人类核转录因子红细胞系2p45相关因子2和线粒体转录因子A在前列腺癌中的表达及意义

目的检测前列腺癌组织标本中人类核转录因子红细胞系2p45相关因子2(Nrf2)、人类线粒体转录因子A(TFAM)的表达,并分析其表达与Gleason评分的关系。方法用免疫组织化学S-P法检测40例前列腺癌组织标本中Nrf2与TFAM的表达,应用Spearman相关分析Gleason评分与Nrf2、TFAM表达强度的关系。结果 Nrf2和TFAM的表达与Gleason评分正相关(P值为0.0052,0.0003);Nrf2与TFAM的表达也有相关性(P=0.006)。结论 Nrf2与TFAM是前列腺癌恶性程度的相关因素之一,Nrf2与TFAM很可能通过同一机制参与前列腺癌的发生发展过程。

核转录因子红细胞系相关因子-2干扰质粒构建及鉴定

目的设计及构建小鼠核转录因子红细胞系相关因子-2(Nrf2)基因的干扰质粒,并筛选出效果最好的干扰质粒。方法设计3组针对Nrf2基因的核糖核酸干扰(RNAi)序列,应用基因重组技术克隆入载体中构建短发夹RNA(shRNA),分别为shRNA1、shRNA2及shRNA3,通过基因测序鉴定,经Lipofectamine2000转染至BV2细胞,实时PCR检测Nrf2 mRNA的表达,Western Blot法检测Nrf2蛋白的表达。结果测序表明,克隆入载体中的Nrf2干扰序列及读码框完全正确,实时PCR及Western Blot显示shRNA3干扰效果最强。结论成功构建小鼠Nrf2的有效干扰质粒,为Nrf2信号通路在脑卒中领域的功能研究奠定了基础。

硫氢化钠增加高糖高脂条件下小鼠心房肌细胞系HL-1谷胱甘肽合成

目的研究硫氢化钠(NaHS)是否通过调节谷胱甘肽(GSH)的合成,降低活性氧自由基(ROS)产生,改善小鼠2型糖尿病心肌病(DCM)。方法将小鼠心房肌细胞系HL-1分为对照组、高葡萄糖(HG:40 mmol/L)和棕榈酸(Pal:500μmol/L)处理组;以及硫氢化钠(NaHS,100μmol/L)、DL-炔丙基甘氨酸[PPG,胱硫醚γ裂解酶(CSE)抑制剂,1 mmol/L]和N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC,ROS抑制剂,5 mmol/L)处理72 h组。Western blot检测CSE和谷胱甘肽合成酶(GSS)的表达;二氢乙锭(DHE)和二氯氟甲烷(DCFH)检测ROS含量;免疫共沉淀检测核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)泛素化水平及Nrf2与肌肉特异性环指蛋白1(Murf1)的相互作用。结果与对照组比高糖高脂处理HL-1细胞后CSE、溶质载体家族7成员11(SLC7A11)、谷氨酸半胱氨酸连接酶催化亚基C(GCLC)、谷氨酸半胱氨酸连接酶修饰亚基M(GCLM)、谷胱甘肽合成酶(GSS)的表达水平下降,而NaHS能恢复其表达。高糖高脂组ROS含量高于NaHS组。与NaSH组比高糖高脂条件下Murf1与Nrf2的相互作用增加,Nrf2泛素化水平明显增加。结论硫氢化钠减轻Nrf2的泛素化,增加GSH合成关键酶的表达。

NRF2、Keap1基因及蛋白在非小细胞肺癌肿瘤组织中的表达

目的探讨非小细胞肺癌(NSCLC)细胞核细胞系相关因子2(NRF2)和胞质蛋白伴侣分子(Keap1)的基因和蛋白表达与临床特点的关系。方法应用逆转录PCR和免疫组化技术检测34例NSCLC组织NRF2和Keap1mRNA和蛋白的表达。结果NSCLC早期(Ⅰ+Ⅱ期)和晚期(Ⅲ+Ⅳ期)患者的Keap1 mRNA相对定量表达有统计学差异(P=0.039),NRF2 mRNA相对定量在不同性别患者中表达有统计学差异(P=0.034)。结论晚期NSCLC患者肿瘤组织Keap1 mRNA表达升高,女性患者NRF2 mRNA表达较男性降低。

Nrf2、TET2蛋白表达与非小细胞肺癌病理特征及预后的关系

目的 探究细胞核细胞系相关因子2(Nrf2)、十十一易位酶2(TET2)蛋白表达与非小细胞肺癌病理特征及预后的关系。方法 选择2021年1月—2022年1月本院收治的82例非小细胞肺癌患者作为研究对象,按照12个月内治疗情况分为预后良好组(62例)和预后不良组(20例)两组。取早期患者术中的组织标本,晚期活检取的组织,于患者入院24小时内收集并整理所有受试者的临床资料,完成血肌酐(Scr)水平、糖蛋白抗原15-3(CA15-3)及癌胚抗原(CEA)、TET2及Nrf2检测。采用Logistic多因素回归分析非小细胞肺癌发病的影响因素,观察非小细胞肺癌患者的TET2及Nrf2蛋白阳性表达以及分析Nrf2、TET2蛋白表达与非小细胞肺癌病理特征及预后的关系。结果 术后随访12个月,非小细胞肺癌患者预后不良发生20例,发生率为24.39%。预后不良患者CEA、CA15-3、TET2蛋白表达高于预后良好患者,Nrf2蛋白表达低于预后良好患者(P<0.05)。以非小细胞肺癌患者预后为因变量(赋值情况:预后良好患者=1,预后不良患者=0),将CEA水平、CA15-3水平、TET2、Nrf2设为自变量,并对其进行赋值。经多因素Logistic回归分析,CEA水平、CA15-3水平、TET2、Nrf2均是非小细胞肺癌预后不良患者的危险因素(P<0.05)。结论 非小细胞肺癌患者TET2水平高于正常肺组织,Nrf2水平低于正常肺组织,TET2、Nrf2均是非小细胞肺癌预后不良患者的危险因素。

缺血后处理对缺血-再灌注大鼠肾脏转录因子Nrf2表达的影响

目的:研究缺血后处理对缺血-再灌注大鼠肾脏转录因子红细胞系-2相关因子2(Nrf2)表达的影响,探讨Nrf2在缺血-再灌注中的作用及其意义。方法:SD大鼠30只分三组:假手术C组、缺血-再灌注(I-R)组、缺血后处理(IPO)组。于再灌注2h处死大鼠,取血检测血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)及胱抑素C(Cys C)的水平,并测定血清超氧化物歧化酶(SOD)活性及丙二醛(MDA)含量。应用RT-PCR及Western-blot方法定量分析Nrf2,血红素氧合酶1(H0-1),y-谷氨酞半肤氨酸合成酶(-GCS)蛋白在肾组织中的表达。结果:IPO组肾组织Cr,BUN,Cys C及MDA水平显著低于缺血再灌注组,SOD活性显著高于缺血再灌注组,Nrf2,H0-1,γ-GCS蛋白在肾组织中的表达明显增多。结论:缺血后处理可能通过提高Nrf2在肾组织中的表达增多避免加重肾缺血再灌注损伤。

人参皂苷Rd通过下调Nrf2表达调控H460细胞的增殖和凋亡

核转录因子红细胞系-2p45相关因子-2(nuclear factor erythroid-2p45-related factor 2,Nrf2)是细胞应对外界应激的主要调控因子,通过调控一系列细胞保护酶,维持细胞稳态。然而,在许多肿瘤细胞中Nrf2过度激活,导致肿瘤细胞获得增殖优势并产生化疗耐药,因此,靶向抑制Nrf2是肿瘤增敏治疗的一种新思路。人参皂苷Rd是人参皂苷中的重要活性成分,具有显著的抗肿瘤作用。本研究以不同浓度的人参皂苷Rd处理人非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)H460细胞,利用CCK-8法检测细胞活力;倒置显微镜观察H460细胞的形态变化;流式细胞术检测细胞周期及凋亡率;RT-qPCR和Western印迹检测的Nrf2及其下游调控基因的表达情况;此外通过转染Nrf2-siRNA下调H460细胞中Nrf2的表达,观察其对人参皂苷Rd增敏的影响。结果显示,与对照组相比,人参皂苷Rd能够抑制H460细胞增殖活力,诱导细胞G0/G1期阻滞,促进细胞凋亡,具有剂量依赖性(P<0.05);此外,人参皂苷Rd能够下调Nrf2,醌氧化还原酶1[NAD(P)H:quinoneoxidoreductase,NQO1],谷氨酰半胱氨酸连接酶催化亚基(glutamate--cysteine ligase catalytic subunit,GCLC)和调节亚基(glutamate--cysteine ligase regulatory subunit,GCLM)的mRNA和蛋白质水平,同时增强H460细胞对化疗药的敏感性(P<0.05),而转染Nrf2-siRNA后,人参皂苷Rd的增敏作用减弱。表明人参皂苷Rd可以抑制非小细胞肺癌H460细胞活性并增敏化疗,其机制可能是通过抑制Nrf2信号通路来实现。

血清Nrf2、HO-1与帕金森病患者氧化应激损伤、睡眠障碍的相关性

目的研究血清核转录因子红细胞系相关因子-2(Nrf2)、血红素加氧酶-1(HO-1)与帕金森病患者氧化应激损伤、睡眠障碍的相关性。方法采用前瞻性研究方法,以该院2019年9月至2022年8月诊断并进行治疗的帕金森病患者120例作为观察组,按严重程度分为早期组患者46例,中期组患者41例,晚期组患者33例。根据匹兹堡睡眠质量指数分析,睡眠障碍患者55例。另选取同期进行健康体检的志愿者120例作为对照组,比较观察组以及对照组、不同严重程度患者、不同睡眠质量患者的Nrf2、HO-1、标丙二醛(MDA)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)水平进行比较。结果观察组患者的Nrf2(t=5.185,P<0.001)、MDA(t=10.858,P<0.001)显著高于对照组,差异有统计学意义(P<0.05),HO-1(t=8.119,P<0.001)、GSH-Px(t=229.560,P<0.001)、SOD(t=94.466,P<0.001)显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);不同严重程度帕金森病患者的Nrf2、HO-1、MDA、GSH-Px、SOD水平比较,差异有统计学意义(P<0.05),通过两两比较,患者的Nrf2、MDA从高到低依次为晚期组、中期组及早期组,HO-1、GSH-Px、SOD水平从高到低依次为早期组、中期组及晚期组(P<0.05);睡眠障碍组患者的Nrf2(t=2.442,P=0.016)、MDA(t=2.612,P<0.001)显著高于对照组,HO-1(t=8.094,P<0.001)、GSH-Px(t=62.301,P<0.001)、SOD(t=57.735,P<0.001)显著低于对照组,差异有统计学意义(P<0.05);相关性分析显示,血清Nrf2与睡眠障碍、MDA呈正相关(P<0.001),与血清GSH-Px、SOD呈负相关(P<0.001),血清HO-1与睡眠障碍、MDA呈负相关(P<0.001),与血清GSH-Px、SOD呈正相关(P<0.001)。结论血清Nrf2、HO-1与帕金森病患者氧化应激损伤、睡眠障碍显著相关,可作为帕金森病疾病进展的重要参考。

砷对人永生化角质形成细胞核转录因子红细胞系-2p45相关因子-2和Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1基因表达的影响

目的探讨不同剂量亚砷酸钠对人永生化角质形成细胞(human keratinocytes cell,Ha Ca T)Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Keap1)和核转录因了红细胞系-2 p45相关因子-2(Nrf2)基因表达的影响。方法将Ha Ca T细胞分别暴露于终浓度为0(对照)、1.30、3.25、6.50μmol/L的亚砷酸钠培养基中培养24、48、72 h。采用流式细胞仪检测Ha Ca T细胞凋亡率,采用实时荧光定量(real-time quantitative PCR)检测Ha Ca T细胞中Nrf2、Keap1 m RNA的表达水平。结果与对照组相比,1.30μmol/L亚砷酸钠染毒24 h后Ha Ca T细胞的凋亡率降低,而3.25、6.50μmol/L亚砷酸钠染毒48、72 h后Ha Ca T细胞的凋亡率升高,差异均有统计学意义(P<0.05);且随着亚砷酸钠染毒时间的延长和染毒剂量的升高,Ha Ca T细胞的凋亡率均呈上升趋势。与对照组相比,1.30μmol/L亚砷酸钠染毒24、48、72 h和3.25μmol/L亚砷酸钠染毒24 h后Ha Ca T细胞中Nrf2 m RNA的表达水平均增高,而3.25、6.50μmol/L亚砷酸钠染毒72 h后Ha Ca T细胞中Nrf2 m RNA的表达水平均下降,差异有统计学意义(P<0.05);且随着亚砷酸钠染毒时间的延长和染毒剂量的升高,Ha Ca T细胞Nrf2 m RNA的表达水平均呈下降趋势。与对照组相比,1.30、3.25μmol/L亚砷酸钠染毒72 h和3.25、6.50μmol/L亚砷酸钠染毒48 h后Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平均增高,差异有统计学意义(P<0.05)。随着亚砷酸钠染毒时间的延长,1.30μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平呈波动性上升,3.25μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平呈逐渐上升趋势,6.50μmol/L亚砷酸钠染毒组Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平呈先上升后下降;随着亚砷酸钠染毒剂量的升高,24、72 h时Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平呈下降趋势,而48 h时Ha Ca T细胞中Keap1 m RNA的表达水平呈上升趋势。结论亚砷酸钠可抑制Ha Ca T细胞的生长,诱导凋亡和角化的发生,其机制可能与Nrf2和Keap1基因的表达有关。

核因子红细胞系2相关因子2抑制铁死亡对高氧肺损伤的影响

目的观察不同条件下人肺微血管内皮细胞(HPMEC)中核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)的表达变化, 探讨Nrf2抑制铁死亡在减轻高氧肺损伤(HLI)过程中的作用。方法采用HPMEC建立高氧暴露模型。将HPMEC按照简单随机分组分为4组:对照组、高氧组(氧体积分数950 mL/L)、铁死亡抑制剂组(氧体积分数950 mL/L, 10 μmol/L Ferrostatin)及Nrf2抑制剂组(氧体积分数950 mL/L, 10 μmol/L ML385), 分别在24 h、48 h使用细胞活性检测试剂盒测定细胞活性, 荧光活性氧(ROS)试剂盒检测各组细胞内ROS水平, 应用实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测Nrf2、GPX4的mRNA及其蛋白表达水平。2组间比较采用两样本t检验;多组间比较采用单因素方差分析。结果 1.与对照组相比, 高氧组HPMEC细胞活性降低, 细胞内ROS含量增加, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:0.750±0.010比1.010±0.160, 48 h:0.690±0.050比1.000±0.070)和蛋白表达(24 h:0.160±0.010比0.290±0.010, 48 h:0.190±0.010比0.250±0.010)均下降, Nrf2 mRNA(24 h:1.740±0.050比1.000±0.050, 48 h:2.130±0.020比1.000±0.030)和蛋白表达(24 h:0.840±0.010比0.480±0.010, 48 h:0.840±0.010比0.550±0.030)均增加, 差异均有统计学意义(均P<0.05);2.与高氧组相比, 铁死亡抑制剂组细胞活性增加, 细胞内ROS含量减少, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:1.520±0.110, 48 h:1.880±0.050)和蛋白表达(24 h:0.290±0.010, 48 h:0.250±0.004)均增加, Nrf2 mRNA(24 h:0.780±0.040, 48 h:0.760±0.030)和蛋白表达(24 h:0.480±0.010, 48 h:0.540±0.020)均下降, 差异均有统计学意义(均P<0.05);3.与高氧组相比, Nrf2抑制剂组细胞活性进一步下降, 细胞内ROS水平进一步增加, 24 h及48 h GPX4 mRNA(24 h:0.600±0.030, 48 h:0.590±0.003)及蛋白表达(24 h:0.150±0.001, 48 h:0.180±0.001)均下降, Nrf2 mRNA表达量在24 h表达升高(3.360±0.130), 48 h表达下降(1.430±0.130), 差异均有统计学意义(均P<0.05), Nrf2蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。结论铁死亡参与了HLI的发生, Nrf2可以通过抑制铁死亡, 从而减轻高氧暴露引起的HLI。因此, Nrf2抑制铁死亡对于HLI的改善作用可以为相关疾病提供新的治疗靶点。

右美托咪定对高氧诱导急性肺损伤小鼠的保护作用及Nrf2/HO-1通路的影响

目的:探讨右美托咪定对高氧诱导急性肺损伤小鼠的保护作用及核转录因子红细胞系2p45相关因子2(Nrf2)/血红素加氧酶-1(HO-1)通路的影响。方法:将100只C57BL/6小鼠随机分为5组:正常对照组、模型组、地塞米松组(100 mg·kg-1)、右美托咪定低(40 mg·kg-1)、高(80 mg·kg-1)剂量组。除正常对照组外,其余各组建立高氧诱导急性肺损伤模型,并于造模成功后腹腔注射相应药物,正常对照组和模型组给予等体积生理盐水,qd,持续7 d。实验结束后,检测小鼠肺/体比值、肺损伤评分、血氧分压(Pa O2),小鼠肺组织中Nrf2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平,胱天蛋白酶-1(caspase-1)、白细胞介素-1β(IL-1β)、白细胞介素-18(IL-18)蛋白水平。制作肺部HE染色切片,观察肺损伤情况。结果:与正常对照组比较,模型组肺/体比值、肺损伤评分、Nrf2 mRNA及蛋白表达水平、IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达水平明显升高,Pa O2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平明显降低(P<0.05);与模型组比较,右美托咪定组肺/体比值、肺损伤评分、Nrf2 mRNA及蛋白表达水平、IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达水平明显降低,Pa O2、HO-1 mRNA及蛋白表达水平明显升高(P<0.05),且呈剂量相关性;右美托咪定低剂量组与地塞米松组比较差异有统计学意义(P<0.05)。正常对照组肺泡组织结构正常,无炎症细胞浸润、无胶原蛋白沉淀;模型组、右美托咪定低剂量组肺泡壁明显增厚、破裂,可见中性细胞及少量嗜酸性细胞浸润,肺间质可见较多胶原蛋白沉淀;右美托咪定高剂量组及地塞米松组肺泡结构基本正常,有少量中性细胞侵润,几乎无胶原蛋白沉淀。结论:右美托咪定对高氧诱导急性肺损伤小鼠的保护作用与抑制Nrf2 mRNA及蛋白表达水平表达,进而抑制IL-1β、IL-18、caspase-1蛋白表达有关。

基于Nrf2通路探讨松脂醇二葡萄糖苷改善小鼠骨质疏松的机制研究

目的分析松脂醇二葡萄糖苷(Pinoresinol diglucoside,PD)改善骨质疏松的作用机制。方法微型CT分析小鼠小梁骨体积/总体积(bone volume/total volume,BV/TV)、平均小梁厚度(average trabecular thickness,Tb.Th)、平均小梁数目(average number of trabeculae,Tb.N)和平均小梁间距(average trabecular spacing,Tb.Sp);HE染色检测骨组织损伤;TRAP染色分析成骨细胞数量/骨周长(number of bone cells/bone circumference,N.Ob/B.Pm)、空泡率以及破骨细胞表面/骨表面百分比(osteoclast surface/bone surface,Ocs/BS);ELISA检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)、抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrateresistant acid phosphatase,TRAP)相对活性,超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)和谷胱甘肽(glutathione,GSH)含量;Wb检测核转录因子红细胞系2相关因子2(Nuclear factor erythroid-2-related factor 2,Nrf2)和HO-1表达。结果与假手术组相比,模型组小鼠骨丢失量增加,BV/TV、Tb.Th、Tb.N、N.Ob/B.Pm、ALP相对活性、SOD、GSH、Nrf2和HO-1表达水平明显下降,Tb.Sp、空泡率、Ocs/BS、TRAP相对活性和MDA水平明显上升(P<0.05);E2组和PD组小鼠与模型组小鼠变化趋势完全相反(P<0.05),PD组和E2组小鼠上述指标无显著差异(P>0.05)。结论PD可通过激活Nrf2信号通路改善小鼠骨质疏松症状。

地黄苷A通过调节AKT/Nrf2/GPX4信号通路介导的铁死亡改善大鼠心肌缺血再灌注损伤

目的:探讨地黄苷A(ReA)通过调节蛋白激酶B(AKT)/核因子红细胞系2相关因子2(Nrf2)/谷胱甘肽过氧化酶4(GPX4)信号通路介导的铁死亡对大鼠心肌缺血再灌注损伤(MI/RI)的影响。方法:将90只大鼠随机分为假手术组(Sham组)、模型组(Model组)、ReA低剂量组(ReA-L组)、ReA高剂量组(ReA-H组)、铁死亡抑制剂ferrostatin-1(Fer-1)组(Fer-1组)及ReA高剂量+AKT抑制剂perifosine组(ReA-H+perifosine组),每组15只。ReA-L组、ReA-H组大鼠分别腹腔注射40、80 mg/kg ReA,Fer-1组大鼠腹腔注射2 mg/kg ferrostatin-1,ReA+perifosine组大鼠腹腔注射80 mg/kg ReA及20 mg/kg perifosine,Sham组和Model组大鼠腹腔注射等量生理盐水,每日1次,连续给药2周。除Sham组外,各组大鼠在末次给药1 h后采用左冠状动脉前降支结扎法建立MI/RI大鼠模型。试剂盒检测血清心肌酶水平;氯代三苯基四氮唑(TTC)染色测定心肌梗死面积;苏木素-伊红(HE)染色观察心肌组织病理形态学变化;原位末端标记测定法(TUNEL)染色检测心肌细胞凋亡率;试剂盒测定心肌组织抗氧化能力;Fe^(2+)含量检测试剂盒检测心肌组织Fe^(2+)含量;蛋白免疫印迹法(Western Blot)检测AKT/Nrf2/GPX4信号通路相关蛋白表达。结果:与Sham组比较,Model组大鼠血清乳酸脱氢酶(LDH)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、心肌肌钙蛋白I(cTnI)水平及心肌组织中丙二醛(MDA)和Fe^(2+)含量上升,组织中谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、超氧化物歧化酶(SOD)活性及p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平下降,转铁蛋白受体1(TfR1)蛋白水平升高,心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积增加,心肌组织损伤严重(P<0.05);与Model组相比,ReA-L组、ReA-H组、Fer-1组大鼠血清LDH、CK-MB和cTnI水平及心肌组织中MDA和Fe^(2+)含量下降,组织中GSH-Px、SOD活性及p-AKT/AKT、Nrf2和GPX4蛋白水平升高,TfR1蛋白水平降低,心肌细胞凋亡率及心肌梗死面积减少,心肌组织损伤减轻(P<0.05);perifosine减弱了高剂量ReA对MI/RI大鼠铁死亡的抑制作用。结论:ReA可能通过激活AKT/Nrf2/GPX4信号通路,抑制铁死亡,改善MI/RI大鼠心肌组织损伤。

Nrf2基因缺失对子鼠肺组织发育的影响研究

目的探究Nrf2基因缺失对子鼠肺组织发育的影响。方法分别采用C57BL/6孕鼠(WT)和Nrf2基因缺失孕鼠(Nrf2-/-)构建IUGR子鼠模型。根据出生体重将子鼠分为四组:WT Normal,WT IUGR,Nrf2-/-Normal,Nrf2-/-IUGR。观察各组体重变化,出生后2、4周分别取材,观察脑/肝比和肺组织形态变化;肺组织切片免疫组化染色进行CD31阳性细胞计数;qRT-PCR检测肺组织VEGFα和VEFR2 mRNA的相对水平。结果Nrf2-/-IUGR子鼠出生体重、7d、14d体重均显著低于WT IUGR子鼠(P<0.05);14d时Nrf2-/-子鼠脑/肝比均低于WT子鼠,28d时Nrf2-/-Normal子鼠高于WT Normal子鼠(P<0.05)。HE染色显示,Nrf2-/-子鼠肺泡塌陷和肺泡壁增厚的现象较WT子鼠更加严重。Nrf2-/-小鼠与WT小鼠的肺泡平均线性截距与CD31阳性细胞计数均有显著差异(P<0.05)。14d时,与WT子鼠相比,Nrf2-/-子鼠肺组织中VEGFα和VEFR2的mRNA的表达均显著上调(P<0.05)。结论Nrf2基因缺失可加重子鼠肺组织破坏和肺血管新生减少,诱导严重的肺发育不良。

EGCG通过Nrf2/ARE信号通路改善鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的研究

目的研究表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)对鱼藤酮诱导的SH-SY5Y细胞氧化损伤的作用并探讨可能的机制。方法将SH-SH5Y细胞分为对照组(正常培养细胞)、模型组(鱼藤酮诱导的氧化损伤模型)和低、中、高剂量实验组(分别给予10、20、40μmol·L^(-1)EGCG)。用小干扰RNA(siRNA)干扰细胞核转录因子红细胞系-2p45相关因子2(Nrf2)表达,将干扰后细胞分为si-对照组(细胞正常培养)、si-模型组(鱼藤酮诱导的氧化损伤模型)、si-低剂量实验组、si-中剂量实验组(分别给予10、20μmol·L^(-1)EGCG)。用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)法检测细胞存活率;用乳酸脱氢酶(LDH)法检测细胞损伤情况;用还原型辅酶Ⅱ法检测总谷胱甘肽过氧化物酶(GPx)活性;用硫代巴比妥酸法检测丙二醛(MDA)活性;用荧光探针法检测活性氧(ROS)水平;用蛋白质印迹法检测Nrf2、酪氨酸羧化酶(TH)蛋白表达水平。结果对照组、模型组和低、中、高剂量实验组细胞存活率分别为(100.00±1.86)%、(45.33±4.25)%、(74.21±4.54)%、(80.30±3.62)%和(70.12±4.61)%;LDH水平分别为(100.00±3.67)、(222.56±11.46)、(125.57±20.52)、(129.60±6.29)和(149.51±11.99)U·L^(-1);ROS相对荧光强度分别为1.00±0.00、1.78±0.16、1.48±0.15、1.13±0.09和1.11±0.13;MDA活性分别为(2.11±0.34)、(6.39±0.55)、(4.84±0.36)、(3.96±0.46)和(4.43±0.43)nmol·mg^(-1);GPx活性分别为(668.80±32.79)、(533.03±57.72)、(718.30±73.78)、(735.03±87.25)和(797.98±66.76)mU·mg^(-1);TH蛋白相对表达水平分别为0.33±0.04、0.21±0.03、0.30±0.01、0.31±0.03和0.27±0.01;模型组上述指标与对照组比较,高剂量实验组上述指标与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。对照组、模型组和低、中、高剂量实验组Nrf2蛋白表达水平分别为0.26±0.07、0.28±0.02、0.39±0.05、0.54±0.09和0.53±0.02,低、中、高剂量实验组与模型组比较,在统计学上差异均有统计学意义(P<0.05,P<0.01)。si-对照组、si-模型组和si-低剂量实验组、si-中剂量实验组的细胞存活率分别为(100.00±5.73)%、(50.69±5.48)%、(61.95±8.15)%和(60.59±9.07)%;ROS相对荧光强度分别为1.00±0.05、1.48±0.10、1.30±0.15和1.28±0.22。si-模型组与si-对照组比较,在统计学上差异均有统计学意义(均P<0.05)。结论EGCG可能通过Nrf2/ARE信号通路对鱼藤酮所致SH-SY5Y细胞氧化损伤发挥保护作用。

氧化应激在放射性肺损伤机制中的作用进展

辐射引起的活性氧类物质堆积容易引起肺组织的氧化应激状态。氧化应激在放射性肺损伤的启动、炎性反应及纤维化发展的过程中发挥重要作用。表没食子儿茶素没食子酸酯等天然抗氧化活性物质能够通过清除氧自由基、激活内源性抗氧化信号通路转录因子红细胞系2相关因子2-抗氧化应激反应元件途径,诱导增加抗氧化物酶表达、抑制氧自由基生成相关的信号通路和酶系、调节免疫功能等发挥抗炎抗纤维化作用,为放射性肺损伤的防治提供了新途径。

氧化苦参碱对帕金森小鼠中枢神经系统氧化应激的影响

目的探讨氧化苦参碱对帕金森小鼠中枢神经系统氧化应激的影响及其可能机制。方法将80只C57BL/6小黑鼠随机分为正常组、模型组及氧化苦参碱低、高剂量组,每组20只。模型组及氧化苦参碱低、高剂量组小鼠分别给予1-甲基-4-苯基-1、2、3、6-四氢吡啶(MPTP) 30 mg·kg^-1溶入0.6 mL生理盐水腹腔注射建立帕金森病小鼠模型,正常组小鼠腹腔注射生理盐水0.6 mL,每日1次,连续7 d。动物模型制备成功后,氧化苦参碱低、高剂量组小鼠分别给予氧化苦参碱150、250 mg·kg^-1溶入0.2 mL生理盐水中腹腔注射,正常组、模型组小鼠分别给予0.2 mL生理盐水腹腔注射,均每日1次,连续27 d。小鼠处死前每日测体质量。分别于末次注射MPTP后的第1、7、27天采用旷场实验测量各组小鼠水平运动距离。末次注射MPTP后的第27天处死小鼠取脑组织,苏木精-伊红染色观察4组小鼠脑组织黑质纹状体处神经元损伤情况;比色法检测4组小鼠脑组织中超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)及丙二醛(MDA)含量,末端脱氧核苷酸介导的d UTP缺口末端标记测定法检测4组小鼠脑组织细胞凋亡情况,Western blot法检测4组小鼠脑组织中Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白1(Keap1)、核因子红细胞系-2相关因子2(Nrf2)、抗氧化反应元件(ARE)蛋白表达。结果造模前,4组小鼠体质量比较差异无统计学意义(F=0.214,P> 0.05);造模后5、9、13、17、21、27 d,4组小鼠体质量比较差异均有统计学意义(F=1.057、1.087、1.344、5.374、3.582、6.274,P> 0.05),其中模型组及氧化苦参碱低、高剂量组小鼠体质量均低于正常组(P <0.05),氧化苦参碱低剂量组小鼠体质量高于模型组(P> 0.05);氧化苦参碱高剂量组小鼠造模后第17、21、27天的体质量与模型组比较显著增高(P <0.05);氧化苦参碱高剂量组小鼠造模后第27天的体质量高于低剂量组(P <0.05)。末次注射MPTP后第1天起,模型组小鼠水平运动距离即显著短于正常组(P <0.05);第1、7天时,氧化苦参碱低、高剂量组小鼠水平运动距离与模型组比较差异无统计学意义(P﹥0.05);第27天时,氧化苦参碱低、高剂量组小鼠的水平运动距离大于模型组(P <0.05);末次注射MPTP后第1、7、27天,氧化苦参碱高剂量组小鼠水平运动距离与低剂量组比较差异无统计学意义(P> 0.05)。末次注射MPTP后第27天,模型组及氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织细胞损伤率高于正常组(P <0.05);氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织细胞损伤率低于模型组(P <0.05);氧化苦参碱高剂量组小鼠脑组织细胞损伤率低于氧化苦参碱低剂量组(P <0.05)。4组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px、GSH、MDA相对表达量比较差异均有统计学意义(F=11.374、10.925、6.688、9.346,P <0.05)。与正常组比较,模型组及氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px、GSH含量显著降低,MDA含量显著增高(P <0.05);氧化苦参碱低剂量组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px、GSH、MDA相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P> 0.05);氧化苦参碱高剂量组小鼠脑组织中SOD、GSH-Px、GSH相对表达量显著高于模型组和低剂量组(P <0.05),MDA相对表达量显著低于模型组和低剂量组(P <0.05)。与正常组比较,模型组、氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织细胞凋亡率显著升高(P <0.05);与模型组比较,氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织细胞凋亡率显著减少(P <0.05);与氧化苦参碱低剂量组比较,高剂量组小鼠脑组织细胞凋亡率显著减少(P <0.05)。4组小鼠脑组织Keap1、Nrf2、ARE蛋白表达比较差异均有统计学意义(F=10.954、8.241、10.699,P <0.05)。与正常组比较,模型组及氧化苦参碱低、高剂量组小鼠脑组织中Keap1蛋白相对表达量显著降低,Nrf2、ARE蛋白相对表达量显著升高(P <0.05);氧化苦参碱低剂量组小鼠脑组织中Keap1、ARE、Nrf2蛋白相对表达量与模型组比较差异无统计学意义(P> 0.05);与模型组和氧化苦参碱低剂量组比较,氧化苦参碱高剂量组小鼠脑组织中Keap1蛋白相对表达量显著降低,Nrf2、ARE蛋白相对表达量显著升高(P <0.05)。结论氧化苦参碱能有效抑制帕金森小鼠中枢神经系统氧化应激反应,该作用可能是通过激活Keap1/Nrf2/ARE信号通路活性发生的。

芹菜素对裸鼠肝癌皮下移植瘤抑制作用的研究

目的探讨芹菜素(APG)对裸鼠肝癌皮下移植瘤的抑制作用及其相关机制。方法建立人肝癌阿霉素(ADM)耐药细胞BEL-7402/ADM裸鼠皮下移植瘤模型,24只移植成功的裸鼠随机分为三组:对照组(ADM 3 mg/kg)、APG组(APG 50 mg/kg+ADM 3 mg/kg)和mi R-101 mimics组(mi R-101 mimics 5 mg/kg+ADM 3 mg/kg),每组8只。上述药物每3天注射l次,共7次。给药结束后处死裸鼠,切取移植瘤组织。免疫组化法检测Ki-67蛋白表达评价肿瘤细胞增殖,免疫蛋白印迹法检测肿瘤组织核转录因子红细胞系相关因子-2(Nrf2)蛋白的表达,q RTPCR法测定移植瘤组织mi R-101水平。结果与对照组相比,APG和mi R-101 mimics能显著抑制肿瘤生长(P<0.05),抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05或P<0.01),此外,APG和mi R-101 mimics还能下调肿瘤组织Nrf2蛋白的表达(P<0.01),上调mi R-101表达(P<0.05)。结论 APG能有效抑制肝癌移植瘤生长,其机制可能与抑制肿瘤细胞增殖,上调mi R-101表达和下调Nrf2表达有关。

砷致HaCaT细胞恶性转化过程中NRF2对自噬的调控作用

目的探讨亚砷酸钠(NaAsO2)致永生化人皮肤角质形成(HaCaT)细胞恶性转化过程中核转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子-2(NRF2)对自噬的调控作用。方法采用细胞培养方法, 以含0.0(对照组)和1.0 μmol/L NaAsO2(染砷组)的DMEM高糖培养基长期培养HaCaT细胞至第35代, 构建细胞恶性转化模型, 收集细胞恶性转化模型建立过程中对照组和染砷组的第0、1、7、14、21、28、35代细胞;分别采用NRF2干扰RNA(siRNA)、磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3K)抑制剂LY294002及哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mTOR)抑制剂Rapamycin处理染砷组的第35代恶性转化HaCaT细胞(T-HaCaT细胞)。采用蛋白免疫印迹(Western blot)法检测对照组、染砷组不同代次HaCaT细胞及各处理组T-HaCaT细胞内NRF2, PI3K-蛋白激酶B(Akt)-mTOR信号通路相关指标PI3K、Akt、mTOR、磷酸化(p)-PI3K、p-Akt、p-mTOR, 自噬相关蛋白p62、Beclin1、微管相关蛋白1轻链(LC)3Ⅰ、LC3Ⅱ的蛋白表达情况。结果染砷组不同代次HaCaT细胞中NRF2蛋白表达和p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt、p-mTOR/mTOR比值比较, 差异均有统计学意义(F = 9.371、16.035、15.932、27.739, P均<0.05);且NRF2蛋白表达、p-mTOR/mTOR比值均高于对照组同代细胞(P均<0.05)。与同代HaCaT细胞比较, T-HaCaT细胞中NRF2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR、p62蛋白表达均明显较高, Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/ LC3Ⅰ比值均明显较低(P均<0.05);NRF2沉默的T-HaCaT细胞较其对照siRNA(Con siRNA)组Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均较高, NRF2、p-mTOR、p62蛋白表达均较低(P均<0.05);LY294002处理组T-HaCaT细胞较其非处理组Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均较高, NRF2、p-PI3K、p-Akt、p-mTOR蛋白表达均较低(P均<0.05);Rapamycin处理组T-HaCaT细胞较其非处理组Beclin1蛋白表达和LC3Ⅱ/LC3Ⅰ比值均较高, p-mTOR蛋白表达较低(P均<0.05)。结论在砷致HaCaT细胞恶性转化过程中, NRF2可以作为自噬重要调节机制PI3K-Akt-mTOR中PI3K-Akt下游、mTOR上游因子, 通过激活mTOR来调控自噬, 而自噬的这一异常表现, 最终可能引起细胞的恶性转化。

前列腺癌Nrf2表达临床意义

目的探讨核转录因子红细胞系-2p45(NF-E2)相关因子2(nuclear factor erythroid-2related factor 2,Nrf2)在良性前列腺增生(benign prostatic hyperplasia,BPH)和前列腺癌(prostate cancer,PCa)组织中的表达及临床意义。方法收集2015-01-10-2016-01-10武汉市第一医院泌尿外科就诊的前列腺癌患者80例,设为前列腺癌组。选择同院同期前列腺增生患者52例,设为对照组。免疫组织化学染色(immunohistochemistry,IHC)检测前列腺癌和前列腺增生组织中Nrf2的表达情况;实时荧光定量PCR(real-time fluorescence quantitative PCR,RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测Nrf2mRNA和蛋白的表达水平;分析前列腺癌患者肿瘤组织中Nrf2的表达与患者年龄、肿瘤大小、血清前列腺特异抗原(prostate specific antigen,PSA)含量、Gleason评分、临床分期、是否淋巴结处转移和是否化疗耐药的关系;培养前列腺癌细胞系DU145,采用siRNA敲减DU145细胞中Nrf2的表达,四甲基偶氮唑盐比色法(MTT)检测细胞对多西他赛(docetaxel,DTX)等化疗药物的敏感性。结果前列腺癌组织中Nrf2mRNA相对表达水平为3.61±1.75,高于前列腺增生组织的1.08±0.78,差异有统计学意义,t=3.669,P=0.003 2;前列腺癌组织中Nrf2蛋白相对表达水平为2.55±1.03,高于前列腺增生组织的0.73±0.54,差异有统计学意义,t=3.513,P=0.005 6。前列腺癌组织Nrf2阳性率为71.25%(57/80)高于前列腺增生组织7.69%(4/52),差异有统计学意义,χ2=51.217,P<0.001。前列腺癌患者肿瘤组织中Nrf2阳性率与血清PSA含量(χ2=19.985,P=0.001)、肿瘤大小(χ2=4.665,P=0.031)、Gleason评分(χ2=9.937,P=0.002)、临床分期(χ2=11.446,P=0.003)和有无淋巴结转移(χ2=6.572,P=0.01)有关联,与患者年龄无关(χ2=1.993,P=0.448)。62例患者进行以DTX为基础的化疗,其中化疗敏感37例,化疗耐药25例。化疗敏感组Nrf2阳性20例,阴性17例,阳性率为54.1%,化疗耐药组Nrf2阳性20例,阴性5例,阳性率为80.0%,两组差异有统计学意义,χ2=4.387,P<0.036。siNrf2组24、48和72hDTX、奥沙利铂和5-氟尿嘧啶(5-FU)的IC50明显低于siCtrl组,差异均有统计学意义,均P<0.01。结论 Nrf2在前列腺癌组织中的表达升高,可能参与前列腺癌的发生发展及化疗耐药的产生,可作为肿瘤治疗的潜在靶点。