人干扰素α1c/86DAB环突变文库的构建及细胞筛选

人干扰素α１ｃ／８６ＤＡＢ环突变文库的构建及细胞筛选马学军胡荣１吕海２魏开坤张丽兰薛水星侯云德（中国预防医学科学院病毒学研究所，病毒基因工程国家重点实验室北京１０００５２）噬菌体表面呈现（ｐｈａｇｅｄｉｓｐｌａｙ）技术是由Ｓｍｉｔｈ〔１〕博士于１９...

利用噬菌体随机肽库对神经胶质瘤母系SWO-38进行全细胞筛选

目的和方法 :用噬菌体随机 7肽库对神经胶质瘤母细胞 (SWO - 38)进行全细胞筛选 ,并通过竞争结合实验检验所筛选出的克隆的结合特异性。结果 :经过 3轮“吸附 -洗脱 -扩增” ,噬菌体高度富集 ,并得到两个特异性较强的克隆。结论 :利用噬菌体肽库可以简便。

全自动细胞分选仪对单细胞筛选的优化与应用

以Ec-109、BHK细胞为例,采用AVISO细胞分选仪进行单细胞的分选与优化。首先,将电脑中的细胞筛选软件与显微镜相连接,依据不同的细胞类型,设置合适的挑选参数,并从X、Y与Z轴层面精确校准挑选位置。通过自由设定细胞特征参数,可准确地挑选到目标细胞。最后,检测分析细胞筛选率,均可达到90%以上。该筛选技术对单细胞的挑选可提高到可视化水平,与常规筛选方法相比,样品不需特殊处理,细胞收集方便,节约操作时间,提高了实验效率。

真核细胞筛选系统快速检测环境水样的DNA损伤效应

目的利用含生长抑制和DNA损伤诱导基因153(gadd153)启动子和荧光素酶报道基因真核细胞株GADD153-Luc,建立快速检测环境水样中有机提取物的DNA损伤作用的新方法。方法RT-PCR方法检测内源性gadd153基因mRNA表达;生物发光和彗星试验分别检测环境水样对稳定转染细胞和HepG2细胞的DNA损伤效应。结果RT-PCR结果表明,在100ml/ml培养基剂量组,源水和氯化消毒饮用水中有机提取物可诱导gadd153基因mRNA表达显著增加(P<0.05),并与荧光素酶活性呈正相关;荧光素酶表达在源水和氯化消毒饮用水有机提取物各剂量组均显著高于对照组(P<0.01),并有良好的剂量反应关系;彗星试验显示,在10、100ml/ml培养基剂量组源水和氯化消毒饮用水有机提取物处理后,OTM(Olive尾距)显著高于对照组(P<0.01);相关分析表明,各剂量组诱导荧光素酶活性和DNA损伤程度(OTM)呈正相关(P<0.01)。结论真核细胞gadd153-Luc检测体系可用于快速检测环境水样的DNA损伤效应,并具有较高的灵敏性。

烟草抗黑胫病突变体的细胞筛选

经实验我们成功地建立了在细胞水平上筛选烟草抗黑胫病突变体的筛选体系。该体系的主要内容为:γ-射线500—2000拉德诱变高度感病品种的花药后用50—80％的黑胫病菌粗毒素为选择压力,筛选出抗毒素花粉植株,用离体叶片法测定选出抗病植株,再从后代鉴定中选出抗病性能够稳定遗传的突变系。γ-射线及高浓度毒素处理均能得到抗病植株。选自感病品种的花粉植株中约有9—50％是真正抗病的。这些抗病植株中有一部分的抗病性能够稳定遗传。用该法已从感病优质品种小黄金1025及乔庄黑苗中选出6个突变系。并自N.C.628(抗)×小黄金1025(感)及N.C.628(抗)×庆胜2号(感)的F_1花粉植株中选出4个抗病系。所有的抗病系经3—4代后均表现出稳定抗性。其中一个突变体(R400)的抗性似由不完全显性多基因控制。

鸡黑素皮质素受体-4反向激动剂细胞筛选模型的建立

本试验旨在建立体外鸡黑素皮质素受体-4(cMC4R)反向激动剂的细胞筛选模型,为从中草药中筛选出能与cMC4R作用且存在活性的中药成分提供一些基础性的研究。将成功构建的cMC4R真核表达质粒cMC4RpcDNA3.1(+)-myc与报告基因质粒pGL4.29[luc2p/CRE/Hygro]按1∶5的比例共转染到CHO-K1细胞,两周后经有限稀释法获得单克隆;将获得的单克隆分别用CRE激活剂Forskolin和MC4R激动剂NDP-MSH作用6h,挑选萤火虫荧光素酶的相对表达量最高的单克隆作为阳性细胞株;提取阳性细胞总RNA,RT-PCR检测阳性细胞内cMC4R基因、荧光素酶报告基因的转录水平;对MC4R激动剂NDP-MSH的终浓度、NDP-MSH孵育时间及溶剂DMSO的终浓度进行优化,应用Z’因子对筛选方法进行评估。结果显示,获得了5个单克隆(A2、F7、F8、F9、H10),其中单克隆A2的萤火虫荧光素酶的相对表达量最高,将其作为阳性细胞株;RT-PCR在预期位置扩增出大小分别为996和1 653bp的两条目的条带;激动剂NDP-MSH终浓度为10-9 mol/L、NDP-MSH孵育时间为8h、溶剂DMSO终浓度小于2%时,筛选模型Z’因子为0.82。结果表明,本试验所建立的筛选方法可靠、稳定,细胞筛选模型可用于cMC4R反向激动剂的筛选,为进一步从中药中筛选出有效物质奠定了基础。

细胞筛选平台在人类功能基因组研究中的应用

人类基因组全序列的精细图已完成,当前生命科学面临的重要任务就是如何将基因组序列信息转化为基因的功能信息,了解生命活动的分子机理,改善人类健康,为生物技术发展提供动力.在一系列功能基因组研究新技术中,高通量(high-throughput)和高内涵(high-content)的细胞筛选技术平台已经显示出巨大潜力,发挥着越来越重要的作用.通过在体外培养的哺乳动物细胞中基因过表达或抑制基因表达,分析所产生信号传导通路和/或细胞表型改变,可以直接发现基因功能.近年来一些技术上的进展,使细胞筛选平台具有微量、自动、高效、高通量,以及可以系统研究的特点,已经成为功能基因组研究的核心方法之一.近2￣3年来已经出现一批成功应用细胞筛选平台进行大规模功能基因组研究的报道.我国在这一领域的研究也开始起步,将对我国生物技术的源头创新研究产生深远的影响.

我国建成世界最大激酶靶点细胞筛选库

中国科学院强磁场科学中心日前建成目前世界上规模最大的基于癌症激酶靶点的高通量细胞筛选库。该细胞库囊括了近70种癌症激酶靶点，细胞种类达150余种，几乎覆盖了目前已知的与肿瘤发生发展相关的全部激酶及激酶突变细胞。该细胞库的建成，填补了国内新药创制领域此类检测体系的空白，将为抗肿瘤新药研发提供有力支撑。

世界最大激酶靶点细胞筛选库于中科院建成

从中国科学院获悉，中国科学院强磁场科学中心日前建成目前世界库。该细胞库囊括了近70种癌症激酶靶点，细胞种类达150余种，几乎覆盖了目前及激酶突变细胞。该细胞库的建成，填补了国内新药创制领域此类检测体系的空白，将为抗肿瘤新药研发提供有力支撑。

用有重组神经蛋白的细胞筛选治疗CNS疾病的药物

目前许多公司皆发展用于中枢神经系统(CNS)疾病的产品。而美国Nourogenetic公司却与众不同,它不是以重组DNA技术生产治疗CNS疾病的蛋白类药物,而是使用重组细胞筛选和研制小分子合成化合物用于治疗焦虑、忧郁、头疼、饮食障碍和神经中毒性疾病。

小鼠骨髓源性肝干细胞筛选及其分化潜能的研究

目的从骨髓细胞中筛选肝干细胞。方法供体为纯系BALB／C雄性小鼠，从其骨髓细胞中分离CD34^＋Lin^-、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞。受体为35Gy全肝照射预处理的同龄同系BALB／C雌性小鼠，A、B、C、D组分别为CD34^＋Lin、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞移植。术后30d活杀小鼠，取肝作小鼠Y染色体性别决定基因Sry的原位分子杂交和白蛋白的免疫组化染色，镜下观察并记录双阳性细胞数量。结果A、B、C、D组小鼠肝组织中均检测到双阳性细胞，其中C组的双阳性细胞数量显著多于其它各组。结论CD34^＋Lin^-、CD90^＋Lin^-、CD117^＋Lin^-、Sca-1^＋Lin^-细胞都含有骨髓源性肝干细胞、都有分化形成肝细胞的潜能，但CD117^＋Lin^-细胞分化形成肝细胞潜能最大。

抗SARS冠状病毒药物细胞筛选模型的建立及应用

目的 :建立抗SARS冠状病毒 (SARS_CoV)药物细胞筛选模型 ,应用于抗SARS_CoV药物的筛选 ,为SARS的防治奠定基础。方法 :将一定数量的细胞接种 96孔板 ,根据药物的作用机制采用不同的给药途径 ,以观察到的细胞病变 (cytopathiceffect,CPE)为指标 ,按照Reed_Muench法 ,计算药物的细胞半数中毒浓度 (TD50 )和抑制细胞半数病变的有效浓度 (IC50 )。结果与结论 :Vero_E6细胞接种SARS_CoV后 2 4h即可出现CPE ,且CPE明显 ,便于观察 ,可作为抗SARS病毒药物细胞筛选模型。依此模型筛选了 3类 87种药物 ,确认 6种药物在Vero_E6细胞上具有抑制SARS病毒的作用。该模型的建立也为其他的抗病毒药物的筛选提供了技术平台。

筛选后的巢蛋白阳性细胞流式鉴定及诱导分化

目的观察胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞(符合医学伦理学)是否具有与间充质干细胞类似的表面标志以及多向分化的潜能。方法从胎儿胰腺中分离的巢蛋白阳性细胞筛选后进行扩增,用流式细胞仪分析表面标志,并探讨这类细胞的成脂和成骨的分化潜能。结果筛选纯化后的巢蛋白阳性细胞的表面标志与骨髓间充质干细胞表面标志相似;此类细胞可在体外诱导为脂肪细胞或骨细胞。结论筛选纯化的胎儿胰腺来源的巢蛋白阳性细胞具有一定间充质干细胞的特性。

HCV NS3/4A蛋白酶抑制剂细胞筛选模型

丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)持续感染可导致慢性丙型肝炎,并可发展为肝硬化和肝细胞癌。HCV NS3/4A蛋白酶在HCV复制和致病机制中起着非常关键的作用,已成为HCV研究热点。由于候选药物分子必须具有易进入细胞、稳定性好等特征,建立一种细胞水平上酶活性的测定系统对于筛选抗NS3/4A药物无疑有着重要意义。目前已有多种NS3/4A蛋白酶筛选系统开发出来,本文将对此作一综述。

大鼠骨髓间充质干细胞特异性核酸适配子的筛选和鉴定

目的利用指数富集的配体系统进化技术(SELEX)筛选与大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)特异性结合的核酸适配子,并对核酸适配子与大鼠BMSCs的结合方式及能力进行鉴定。方法利用SELEX技术,以分离获取的大鼠BMSCs为靶点,从构建的核酸文库中最大程度富集与BMSCs特异性结合的核酸序列,流式细胞术检测文库富集的特异程度,荧光共聚焦实验观察文库与BMSCs的结合能力。对富集程度最高的文库进行克隆、序列测定及序列分析,获得候选适配子。使用RNA structure软件对候选适配子的二级结构进行预测,流式细胞术测定不同浓度候选适配子与BMSCs结合后的平均荧光强度,使用SigmaPlot软件按公式Y=BmaxX/(X+Kd)获得每个候选适配子与BMSCs的结合曲线及平衡解离常数(Kd)。挑选与BMSCs结合力最高的适配子,流式细胞术检测其与不同来源BMSCs的结合能力。结果流式细胞术与荧光共聚焦实验表明SELEX筛选第9轮文库与BMSCs结合能力最高。经序列分析获得8个大鼠BMSCs特异性候选适配子,均能与BMSCs高亲和力结合,其中适配子apt7的亲和力最高,Kd值为(11.79±0.72)nmol/L。细胞选择性实验表明apt7仅与大鼠来源的BMSCs高亲和力结合,而不能结合小鼠及人来源的BMSCs。结论通过SELEX技术成功筛选出能高亲和力、高特异性结合大鼠BMSCs的适配子apt7,此方法为BMSCs的鉴定提供了新思路和方法,同时为适配子应用于组织工程支架表面招募循环干细胞提供了实验依据。

乌拉尔甘草悬浮单细胞的筛选及培养

乌拉尔甘草种子在消毒后培养无菌苗,截取无菌苗子叶、上胚轴和下胚轴等作为外植体,诱导和继代培养成松散型愈伤组织,然后在振荡培养后过筛获得悬浮单细胞;再对悬浮液进行多级稀释、培养制备小细胞团.结果表明,在含1.0.mg/L.2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)、1.0.mg/L.α-萘乙酸(NAA)、1.0.mg/L6-苄基氨基嘌呤(6-BA)、0.3.mg/L激动素(KT)的MS培养基中,上胚轴能在3～5次继代培养后获得松散型愈伤组织,过80目筛可以获得悬浮单细胞和小细胞团;同样的培养基,悬浮单细胞在琼脂表面、珍珠岩表面和看护培养中培养,看护培养的细胞生长最快、小细胞团形态最佳.

噬菌体随机肽库技术在细胞特异性多肽筛选中的研究进展

噬菌体展示肽库可筛选出与靶向细胞特异性结合的多肽,具有较好的特异性与靶向性。全细胞筛选的应用推进了噬菌体随机肽库技术的发展并拓宽了其研究应用领域,现针对噬菌体随机肽库技术的发展和在细胞特异性结合多肽筛选中的研究进展及应用进行概述。

抗稻瘟病细胞突变体筛选技术体系的建立

以稻瘟病菌粗毒素提取液为选择压,选取籼稻材料缙2B、缙恢36和缗恢10进行抗稻瘟病突变体的筛选.结果表明:1)在成熟胚诱导产生愈伤组织过程中,2,4-D是诱导愈伤的关键因子,3种材料在附加2mg/L 2,4-D的NB培养基(NBD_2)上诱导产生的愈伤较好.2)粗毒素对3种材料的胚根、胚芽、愈伤组织的生长都有着明显的抑制作用,表明粗毒素具有一定的致病力,其毒性并不与浓度完全成正比关系,而是在一定范围内随浓度的增加而增加.在毒素浓度为45%时,缗2B胚根和胚芽生长受到抑制的程度最大,而缙恢36和缙恢10则在30%浓度中生长受到明显抑制.3)粗毒素对3种材料的愈伤组织成活率及再生频率有着明显的抑制作用,其程度随浓度的增加而增大,当稻瘟病粗毒素浓度为60%时,愈伤组织不生长,并变褐死亡,最终选择45%的毒素浓度进行2次继代抗性筛选并获得再生植株.