0 5 )。 2 .134例Hp感染患儿cagA、vacA抗体均阳性 (Ⅰ型菌 ) 113例 ,cagA、vacA抗体均阴性 (Ⅱ型菌 ) 11例 ,cagA、vacA抗体仅一项阳性 (中间型 ) 10例 ,各型菌株在CG、PU中的检出率无明显差异 (P均 >0 .0 5 )。 3.113例Hp Ⅰ型菌株感染引起胃黏膜中重度炎症占 88.5 0 % ,而Ⅱ型菌株、中间型菌株感染引起胃黏膜中重度炎症分别为 4 5 .4 5 %及 5 0 .0 0 % ,两组有显著性差异 (P <0 .0 1)。结论 CagA、vacA与CG、PU发病均有关 ,不能作为区分Hp感染致不同胃十二指肠疾病的特异性指标。本地区儿童感染的Hp主要为cagA和vacA阳性的Ⅰ型菌株 。

幽门螺杆菌细胞空泡毒素s1m2型研究进展

幽门螺杆菌（Hp）感染呈全球性分布,在发达国家人群中感染率为30%~40%,在发展中国家可高达60%-70%。Hp感染者发生非萎缩性胃炎较为普遍,仅有少数感染者会出现严重的临床结局,如消化性溃疡、萎缩性胃炎和胃癌等,这种状况与环境因素、宿主特性及Hp毒力因子密切相关。Hp不同分离株间存在巨大的遗传变异,这些遗传学的差别影响着Hp毒力因子的功能和抗原性,

幽门螺杆菌VacA真核表达载体的构建及其诱导细胞空泡化和凋亡

目的 :研究幽门螺杆菌空泡毒素作为单一毒力决定簇对真核细胞的作用。方法 :用 PCR扩增vac A基因片段 ,克隆入真核表达载体 p EGFP- N 1,构建重组质粒 p EGFP- vac A,转染 He L a细胞 ,通过相差显微镜和电子显微镜观察细胞形态与结构的变化。结果 :重组质粒转染 He L a细胞 2 4 h,10 %～ 2 0 %细胞的胞质内出现明显空泡 ,其中少数细胞发生凋亡改变。结论 :成功构建了用于真核表达的重组 vac A质粒 ,转染真核细胞后 ,观察 Vac A作用导致的细胞形态结构的变化 ,为研究 Vac

幽门螺杆菌空泡细胞毒素与细胞毒素相关蛋白

研究证明幽门螺杆菌(Hp)是人类慢性B型胃炎的主要致病因素,与消化性溃疡密切相关,近年的研究提示Hp与胃癌的发生也有密切关系。关于Hp的致病机理还不是很清楚,现有的资料表明Hp分泌的毒素与其致病性有较密切的关系。本文就这一方面的研究作一简要综述。 1988年。

幽门螺杆菌VacA N端真核表达载体的构建、鉴定及其诱导巨噬细胞空泡化和凋亡的观察

目的构建幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,HP)空泡毒素(Vacuolating cytotoxin,VacA)基因的真核表达载体pDsRed-Monomer-C1/vacA,并在THP-1巨噬细胞中表达,为研究VacA单一毒力决定簇的致病性奠定实验基础。方法用Primer 5.0软件设计引物,以HP基因组为模板,PCR扩增vacA目的基因片段,克隆入真核表达载体pDsRed-Monomer-C1中,经酶切、PCR鉴定及测序鉴定后,转染THP-1巨噬细胞中,荧光显微镜和Western-blot检测VacA蛋白在细胞中的表达;电镜观察巨噬细胞(MΦ)的空泡样变和凋亡;流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果PCR扩增得到了大小约为1 428bp的目的片段,双酶切及测序鉴定证明成功构建了HP真核表达重组载体;转染后24h,重组质粒组部分细胞中有聚集的荧光颗粒,部分细胞发生空泡样变和凋亡改变;细胞凋亡率明显高于空质粒组和阴性对照组(P<0.001),细胞核因子-κB(nuclear factorkappaB,NF-κB)的抑制剂二硫代氨基甲酸吡咯烷(pyrrolidine dithiocarbamate,PDTC)抑制细胞的凋亡。结论VacA蛋白瞬时高表达促进THP-1巨噬细胞空泡样变和凋亡。NF-κB可能参与调节VacA诱导的巨噬细胞凋亡。

奥美拉唑对胃癌上皮细胞株、幽门螺杆菌及空泡毒素作用的体外试验

目的 :通过奥美拉唑对胃癌上皮细胞、幽门螺杆菌 (Hp)菌株生长及空泡毒素 (VacA)毒性的影响 ,探讨其临床应用价值。方法 :应用不同浓度奥美拉唑和细胞、细菌及VacA共孵育方法观察细胞、细菌的生长状况及空泡毒性的变化。结果 :(1)当奥美拉唑浓度 >10 0mg·L- 1时 ,细胞 10 0 %死亡 ;低于4 0mg·L- 1时 ,光镜下未见上皮细胞的形态学改变。(2 )当奥美拉唑≥ 10 0mg·L- 1时 ,细菌生长完全被抑制 ;低于 30mg·L- 1,细菌的生长不受影响。 (3)低浓度奥美拉唑 (10～ 4 0mg·L- 1)能部分抑制Va cA毒素对SGC 790 1的空泡作用 ,但不抑制毒素对HeLa细胞的空泡毒性作用。结论 :抑制Hp生长所需的奥美拉唑浓度对胃上皮细胞也有损伤作用 ,对空泡毒素无显著的抑制作用 ,临床上只能应用低剂量奥美拉唑 ,通过抑制胃酸分泌治疗酸相关疾病 。

幽门螺杆菌空泡毒素对人牙周膜成纤维细胞的增殖和凋亡的影响

目的:观察幽门螺杆菌空泡毒素(HP Vac A)对人牙周膜成纤维细胞(h PDLFs)增殖和凋亡的影响。方法:人牙周膜成纤维细胞株(h PDLFs100),分别与不同浓度的HP Vac A(0.1、0.2、0.3 mg/m L)共培养,CCK-8方法检测细胞的增殖情况;倒置显微镜观察细胞的形态变化;流式细胞仪检测细胞的凋亡情况;透射电镜观察细胞超微结构的改变。结果:随着HP Vac A浓度的增大和培养时间的延长,h PDLFs的增殖明显受到抑制;贴壁的PDLFs数量递减,细胞由长梭形逐渐变为圆形,折光性不断减弱,悬浮细胞和凋亡细胞增多;胞浆内大量空泡形成,细胞染色体聚集于核膜,呈块状、浓集和边缘化,表现出典型的凋亡特征。结论:HP Vac A对PDLFs有明显的细胞毒作用,能抑制细胞增殖,并引起细胞凋亡。

幽门螺杆菌细胞毒素相关基因A、空泡毒素基因A抗体与胃十二指肠疾病的关系

目的研究不同幽门螺杆菌(Hp)菌株感染与胃十二指肠疾病发生的关系。方法采用蛋白芯片技术测定血清中Hp细胞毒素相关基因A(CagA)、空泡毒素基因A(VacA)抗体。结果消化性溃疡组和胃癌组CagA和VacA抗体阳性者显著高于慢性胃炎组(P<0.01),而CagA和VacA抗体阴性在慢性胃炎组显著高于溃疡组和胃癌组(P<0.01),溃疡组和胃癌组之间CagA和VacA抗体阳性和阴性率比较,差异无显著性(P>0.05)。结论含CagA基因和VacA基因的I型Hp可能是致病力强的高毒力株。

幽门螺杆菌Vac A基因m1 b变异体的序列特点及其空泡毒素表达活性

目的 调查分析来自浙江人群的Hp临床菌株VacA基因m1b变异体的序列特点及其空泡毒素表达活性。方法 取Hp临床菌株及标准菌标培养于改良的布氏肉汤 ,在倒置显微镜下观察空泡变性的细胞数。结果 VacA基因存在于所有Hp菌株中 ,但只有部分菌株有空泡毒活性 ,其表达差异与VacA基因型的不同有关 ,本研究中m2和m1b型Hp菌株占优势 ,而m1型少见。结论 m1b型比m2型菌株更适于在人群定植。

幽门螺杆菌形成空泡细胞毒素的提纯与特征分析

运用水油提、盐析及凝胶过滤色谱法对幽门螺杆菌ＹＣ－１１株所分泌的形成空泡细胞毒素进行了提取。纯化的形成空泡细胞毒素在ＳＤＳ－聚丙烯酰胺凝胶电泳中表现为单一条带，分子量约为８７０００，在ＰＨ２．４～６．４的环境中表现高细胞毒性。

幽门螺杆菌空泡形成细胞毒素A亚单位的克隆表达和P37抗体的制备

背景:空泡形成细胞毒素A(VacA)是幽门螺杆菌(H.pylori)的重要致病因子,研究VacA的致病机制有助于进一步明确H.pylori的致病机制。目的:原核表达H.pyloriVacA亚单位P37和P58,制备P37多克隆抗体并分析其活性。方法:以聚合酶链反应(PCR)扩增H.pylorivacA基因的p37和p58片段,克隆入原核表达载体pQE31,构建重组质粒pQE31-p37和pQE31-p58,转化大肠杆菌(E.coli)M15,诱导蛋白表达。以镍-次氮基三乙酸(Ni-NTA)亲和层析纯化融合蛋白,以纯化P37蛋白免疫家兔,获取抗P37血清,以酶联免疫吸附测定(ELISA)检测抗体效价。以蛋白质印迹法(Westernblot)分析P37抗体与VacA的结合能力,观察P37抗体对VacA致胃癌细胞空泡化的抑制作用。结果:十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)显示,E.coliM15经诱导后表达相对分子质量分别为37kDa(1Da=0.9921u)和58kDa的P37和P58融合蛋白,经纯化后为单一蛋白。纯化P37蛋白免疫家兔后获得的抗P37血清抗体效价为1×106。P37抗体能中和VacA阳性H.pylori分泌的VacA,抑制VacA对胃癌细胞的空泡化作用。结论:本实验成功构建了原核表达载体pQE31-p37和pQE31-p58,获得了高纯度单一蛋白和高效价P37抗体,该抗体具有中和VacA毒性的作用。

具有细胞毒素相关蛋白和细胞空泡毒素的幽门螺杆菌与消化性溃疡的相关性研究

目的探讨能产生细胞毒素相关蛋白（ＣａｇＡ）与细胞空泡毒素（ＶａｃＡ）的幽门螺杆菌（ＨＰ）与消化性溃疡的关系。方法用免疫印迹法检测分析经尿素酶及组织学Ｇｉｅｍｓａ染色证实ＨＰ阳性的血清标本共１１２份，其中慢性胃炎６５份，消化性溃疡４７份。观察两种疾病中ＣａｇＡ与ＶａｃＡ阳性的ＨＰ检测结果。结果慢性胃炎组、消化性溃疡组的ＣａｇＡ与ＶａｃＡ阳性的ＨＰ感染率分别为３３．８５％和５９．５７％，差异有显著性（Ｐ＜０．０１）。

幽门螺旋杆菌空泡/细胞毒素的研究现状

幽门螺旋杆菌感染呈全球性分布，多数地区感染率约为５０％，但并非所有人发生慢性胃炎和消化性溃疡，这与该菌产生细胞毒素的能力有关。本文综述了幽门螺旋杆菌产生的空泡／细胞毒素（ＶａｃＡ）和细胞毒素相关蛋白（ＣａｇＡ）的性质及与临床的关系、ＣａｇＡ阳性菌株在中国人中的流行情况。根据ＶａｃＡ和ＣａｇＡ基因，及它们表达活性产物与否，可将该菌分为两大类型：Ⅰ型具有编码ＣａｇＡ的基因，表达ＣａｇＡ蛋白和空泡毒素，Ⅱ型没有编码ＣａｇＡ的基因，不表达ＣａｇＡ蛋白和空泡毒素，其中Ⅰ型菌株毒力和致病力强。

幽门螺杆菌空泡毒素VacA致病机制研究

VacA是幽门螺杆菌分泌的一种蛋白毒素,它是幽门螺杆菌的一个重要毒力因子。可作为单一致病因子使胃上皮细胞发生多种明显的细胞病变效应。如VacA进入细胞后可启动细胞内发生广泛的rab7依赖的融合及晚期包裹小泡腔隙的渗透性肿胀,最终导致细胞空泡化;VacA能引起线粒体去极化,从而引起胃上皮细胞凋亡;VacA亦可影响或干扰细胞骨架各成分,引起肌动蛋白重排,致使微管结构发生紊乱。但VacA引起细胞病变和结构异常的确切机制尚未完全阐明。