雷公藤甲素对非小细胞肺癌细胞系A549增殖的抑制和凋亡的诱导

目的探讨雷公藤甲素(TP)通过调控趋化因子受体4(CXCR4)基因表达对人非小细胞肺癌(A549)细胞增殖和凋亡的影响。方法实验分为4组:对照组、TP组(100 nm/L TP处理细胞)、CXCR4+TP组(转染质粒及TP处理细胞)和NC+TP组(转染空载质粒及TP处理细胞)。RT-qPCR和Western blot检测CXCR4表达以及转染效果;MTT法检测细胞增殖;AnnexinⅤ-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡;Western blot检测增殖及凋亡相关蛋白表达。结果雷公藤甲素能够抑制A549细胞中CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P<0. 05)。雷公藤甲素可抑制A549细胞增殖,诱导其凋亡(P<0. 05)。转染pc DNA-CXCR4能够上调CXCR4 mRNA和蛋白的表达(P<0. 05)。上调CXCR4的表达能够部分逆转雷公藤甲素对A549细胞增殖抑制和凋亡诱导的作用(P<0. 05)。结论雷公藤甲素可能通过下调CXCR4的表达抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡。

rsTRAIL诱导人肺癌细胞系A549的细胞凋亡表达谱变化研究

目的研究一定量的重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡基因表达谱变化。方法用50μg·L^(-1)的rsTRAIL处理人肺癌系A549细胞培养物,以未经药物处理的A549细胞培养物为对照,应用基因表达谱芯片技术进行细胞凋亡相关基因mRNA表达差异分析。结果经TRAIL处理后,所检测的96个细胞凋亡相关基因中,21个基因表达上调,17个基因表达水平下调。结论经TRAIL处理后,通过细胞凋亡相关的功能基因组群基因表达的正负调控,对人肺癌系A549细胞凋亡信号传导途径进行调控。药物处理不影响p53基因的表达变化。

斑蝥酸钠维生素B_6注射液对人肺癌细胞系A549增殖抑制及核因子κB和Caspase3/7的影响

目的探讨斑蝥酸钠(SC)维生素B6注射液对人非小细胞肺癌A549细胞增殖、凋亡及核因子κB(NF-κB)、凋亡分子Caspase3/7的影响。方法用不同浓度(0、1.0、2.5、5.0 mg/L)的SC维生素B6注射液处理A549细胞,观察光镜及Hoechst33342荧光染色检测细胞凋亡形态;用噻唑蓝(MTT)比色法检测SC维生素B6注射液对细胞增殖的抑制作用;罗丹明123检测线粒体膜电位;Caspase3/7活性检测试剂盒检测Caspase3/7活性;蛋白印迹检测NF-κB P65、I-κB蛋白表达。结果 SC维生素B6注射液对A549细胞的体外增殖有明显抑制作用,细胞形态出现明显凋亡改变,5.0 mg/L组作用A549细胞72 h后,细胞增殖抑制率最大达到67.37%。细胞线粒体膜电位检测结果显示,随着SC维生素B6注射液浓度的增加及时间的延长,线粒体膜电位逐渐减弱,同时Caspase3/7蛋白活性增强;SC维生素B6注射液作用A549细胞后NF-κB P65蛋白表达水平显著降低(P<0.05),而I-κB蛋白表达水平则无显著变化。结论 SC维生素B6注射液可能通过抑制NF-κB P65表达,激活Caspase-3/7活性,从而抑制A549细胞增殖,诱导细胞凋亡。

DCLK1激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路促进A549细胞的恶性行为

目的探讨双肾上腺素皮质样激酶1(DCLK1)对A549细胞增殖、迁移、侵袭等恶性生物学行为的影响,并探究可能涉及的相关分子机制。方法慢病毒感染法建立稳定表达DCLK1分子的A549细胞系,反转录-聚合酶链技术和蛋白质印记法进行鉴定。CCK-8与平板克隆实验检测过表达DCLK1后细胞增殖能力变化。Transwell实验观察过表达DCLK1对细胞迁移与侵袭能力的影响。癌症基因组图谱(TCGA)数据库分析DCLK1对肺腺癌细胞的调控富集通路,蛋白质印记法进行验证。结果DCLK1在A549细胞中过表达可增加细胞的增殖、迁移与侵袭等能力,而抑制FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路可削弱DCLK1对A549细胞的恶性调控。结论DCLK1通过激活FAK/PI3K/AKT/mTOR信号通路,促进A549细胞的恶性生物学行为。

A549/DDP耐药肺癌细胞系的建立及其与SP细胞的关系

目的:建立耐顺铂(DDP)人肺癌耐药细胞系A549/DDP,初步探讨耐药细胞与肿瘤SP(sidepopulationcell)细胞的关系。方法:以DDP为诱导剂,采用高浓度反复间歇诱导法诱导建立人肺癌耐药细胞系A549/DDP,用MTT法测定药物敏感性,最后将耐药细胞和亲本细胞分别行Hoechst33342染色,用流式细胞仪检测SP细胞含量。结果:成功建立DDP耐药细胞系A549/DDP,对DDP的耐药指数为5.957;耐药谱分析表明其是一个多药耐药细胞系;Hoechst33342染色分析显示:A549和A549/DDP中SP细胞含量分别为1.09%和0.31%。结论:建立了稳定的人肺癌多药耐药耐药细胞系A549/DDP,耐药细胞中SP细胞含量无明显变化。

LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2对肺间质细胞增殖、迁移及侵袭的作用

目的研究长链非编码RNA FEZ家族锌指1-反义RNA 1(lncRNA FEZF1-AS1)调控zeste同源物增强子2(EZH2)对肺间质细胞增殖、迁移、侵袭能力及上皮细胞-间质转化(EMT)的影响及其作用机制。方法将人肺腺癌细胞系A549分为对照组(control)和模型组[model,用转化生长因子β1(TGF-β1)20 ng/mL作用48 h,诱导成为肺间质细胞]。用Western blot检测细胞中E-钙黏蛋白(E-cadherin)、N-钙黏蛋白(N-cadherin)及波形蛋白(vimentin)的蛋白表达。RT-qPCR检测细胞中lncRNA FEZF1-AS1和EZH2基因表达。转染组细胞分为转染si NC组、si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组和si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZH2组。CCK-8法检测细胞增殖、细胞划痕检测细胞迁移、Transwell小室法检测细胞侵袭;用Western blot检测细胞中E-cadherin、N-cadherin、vimentin及EZH2的蛋白表达,用RNA免疫沉淀(RIP)测定FEZF1-AS1与EZH2的直接结合作用。结果与对照组比较,模型组E-cadherin的蛋白表达水平减少(P<0.05);N-cadherin及vimentin的蛋白表达水平升高(P<0.05);与对照组比较,模型组lncRNA FEZF1-AS1与EZH2基因的表达水平明显升高(P<0.05);与si NC组相比,si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组细胞增殖、迁移、侵袭能力降低,E-cadherin蛋白表达升高,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达降低(P<0.05);与si lncRNA FEZF1-AS1+OE vector组比较,si lncRNA FEZF1-AS1+OE EZHZ组细胞增殖、侵袭、迁移能力升高,E-cadherin蛋白表达降低,N-cadherin、vimentin、EZH2蛋白表达升高(P<0.05);RIP实验进一步证实了lncRNA FEZF1-AS1与EZH2具有结合作用。结论LncRNA FEZF1-AS1通过调控EZH2促进肺间质细胞增殖、侵袭、转移和EMT过程。

流感病毒NS1蛋白稳定表达的A549细胞系建立

A型流感病毒的NS1(Nonstructurol 1 protein,NS1)蛋白是病毒复制、毒力等的重要调节蛋白.运用RT-PCR方法扩增A/Beijing/501/2009(H1N1)流感病毒NS1基因,克隆至真核表达载体pCMV-HA,用Lipofectamine2000将线性化pCMV-HA-NS1与neo基因共同转染A549细胞,通过G418筛选获得阳性重组细胞,并采用PCR、RT-PCR、Western blot技术检测重组细胞中NS1蛋白的表达,通过免疫荧光技术观察NS1蛋白在细胞中的定位.PCR、RT-PCR检测显示NS1基因成功整合进入细胞基因组,并转录为mRNA;Western blot检测显示重组细胞系稳定表达NS1蛋白,免疫荧光显示NS1蛋白定位于细胞核内.表明通过G418筛选,成功构建稳定表达NS1蛋白的重组A549-HA-NS1细胞系,且NS1蛋白定位于细胞核内,为进一步研究NS1蛋白的生物学功能奠定基础.

RBM5基因表达载体构建、稳定转染A549细胞系的建立及功能的初步研究

目的:通过构建表达载体、建立稳定转染RNA结合基序5(RNA binding motif 5,RBM5)的A549细胞系,初步研究RBM5基因过表达对A549细胞增殖以及天冬-谷-丙-组氨酸盒多肽15[DEAH box polypeptide 15,DHX15]表达的影响。方法:应用分段克隆法构建pc DNA3.1(+)/RBM5真核表达载体;将测序验证后的重组质粒pc DNA3.1(+)/RBM5转染肺腺癌A549细胞并以G418进行筛选,采用Western印迹鉴定RBM5基因过表达阳性细胞,流式细胞仪分别检测经pc DNA3.1(+)/RBM5稳定转染的A549细胞[pc DNA3.1(+)/RBM5-A549]及pc DNA3.1(+)空白质粒转染的A549细胞[pc DNA3.1(+)-A549]的周期分布;运用RT-PCR技术分别检测pc DNA3.1(+)/RBM5-A549和pc DNA3.1(+)-A549细胞中剪接相关因子DHX15的表达情况。结果:成功构建出pc DNA3.1(+)/RBM5真核表达载体,筛选出RBM5基因稳定转染过表达阳性细胞株;pc DNA3.1(+)/RBM5-A549较pc DNA3.1(+)-A549细胞处于G1期细胞比例增大、S期细胞比例减小(均P<0.01);c DNA3.1(+)/RBM5-A549较pc DNA3.1(+)-A549细胞的DHX15表达上调(P<0.01)。结论:成功构建重组质粒pc DNA3.1(+)/RBM5,并建立了RBM5稳定转染的A549细胞系;初步证实RBM5基因过表达可抑制肺腺癌A549细胞的细胞周期,并使DHX15表达上调。

无线粒体DNA的人肺腺癌A549细胞系的构建

目的:建立无线粒体DNA(mtDNA)的人肺腺癌ρ~0A549细胞系。方法:在含50 ng/mL溴化乙锭(EB)、100μg/mL丙酮酸钠和50μg/mL尿嘧啶核苷的RPMI1640细胞培养基中传代培养A549细胞;用低剂量EB连续诱导培养35 d后,采用光镜观察、TaqMan探针法实时荧光定量PCR(qPCR)和Western印迹鉴定无mtDNA的ρ~0A549细胞系;采用MTT法测定ρ~0A549细胞增殖曲线。结果:倒置显微镜下野生型ρ^+A549细胞为多角形,ρ~0A549细胞形态呈拉长枝状;qPCR结果显示,低剂量EB诱导35 d的ρ~0A549细胞中无mtDNA的存在。Western印迹结果显示,ρ^+A549细胞中能表达核基因编码的线粒体蛋白SDHA和ATP5A,也能表达线粒体基因组编码的蛋白MT-COXI和MT-ATP6;ρ~0A549细胞中无MT-COXI和MT-ATP6蛋白表达,但核基因编码的SDHA和ATP5A蛋白能够正常表达。MTT结果显示,与ρ^+A549细胞相比,ρ~0A549细胞生长速度明显减慢,差异有统计学意义(P<0.05)。结论:构建和鉴定了无mtDNA的人肺腺癌ρ~0A549细胞系,为后续探讨mtDNA缺失或突变与人肺腺癌发生之间的关系奠定了实验基础。

TTF-1基因过表达慢病毒重组载体的构建及TTF-1过表达A549细胞系的建立

目的构建甲状腺转录因子-1(TTF-1)基因过表达慢病毒重组载体并感染人肺腺癌A549细胞株,建立TTF-1基因过表达的A549细胞系,为进一步研究TTF-1在肺腺癌中的作用机制奠定基础。方法采用PCR拼接TTF-1的cDNA寡核苷酸序列,连入pCDH-CMV-MCS-EF1-CopGFP-T2A-puro,转化至感受态细胞DH-5α,测序鉴定;将携带TTF-1基因的慢病毒过表达载体转染至293T细胞,经包装产生慢病毒,测定病毒滴度,并感染A549细胞,构建稳定表达TTF-1基因的肺腺癌A549细胞系。结果测序结果显示,TTF-1基因过表达慢病毒载体pCDH-CMV-TTF1-EF1-CopGFP-T2A-puro构建成功,测序结果正确;经包装所得病毒上清液滴度为6×107TU/m L,稳定转染的细胞系在荧光显微镜下可见GFP表达; PCR结果显示,A549细胞转染组中TTF-1基因表达量比未转染组提高了381倍。结论成功克隆、扩增TTF-1基因,并建立其慢病毒表达系统,构建了稳定过表达TTF-1基因的人肺腺癌A549细胞系。

miR-1827抑制肺腺癌A549细胞系迁移并调控c-Myc表达的研究

目的探讨miR-1827对肺腺癌A549细胞细胞系迁移功能的影响以及对原癌基因c-Myc是否有调控作用。方法采用生物信息学方法对miR-1827与c-MYC基因mRNA 3'非翻译区(untranslated region,UTR)靶向配对关系进行预测。使用脂质体瞬时转染的方法将miR-1827类似物导入A549肺癌细胞系,使A549过表达miR-1827。Real-Time PCR验证转染后miR-1827以及c-Myc mRNA的表达量。Western blot法检测c-Myc蛋白表达量的变化。细胞划痕实验及Transwell细胞迁移实验检验miR-1827对A549迁移功能的影响。以上均以转染miR-NC序列的A549细胞作为对照。使用双萤光素酶报告基因实验对miR-1827与c-Myc是否存在直接调控关系及具体结合部位进行鉴定。使用GEO数据库的公开芯片数据对miR-1827与肺癌患者的预后之间的关系进行探索。结果在线生物信息学网站Targetscan以及DIANA-LAB显示miR-1827种子序列与c-Myc mRNA 3'UTR区存在完全配对序列。与对照组相比,miR-1827转染组miR-1827表达量显著上调,c-Myc基因mRNA以及蛋白水平均明显下降。双萤光素酶报告基因实验提示miR-1827直接通过与c-Myc mRNA 3'UTR配对结合下调c-Myc的表达。miR-1827可以显著抑制A549的迁移功能。芯片GSE63805显示miR-1827高表达组8年总生存率为56.25%,显著优于miR-1827低表达组的12.5%。结论 miR-1827能调控原癌基因c-Myc的表达并抑制A549细胞迁移。

肺腺癌A549细胞抗失巢凋亡相关基因的确认及C8orf4基因的表达

目的:比较抗失巢凋亡及正常贴壁生长肺腺癌A549细胞基因组表达差异,从中筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因,并探讨C8orf4基因的高表达及其对失巢凋亡的正性调剂作用意义。方法:建立抗失巢凋亡肺癌A549细胞系;用基因芯片技术检测其与正常贴壁生长A549细胞的差异基因,利用NCBI Pubmed数据库筛选出肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,找出差异表达倍数最大的基因,运用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)技术及蛋白质印迹技术测定其表达。结果:共检测到表达差异的基因745个,筛选出63个与肺癌细胞抗失巢凋亡相关的基因,C8orf4基因差异表达倍数最大,在脱落培养A549细胞中C8orF4基因及其编码蛋白表达明显高于贴壁培养A549细胞,P<0.02。结论:基因芯片技术为筛选肺癌抗失巢凋亡相关基因提供了有效方法,C8ORF4基因可能参与调控肺癌细胞抗失巢凋亡过程。

U0126、SB203580、PD98059、LY294002对体外缺氧状态下A549细胞侵袭力的影响

目的探讨U0126、SB203580、PD98059和LY294002对体外缺氧状态下人肺癌细胞A549侵袭力的影响。方法由DFOM建立缺氧环境,U0126、SB203580、PD98059和LY294002处理A549细胞,采用细胞培养、BD细胞培养小室、Giemsa染色和免疫细胞化学染色等方法,检测细胞侵袭力的变化和E-cadherin蛋白的表达。结果A549细胞在缺氧状态下高侵袭力24h后即受到抑制剂明显抑制,其中以PD98059的作用最显著;E-cadherin蛋白的表达也明显上调。结论U0126、SB203580、PD98059和LY294002具有抗肿瘤侵袭的作用,具体机制有待于进一步研究。

回生口服液药物血清对人肺癌A549细胞增殖及周期的影响

目的观察回生口服液药物血清对人肺癌细胞A549增殖及周期的影响。方法大鼠灌胃制备回生口服液药物血清,采用MTT法观察药物血清干预24、48、72 h后对细胞增殖的作用(分为空白组及药物血清高、中、低剂量组);采用流式细胞检测分析药物血清干预24h对细胞周期的影响(分为空白组、空白组及药物血清高、中、低剂量组)。结果各药物血清组与空白组之间的吸光度差异有统计学意义(P<0.05),随着作用时间的延长,其吸光度逐渐降低,抑制率逐渐增高(P<0.05)。药物血清组细胞周期G1期增多,G2期及S期减少。结论益气化瘀养阴解毒方对肺癌细胞具有抑制作用,可能与其抑制细胞分裂有关。

PEI/ASON纳米组装体对肺腺癌A549细胞增殖活性及其hTERT基因表达的影响

目的以聚乙烯亚胺多聚阳离子纳米载体(polyethylenimine,PEI)作为端粒酶逆转录酶(human telomerasereverse transcriptase,hTERT)反义寡核苷酸(antisense oligodeoxynucleotide,ASODN)载体转染A549细胞,研究其对A549细胞的增殖活性及hTERT mRNA表达的影响。方法采用MTT法检测PEI/ASODN纳米组装体对细胞的增殖作用情况;激光共聚焦显微镜检测5'-FITC标记的ASODN(FASODN)转染细胞后PEI/FASODN纳米组装体的细胞摄入情况;RT-PCR检测转染后hTERT mRNA的表达;免疫细胞化学技术检测端粒酶hTERT蛋白的表达;流式细胞术Annexin-V-FITC和PI双标法检测细胞凋亡情况;PEI/ASON-PEG-CNGR组装体动物体内分布实验观察NGR的肿瘤靶向作用。结果 PEI/ASODN纳米组装体转染细胞后产生良好的生长抑制作用;FASODN转染细胞后,PEI/FASODN组细胞内有大量荧光物质,而单纯FASODN组细胞内无明显荧光;RT-PCR检测结果表明PEI/ASODN纳米组装体作用于A549细胞72 h时,hTERTmRNA水平明显降低,与空白对照组相比有显著差异(P<0.05);细胞hTERT蛋白的表达也显著降低;转染72 h后PEI/ASODN组出现明显早期凋亡和晚期凋亡,凋亡率分别为36.53%和54.28%;动物体内分布实验表明PEI/ASON-PEG-CNGR具有良好的肿瘤靶向作用。结论 PEI介导的hTERT ASODN能有效抑制A549细胞增殖,降低hTERT mRNA水平从而抑制hTERT蛋白的表达,使细胞产生凋亡,对该细胞生长有明显抑制作用。

OSAS模式IH对肺癌细胞系YAP以及P-YAP表达的影响

目的探讨阻塞性睡眠呼吸暂停综合征(OSAS)模式间歇低氧(IH)对肺癌细胞系A549细胞YES相关蛋白(YAP)及磷酸化YAP(P-YAP)表达的影响。方法 IH分别处理A549细胞1 h、3 h、6 h(IH1组、IH3组、IH6组),IH频率为:5%O2300 s,21%O2300 s,并设置常氧对照组(N组)。q RT-PCR检测YAP m RNA表达;Western blot检测YAP及P-YAP蛋白表达。结果 IH1组(2.50±0.18)、IH3组(4.07±0.25)、IH6组(9.18±0.58)YAP m RNA的相对表达量显著高于N组(1.00±0.01),差异有统计学意义(均P<0.05),IH1组、IH3组、IH6组YAP蛋白的表达量较N组上调,并随暴露时间增加而上调;IH1组、IH3组、IH6组P-YAP蛋白的表达量较N组下调,并随暴露时间增加而下调。结论 YAP信号通路可能在OSAS模式IH促进肿瘤发生发展的过程中起重要的调控作用。

人肺腺癌A_(549)多重抗药细胞株生物学特性变化

目的：探讨人肺腺癌Ａ５４９多重抗药细胞株生物学特性变化。方法：采用阿霉素（ＡＤＭ）浓度递增的方法诱导人肺腺癌Ａ５４９细胞系（Ａ５４９／Ｐ），在体外持续培养６个月，获得了具有多重抗药性的Ａ５４９／Ｒ２细胞，该细胞能在０．２μｇ／ｍｌＡＤＭ下持续增殖。通过光镜和电镜观察其增殖及形态结构变化。结果：Ａ５４９／Ｒ２细胞由巨大细胞增殖而来，其微绒毛、线粒体及分泌泡明显增加，有进一步分化趋向。结论：Ａ５４９／Ｒ２细胞的进一步分化特征可能与其抗药性形成有关。

三氧化二砷诱导A_(549)^(DDP)细胞株耐药基因表达的研究

目的：探讨三氧化二砷(As2O3）的耐药机制。方法：用四甲基偶氮唑蓝(MTT）法检测A_(549)^(DDP)细胞对As_2O_3的耐药性，用逆转录聚合酶链反应(RT－PCR）技术检测As_2O_3处理后A_(549)^(DDP) 细胞多药耐药基因(mdr1）及多药耐药相关蛋白(MRP）基因表达。结果：A_(549)^(DDP) 细胞对As_2O_3具有交叉耐药性。A_(549)和A_(549)^(DDP) 细胞中mdr1基因低表达，MRP基因呈较高水平表达。结论：A_(549)^(DDP) 细胞中MRP基因过度表达可能是As_2O_3耐药的主要机制之一。

重组TRAIL诱导肺腺癌细胞系细胞凋亡的实验研究

目的研究重组可溶性TRAIL作用于人肺癌系A549细胞培养物后,细胞凋亡的形态变化和凋亡率测定。方法MTT比色法测定重组TRAIL对肺腺癌A549细胞的生长抑制率。TRAIL处理前后细胞核、质的形态学变化。经不同浓度重组TRAIL处理后A549细胞的双色荧光变化。定量重组TRAIL与亚毒性浓度的CDDP联合使用,对肺腺癌A549细胞生长抑制率和凋亡率的影响。结果重组TRAIL对A549细胞生长有明显的抑制作用,TRAIL100μg.L-1作用24h后,抑制率达到41.6%。细胞形态学观察显示,A549肺腺癌细胞经50μg.L-1TRAIL处理24h后,可观察到典型的细胞凋亡特点。3.3mg.L-1的CDDP与50μg.L-1重组TRAIL合用,A549细胞凋亡率高达75.2%。结论重组TRAIL具有明显的诱导多种恶性肿瘤细胞凋亡的作用;化疗药物CDDP能加强重组TRAIL的抗肿瘤活性。