噬菌体展示技术筛选羊小肠上皮细胞穿透肽

为解决抗菌药物不能穿透细胞膜杀伤胞内致病菌的问题,本试验以羊小肠(空肠段)上皮细胞为靶细胞,利用噬菌体展示技术4轮体外生物淘洗,系统地筛选羊小肠上皮细胞的特异性穿透肽,将其作为抗菌肽的载体从而提高抗菌肽的穿透能力。试验采用噬菌体展示技术,经过4轮体外生物淘洗,得到了能与羊小肠上皮细胞结合的多肽;4轮减数筛选后,噬菌体的回收率逐渐提高,特异性的噬菌体克隆得到了有效富集,酶联免疫吸附法(ELISA)测定单克隆噬菌体对羊小肠上皮细胞的亲和力,亲和力≥2的为阳性,筛选阳性噬菌体克隆,提取DNA进行测序,选择高重复率序列,合成细胞穿透肽,同时合成与细胞穿透肽的氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽,并与异硫氰酸荧光素(FITC)标签连接。用细胞增殖/毒性检测试剂盒(CCK8)测定细胞穿透肽和对照肽对细胞活力的影响,用荧光显微镜初步观察穿透肽的穿透性,用激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及穿透强度。结果表明:经4轮体外减数筛选噬菌体的回收率增长了226倍,随着第1轮至第4轮筛选轮次增加,与羊小肠上皮细胞结合的噬菌体依次增加;使用ELISA进行检测,结果显示,在随机挑选的30个单克隆噬菌体中,22个检测为阳性克隆(亲合力≥2);提取阳性克隆噬菌体进行DNA测序分析后,得到2条重复率高的氨基酸序列,VLNSLID命名为SCPP1,HSTTAQF命名为SCPP2;细胞活力结果表明,在浓度低于256μmol/mL时2条细胞穿透肽及其对照多肽的细胞活力仍在90%以上,表明对细胞无毒;荧光显微镜下观察及激光共聚焦结果表明,SCPP1和SCPP2可以特异性穿透羊小肠上皮细胞膜,且SCPP1可以穿透细胞核表现出比SCPP2更强的穿透性,2条对照多肽无穿透能力;流式细胞仪结果显示,SCPP1的胞内平均荧光强度明显高于SCPP2,且呈时间剂量依赖。本试验筛选出了安全可特异性穿透羊小肠上皮细胞的穿透肽(SCPP1),可作为治疗羊肠道胞内菌的抗菌肽的载体。

噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞穿透肽

为辅助抗菌药物进入动物细胞杀伤胞内致病菌,本试验利用噬菌体展示技术筛选猪小肠上皮细胞的穿透肽。通过噬菌体展示技术进行4轮体外生物淘洗,得到与猪小肠上皮细胞结合的多肽;经过4轮减数筛选,噬菌体回收率逐渐提高,酶联免疫吸附法(ELISA)测定单克隆噬菌体对猪小肠上皮细胞的亲和力,亲和力≥2的为阳性,将阳性噬菌体克隆提取DNA,将高重复率序列合成细胞穿透肽,同时合成与其氨基酸序列及结构相同但组合顺序不同的对照多肽,荧光FITC标签连接。检测多肽的抑菌活性、溶血活性和细胞毒性,荧光显微镜观察穿透肽的穿透性、激光共聚焦显微镜及流式细胞仪检测穿透肽在胞内的定位及强度。结果表明:4轮筛选噬菌体的回收率增长283倍;ELISA检测显示,随机挑选30个单克隆噬菌体,17个为阳性克隆;DNA测序得到2条高重复序列,SAYKMMA命名ICPP1和SSSISGL命名ICPP2;穿透肽及对照多肽无抑菌活性,溶血性较好,安全无毒对细胞活力无影响;荧光显微镜观察及激光共聚焦结果表明,ICPP1和ICPP2可穿透猪小肠上皮细胞膜,且ICPP1表现出更强的穿透性;流式细胞仪结果显示,ICPP1的胞内平均荧光强度明显高于ICPP2,且呈时间剂量依赖,有较好的热稳定性和较低的血清稳定性。本试验筛选出了安全可穿透猪小肠上皮细胞的穿透肽(ICPP1),可作为治疗猪肠道胞内菌的抗菌肽的载体。

细胞穿透肽应用的研究进展

细胞穿透肽是一类具有特殊细胞膜穿透作用的短肽,研究发现其为药物大分子物质的细胞内转运提供了有力工具,现已得到了广泛关注和大量研究.一方面,近年来发现,细胞穿透肽的应用面临着药物释放率、代谢降解、细胞系的分化状态和Rho-GTPases活性的依赖性等问题,从而阻碍了其研究开发的进程.另一方面,细胞穿透肽在肿瘤治疗、抗菌和抗炎靶向药物等方面的研究却取得了显著的进展,甚至进入了临床前和临床研究阶段.本文围绕细胞穿透肽在应用开发中所面临的挑战和机遇两方面,综述了近期的研究进展,并对细胞穿透肽在新领域中的应用进行了展望.

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人结直肠癌SW480细胞

背景与目的:细胞穿透肽是近年来发现的一类能介导大分子物质跨膜转导的小分子肽段,本实验研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人结直肠癌细胞SW480的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白与体外培养的人结直肠癌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入SW480细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和SW480细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人结直肠癌细胞。

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白在小鼠体内跨膜转导

目的研究细胞穿透肽PEP-1介导的大分子物质在小鼠体内的跨膜转导能力。方法用基因工程的方法制备并纯化增强型绿色荧光蛋白EGFP和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将500μg的EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白通过尾静脉注射入昆明小鼠体内,2 h后麻醉小鼠,PBS充分灌流并取心、脑、肝、脾、肾快速冷冻切片后立即置荧光显微镜下观察。结果2 h后PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠大脑、心肌、肝、脾和肾组织里出现均一的明亮绿色荧光,而EGFP蛋白处理的小鼠各脏器内均未见到绿色荧光。结论细胞穿透肽PEP-1能携带增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠细胞膜并分布于心、脑、肝、脾、肾组织内,为将来用PEP-1介导各种大分子药物跨膜转导进行各种疾病的蛋白治疗提供实验依据。

人宫颈癌Hela细胞穿透肽的噬菌体展示技术筛选

目的细胞穿透肽是近年来发现的具有穿透哺乳动物生物膜功能,并能介导大分子物质跨膜转导的一类小分子肽段。该肽段以其转导效率高,速度快,生物活性好,对细胞损害小等特点,成为药物导向治疗方法研究领域的热点。本研究目的在于利用噬菌体展示技术高通量、系统地筛选人宫颈癌Hela细胞的穿透多肽。方法以Hela细胞作为对象,利用噬菌体随机肽库,采用细胞筛选的方法,筛选具有细胞膜穿透作用的多肽。将筛选得到的穿透多肽与增强型绿色荧光(EGFP)融合表达,通过荧光显微观察技术快速对多肽的穿透功能进行验证。结果通过4轮的噬菌体文库筛选,目的多肽得到了有效而快速地富集。初步的测序和验证得到了3条具有明显介导融合蛋白内化的短肽序列。结论成功建立起基于噬菌体随机肽库的细胞穿透肽筛选技术,为肿瘤导向药物载体的研究开发奠定了基础。

细胞穿透肽介导外源物质入胞转运研究进度

细胞穿透肽(cell-penetrating peptides,CPP)是一类能够携带外源物质进入细胞的多肽,因其结构和功能的独特性和实用性,近20年里在生物医学领域得到了长足的发展。目前CPP向体内和体外输送物质的方法逐渐成熟。在基础研究领域,已成为研究细胞内分子相互作用的有用工具;在应用方面,CPP药物已进入临床前、临床Ⅰ和Ⅱ期试验,在肿瘤、中枢神经系统疾病和心血管疾病的治疗中显示出明显优势。本文对CPP的发展历程、分类、入胞机制和应用等做一综述。

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导人脐静脉内皮细胞

目的研究PEP-1-EGFP融合蛋白穿透人脐静脉内皮细胞的能力。方法用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和体外培养的人脐静脉内皮细胞共同孵育,分别观察其进入细胞的能力及PEP-1-EGFP进入细胞的时间依赖性、剂量依赖性和稳定性,并用MTT法检测PEP-1-EGFP融合蛋白对细胞的毒性。结果EGFP蛋白不能进入细胞内。PEP-1-EGFP融合蛋白可在5min内穿透人脐静脉内皮细胞,其穿透人脐静脉内皮细胞的能力呈时间和剂量依赖性,进入细胞后27h仍可观察到微量绿色荧光。PEP-1-EGFP蛋白浓度达200μmol/L时对细胞仍无毒性。结论PEP-1能有效携带目的蛋白进入人脐静脉内皮细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的抗氧化物质穿透内皮细胞治疗缺血再灌注损伤奠定了基础。

细胞穿透肽穿膜机制的研究进展

细胞穿透肽是一类少于30个氨基酸的短肽,它们能穿过细胞膜并携带各种"货物"包括小分子、蛋白、肽、核酸等进入细胞,而发挥"货物"的生物学作用。其转导机制一直是研究的热点,至今仍不明确。本文讨论直接入胞、转导、内吞3种可能的穿膜机制及其特点。

细胞穿透肽核靶向运输蛋白表达载体的构建及其蛋白转导功能的研究

目的构建基于细胞穿透肽靶向细胞核运输的蛋白表达载体,并研究其蛋白转导功能。方法在带His标记的增强型绿色荧光蛋白(EGFP)表达载体pET14b-HE(pET14b-His-EGFP)基础上,利用点突变的方法构建依次含细胞穿透肽(CPP)、连接子、核定位信号(NLS)序列和EGFP的融合蛋白表达载体pET14b-HC(L)NE(pET14b-His-CPP-Linker-NLS-EGFP);经酶切、测序鉴定载体构建正确后,将重组质粒转化BL21(DE3)宿主菌,经异丙基硫代-β-D-半乳糖苷诱导表达后、用Ni2+亲和层析纯化得到融合蛋白;将融合蛋白透析、过滤除菌后加入培养的真核细胞中,荧光显微镜下观察并进行Westernblot检测分析其在活细胞的蛋白转导功能。结果酶切、测序证实载体构建成功,融合蛋白在大肠杆菌中可有效表达;蛋白转导实验可见融合蛋白可快速穿透细胞膜并进入细胞核,并且这种内化转导功能存在时间和剂量依赖效应。结论成功构建了基于细胞穿透肽的蛋白表达运输载体,建立了可携带外源蛋白进入细胞浆及细胞核的运输系统,为研究蛋白或多肽的细胞内功能以及运输药物提供了一种经济有效的工具。

细胞穿透肽及其结构改造在siRNA传递中的应用

小RNA药物应用于临床的主要技术瓶颈在于如何高效、低毒地将小RNA分子传递到它发挥功能的场所.基于细胞穿透肽在小RNA透皮给药的临床应用中所取得的进展,本文系统评述了近年来细胞穿透肽在小RNA的体内、体外传递方面的研究动态,分析了细胞穿透肽的结构改造对肽/小RNA复合物转染进入细胞发挥功能的影响,展望了细胞穿透肽作为小RNA的体内药物传递载体的发展方向.

细胞穿透肽经皮促渗应用进展

经皮给药是一种非侵入性的给药方式,具有其他给药途径所无法比拟的优点.但由于皮肤角质层的屏障作用以及上皮细胞间的紧密连接屏障,很多药物需要通过各种促渗手段才能通过经皮给药途径吸收.细胞穿透肽作为一种高效低毒的短肽,已被证明能够促进小分子、多肽、蛋白质、脂质体、核酸等的渗透作用,其促渗机制尚不明确,但在经皮给药领域应用广泛.该文综述细胞穿透肽在经皮给药系统中的应用.

细胞穿透肽在肿瘤治疗中的应用

随着人类对基因组信息解读的不断深入,越来越多的生物大分子作为候选药物进入生物治疗领域。但细胞表面的脂质双层膜具有选择通透性,这种天然屏障作用在保护细胞的同时也限制了绝大多数生物大分子进入细胞内部发挥治疗效应。目前流行的入胞转运方式如电穿孔、脂质体转染等均存在对细胞的额外毒副作用,且作用范围局限于体外实验。细胞穿透肽是一类以非受体依赖方式,非经典内吞方式直接穿过细胞膜进入细胞的多肽。它们可以与多种生物活性物质连接并携带其进入细胞,这一特性为它们成为理想的药物载体提供了可能。本文对使用细胞穿透肽作为载体转运具有抗癌作用的生物大分子进入细胞的抗癌实验予以介绍。

细胞穿透肽PEP-1在蛋白转导中的应用

文章对细胞穿透肽PEP-1在大分子物质体内外跨膜转导中的应用进行了综述,为进一步研究PEP-1介导有潜在治疗价值的大分子物质跨膜转导进行疾病的蛋白治疗提供了依据。

细胞穿透肽Tat-LK15介导siRNA的转染效率和细胞毒性研究

通过与Lipofectamine TM RNAi MAX(Lipo)比较,探讨细胞穿透肽Tat-LK15对人肾上皮细胞(human embryonic kidney 293T cells,293T)和大鼠视神经节细胞(retinal ganglion cell line,RGC-5)转染小干扰RNA(small interference RNA,si RNA)的效率和细胞毒性,为后期实验提供依据。以羧基荧光素(carboxyfluorescein,FAM)标记的si RNA为报告基因,不同剂量的Tat-LK15(Tat-LK15组)和Lipo(Lipo组)为转染试剂,分别转染293T和RGC-5细胞。转染24 h后荧光显微镜观察FAM荧光强度,计算转染效率,并以CCK-8法检测细胞毒性。随着Tat-LK15和Lipo剂量的增加,si RNA转染效率逐渐提高。当Tat-LK15与si RNA配比为2∶1(μg/μg)时,RGC-5细胞的转染效率达到最高((87.3±4.5)%),低于Lipo与si RNA配比为5∶1(μL/μg)时的最高转染效率((96.2±3.2)%(P<0.05));作用于293T细胞时,两转染试剂的最高转染效率没有统计学差异(P>0.05)。转染试剂剂量增加,Lipo细胞毒性显著增加,而Tat-LK15毒性无明显变化。转染效率最高时,Lipo(5μL)组293T和RGC-5的细胞存活率仅为((77.8±4.1)%,(73.4±7.7)%)显著低于Tat-LK15(2∶1)组同种细胞的存活率((91.0±3.7)%,(90.0±6.1)%)(P<0.05)。Tat-LK15可有效地转染si RNA,细胞毒性低,安全性突出,有一定的应用前景。

提高细胞膜穿透肽应用效应的几种策略

细胞膜穿透肽(cell-penetrating peptide,CPP)的发现,为向细胞内输送各种大分子生物活性物质提供了一个有力的运送载体,相比于以前的各种运送载体,它具有操作简便、相对安全和毒副作用小等优点,但同时也存在着诸如从内含体释放效率低、细胞内定位不够精确以及缺乏组织细胞靶向性等缺陷,这也是目前国内外对于CPP的研究热点。

细胞穿透肽在肿瘤治疗中的研究进展

生物技术的发展使人们意识到生物大分子物质在疾病治疗中的重要作用,如DNA,RNA,肽,蛋白质等。但是,这些生物大分子的治疗效果在很大程度上取决于它们穿过细胞膜的效率。因此,人们迫切需要找到一种可以跨越细胞膜,直接将治疗性生物大分子物质运输到细胞内相应位置的手段。在过去几十年,人们发现一种小于30个氨基酸的短肽,能够将与之相连的生物分子在体内或体外的环境下带入细胞,称为细胞穿透肽(cell penetrating peptides,CPPs)。本文主要讨论CPPs跨膜转运体系的分类和机制,以及它在肿瘤治疗中的作用。

细胞穿透肽PEP-1介导血红素加氧酶1预处理对大鼠肝脏缺血再灌注损伤的保护作用

目的:探讨细胞穿透肽PEP-1介导的血红素加氧酶-1(HO-1)对大鼠肝脏缺血再灌注损伤(HIRI)的保护作用。方法:(1)用基因工程学方法人工合成融合蛋白PEP-1-HO-1。(2)选择雄性SD大鼠,随机分为三组(n均=8):假手术组(S组)只开腹,不予干预。HIRI模型组(HIRI组),采用夹闭肝动脉和门静脉30min后恢复血流;HIRI+PEP-1-HO-1预处理组(HIRI+HO-1组),夹闭肝动脉和门静脉前经门静脉注射PEP-1-HO-1蛋白1mg,其余处理同HIRI组。(3)实验完成后,取三组大鼠下腔静脉血,采用自动生化分析仪测定血清谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、γ-谷氨酰转肽酶(γ-GT)、总胆红素(TBIL)等肝功能指标。处死大鼠,取部分肝脏进行组织切片、HE染色,观察各组肝组织病理学变化。结果:成功制备高纯度PEP-1-HO-1融合蛋白。HIRI组大鼠各项肝功能指标均显著高于S组(P<0.01),HIRI+HO-1组各项肝功能指标值明显低于HIRI组(P<0.01),但仍高于S组(P<0.05)。HIRI组肝细胞肿大或呈球形,胞浆疏松水样变或完全透明,伴炎细胞浸润,可见片状坏死。HIRI+HO-1组肝脏损伤程度较HIRI组明显改善,炎性细胞浸润及肝细胞坏死程度明显减轻,但与S组比较,肝脏组织损伤仍明显。结论:用细胞穿透肽PEP-1介导HO-1预处理能有效保护肝细胞,明显减轻肝功能损害。

细胞穿透肽PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白穿透在体小鼠皮肤

目的:研究细胞穿透肽PEP-1介导的增强型绿色荧光蛋白穿透小鼠皮肤的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,分别将1mg的蛋白涂抹在昆明小鼠背部皮肤上,4 h后处死小鼠取背部皮肤冰冻切片后立即在倒置荧光显微镜下观察。结果:EGFP处理的小鼠皮肤仅在角质层表面有少量荧光,PEP-1-EGFP融合蛋白处理的小鼠皮肤可见绿色荧光穿透角质层并分布于表皮和真皮内。结论:PEP-1-EGFP融合蛋白能穿透小鼠皮肤角质层并分布于表皮和真皮内,这为将来用细胞穿透肽PEP-1经皮转导大分子药物治疗各种皮肤病以及全身系统性疾病奠定了基础。