喉鳞状细胞癌Hep-2细胞系常规及高分辨染色体分析

目的 :探讨喉鳞状细胞癌 Hep- 2细胞系染色体畸变及其核型特征 ,认识喉癌的细胞遗传学改变与其发病机制的相关性。方法 :应用常规和高分辨 G显带方法进行核型分析。结果 :Hep- 2细胞系的染色体数目变化于 5 4～ 84条之间 ,众数为 6 9～ 74条。可识别其结构的稳定的标记染色体为 13条 ,部分核型中存在双微体 ,是基因扩增的细胞遗传学标志。结论 :喉癌 Hep- 2细胞系属超三倍体细胞 ,存在染色体数目和结构畸变并具有稳定的标记染色体及基因扩增。结构畸变涉及易位、缺失和等臂染色体。染色体断裂重接导致染色体重排 ,3、5、6和

GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE-2Z中的表达

目的 观察GFP报道基因在鼻咽癌细胞系CNE 2Z中的表达。方法 将带有GFP报道基因的载体质粒pPAT GFP和 3种带有GFP报道基因及目的基因抗端粒酶核酶基因teloRZ的不同质粒 pGFPuro teloRZ 2 .1、pGFPuro teloRZ 7.1、pGFPuro teloRZ 7.7,转染到鼻咽癌CNE 2Z细胞系中 ,用荧光显微镜及流式细胞仪检测转染细胞在固定后的活细胞中GFP基因的表达情况。结果 GFP基因在活细胞中有表达 ,而在固定后无表达 ,且目的基因的插入影响GFP基因的表达。结论 GFP基因在转染了含目的基因质粒的鼻咽癌CNE 2Z细胞中稳定表达 ,可以在CNE

人喉上皮细胞癌细胞系Hep-2高分子DNA的提取及检测

本实验分別提取了三批Hep-2细胞高分子DNA,并用紫外分光光度计测定其纯度和含量,用琼脂糖凝胶电泳检测.在提取过程中,用化学方法代替RNA酶水解RNA,结果在DNA琼脂糖凝胶电泳图上未见RNA区带.

新型平阳霉素杀伤喉癌细胞系Hep-2细胞的体外实验研究

The cytotoxic effect of Pingyangmycin (PYM) (Bleomycin A5) on the laryngeal cancer Hep 2 line in vitro was observed with two experimental methods of MTT colorimetric assay and living cell count.Results:(1) The PYM value of IC50 (index of light density of PYM inhibited Hep 2 cell line) was 35μg/ml by MTT colorime tric assay.It showed that the proliferation activity of Hep 2 cell was inhibited strongly when the concentration of PYM increased.(2) The assay of living cell count showed that the livability of the Hep 2 was 46% when the concetration of the PYM in 30μg/ml.In our study,it was found that the PYM could induce the apoptosis effect of the Hep 2 cell in a certain range.

粉防己碱对喉癌耐药细胞株Hep-2／ADM多药耐药逆转作用研究

目的探讨天然有效成分粉防己碱(tetrandrine,TET)对喉癌耐药细胞株Hep-2/ADM的多药耐药逆转作用及其可能机制。方法采用MTT法检测不同浓度粉防己碱对Hep-2/ADM细胞的增殖抑制效应,选取其无毒剂量;MTT法检测长春新碱(vincristine,VCR)对HEP-2和Hep-2/ADM细胞增殖的抑制作用及加用粉防己碱后的变化;采用流式细胞仪检测细胞内药物蓄积和外排程度以及细胞凋亡。结果1.5μg/ml及更低浓度的粉防己碱对Hep-2/ADM细胞无明显细胞毒性作用。加入1.0μg/ml和1.5μg/ml粉防己碱后,Hep-2/ADM对VCR的耐药逆转倍数分别为1.72和2倍。1.5μg/ml浓度的粉防己碱可提高VCR在Hep-2/ADM细胞内药物的蓄积,增强VCR诱导的Hep-2/ADM细胞凋亡。结论粉防己碱可以部分逆转Hep-2/ADM细胞的多药耐药,随药物浓度增加,逆转效果有可能增强,其逆转机制可能与抑制P糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)外排功能和增强化疗药物诱导的细胞凋亡有关。

CD133基因启动子调控增强型绿色荧光蛋白基因在喉癌Hep-2细胞中的表达

目的:构建人CD133基因启动子启动加强型绿色荧光蛋白(eGFP)基因表达载体,观察在喉癌Hep-2细胞系中人CD133基因启动子启动eGFP基因表达能力,为应用CD133基因启动子调控靶向肿瘤干细胞(CSCs)基因治疗奠定实验基础。方法:采用PCR方法从人外周血基因组中克隆人CD133基因启动子,通过基因重组技术将人CD133基因启动子克隆入慢病毒基因转移载体pWPXLd-eGFP中,构建人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体,PCR以及酶切鉴定构建载体的正确性。应用脂质体介导该载体转染入Hep-2细胞中,细胞分为空白对照组(未转染质粒)、阳性对照组(转染pWPXLd)和实验组(转染pWPXLd-eGFP-CD133)。应用荧光显微镜观察各组eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。结果:PCR法获得了约1 810bp大小的CD133基因启动子片段;酶切与PCR鉴定,成功构建了人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体。荧光显微镜下,阳性对照组和实验组转染的Hep-2细胞株有eGFP的表达,而空白组对照组的Hep-2细胞内无eGFP的表达。结论:构建的人CD133基因启动子启动eGFP基因表达载体可以调控eGFP基因在喉癌Hep-2细胞内的表达。

血卟啉衍生物光动力学疗法体外杀伤人喉癌细胞株Hep-2的实验研究

目的 :探讨使用血卟啉衍生物对喉癌细胞进行光动力学治疗的有效照光时间和有效药物使用量。方法 :使用波长 6 30nm的激光照射同血卟啉衍生物共同培养的喉癌Hep - 2细胞株 ,用MTT法评价不同的用药浓度(0 μg、5 μg、10 μg、5 0 μg、10 0 μg、2 0 0 μg ml)和不同的光照能量密度 (10J cm2 、2 0J cm2 、30J cm2 、4 0J cm2 、5 0J cm2 )细胞毒的作用。结果 :随着药物浓度的增加细胞的死亡率增加 ,但是在 5 0 μg ml以上增加不明显。随着光密度的增加细胞的死亡率增加 ,在 4 0J cm2 以后死亡率没有明显的增加。结论 :血卟啉衍生物在 6 30nm的激光照射下能够有效的在体外杀伤肿瘤细胞 。

高能X线诱导喉癌Hep-2细胞凋亡及相关基因的表达研究

目的:研究高能X线诱导人喉癌细胞株Hep-2凋亡的作用及其分子机制。方法:采用不同剂量的高能X线作用于Hep-2细胞株,流式细胞仪检测其凋亡率。Western blot和RT-PCR方法检测细胞的BCL-2和BAX蛋白及mRNA转录水平。结果:在一定范围内,随着剂量的增加和时间的延长,细胞凋亡率基本呈增加趋势。Western blot和RT-PCR结果显示辐射后BCL-2表达下调,而BAX无明显改变,BCL-2/BAX的比值明显降低。结论:高能X线诱导的Hep-2细胞凋亡具有时间剂量依赖性。BCL-2和BAX参与了辐射诱导的Hep-2细胞凋亡,BCL-2抑制细胞凋亡可能是Hep-2细胞恶性增殖的主要原因之一。

白莪星注射液诱导Hep-2细胞凋亡的实验研究

目的 观察自拟白莪星注射液诱导癌细胞系Hep - 2细胞凋亡的抑制Hep - 2细胞体外生长的效应 ,为临床应用与新药开发奠定实验基础。方法 将原液稀释为 10倍、10 0倍、10 0 0倍、1× 10 4倍、1× 10 5倍、1× 10 6倍 ,加入Hep - 2细胞培养 ,MTT法检测细胞生长情况 ,TUNEL法标记细胞流式细胞仪测定凋亡率。结果 稀释 10 0倍、10 0 0倍和 1× 10 4倍的白莪星注射液在第 3天和第 5天抑制Hep - 2细胞生长 ;稀释 10 0倍和 10 0 0倍的白莪星注射液可以促进Hep - 2细胞的凋亡 (P<0 0 5 )。结论 白莪星注射液具有明显抑制体外培养喉癌细胞系Hep - 2细胞生长增殖的作用 ,其作用机制可能与白莪星注射液能诱导喉癌细胞系Hep - 2细胞发生显著凋亡的作用有关。

冈田酸对喉鳞癌细胞系PP2A活性及迁移的影响

目的:探讨冈田酸(OA)对喉鳞癌细胞系(Hep-2)活性和迁移能力的影响及其可能的作用机制。方法:采用四甲基噻唑蓝(MTT)比色实验确定OA作用于Hep-2的最大浓度;酶活性实验检测不同浓度(0、50、100 n mol/L)OA对Hep-2蛋白磷酸酶2A(PP2A)活性的影响;划痕实验检测Hep-2在不同浓度(0、50、100 nmol/L)OA作用下迁移能力的变化。结果:50、100、200 nmol/L OA作用24 h后Hep-2的相对活力分别为96.7%±1.8%、82.9%±12.6%和57.2%±7.7%,与对照组(100%)比较均明显下降(P均<0.05)。50和100 nmol/L OA作用24 h后PP2A的相对活性分别为30.90%±12.01%和8.98%±4.96%,与对照组(100%)相比明显下降(P<0.05)。划痕试验中,经OA作用24及48 h后Hep-2细胞的迁移能力与对照组相比均明显减弱(P<0.05),并且100 nmol/L OA处理组迁移能力的减弱程度较50nmol/L OA处理组更明显(P<0.05)。结论:100 n mol/L冈田酸明显抑制Hep-2细胞PP2A活性并降低了细胞的迁移能力。

血卟啉衍生物光动力学疗法体外杀伤人喉癌细胞株Hep-2的实验研究

目的探讨使用血卟啉衍生物对喉癌细胞进行光动力学治疗的有效照光时间和有效药物使用量。方法使用波长630nm的激光照射同血卟啉衍生物共同培养的喉癌Hep-2细胞株,使用MTT法评价不同的用药浓度(0、5、10、50、100和200μg/mL)和不同的光照能量密度(10、20、30、40和50J/cm2)细胞毒的作用。结果随着药物浓度的增加细胞的死亡率增加,但是在100μg/mL以上增加不明显。随着光密度的增加细胞的死亡率增加,在40J/cm2以后死亡率没有明显的增加。结论血卟啉衍生物在630nm的激光照射下能够有效地在体外杀伤肿瘤细胞,其杀伤的最佳效果与用药浓度和照射能量有关。

5-杂氮-2’-脱氧胞苷抑制人喉癌细胞生长机制的研究

目的观察5-杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系生长增殖的影响,探讨其抗肿瘤效应及可能的机制。方法用5- 杂氮-2’-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌细胞系处理后,甲基化特异性PCR(MSP),T-A克隆测序分析死亡相关蛋白激酶(death-associ- ated protein kinase,DAPK)基因甲基化状态,逆转录聚合酶链反应、免疫细胞化学、流式细胞仪检测用药前后DAPK mRNA和蛋白的表达情况及细胞凋亡和周期的变化。结果未经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理的Hep-2细胞中DAPK基因CpG岛甲基化,且 DAPK mRNA不表达。经5-杂氮-2’-脱氧胞苷处理后,甲基化的DAPK基因部分去甲基化,大于或等于10-7 mol·L-1组的细胞中有DAPK mRNA表达,且表达随浓度增高而增强。免疫细胞化学染色显示,经处理后的肿瘤细胞DAPK蛋白表达呈阳性,而对照组不表达。流式分析结果为处理后凋亡率明显增加,且G1期细胞增加,G2／M期减少。结论 5-杂氮-2’-脱氧胞苷能抑制喉癌细胞的生长和增殖,可能的机制是其能使因甲基化而失活的DAPK基因再转录,诱导该基因的重新表达。

MicroRNA-25在喉鳞癌细胞侵袭转移中的作用探讨

背景导致喉癌患者死亡的主要原因是复发和转移,喉癌侵袭转移的分子机制已成为当前研究的重点。目的研究microRNA-25(miR-25)在喉鳞癌Hep-2细胞体外侵袭转移中的调控作用。方法应用微小RNA过表达载体(mimic)和抑制载体(inhibitor)转染Hep-2细胞,分别增加和抑制Hep-2细胞中miR-25的表达,Transwell法和细胞划痕实验检测Hep-2细胞侵袭迁移能力的变化,MTT法检测细胞增殖能力变化,绘制细胞生长曲线。结果上调Hep-2细胞中miR-25表达后,Transwell实验和细胞划痕实验显示Hep-2细胞的体外侵袭和迁移能力显著低于正常对照组(P<0.01),MTT检测结果显示过表达miR-25组Hep-2细胞增殖能力亦显著降低。而抑制miR-25表达后,Hep-2细胞体外侵袭、迁移和增殖能力均显著增强。结论miR-25的表达量显著影响喉鳞癌Hep-2细胞体外侵袭、迁移和增殖能力,提示miR-25可能是抑制喉鳞癌转移的一个有效靶点。

丝裂霉素C诱导喉癌细胞凋亡及其对Bcl-2基因表达的影响

目的探讨药物体外诱导喉癌细胞凋亡及其相关基因的作用。方法丝裂霉素(MMC)处理喉癌细胞系Hep-2细胞,观察喉癌细胞的形态学改变,琼脂糖电泳检测DNA片断;免疫组化法检测Bcl-2基因表达。结果2×10-2g/LMMC作用24h后,可见细胞浓缩,核固缩,染色质浓聚等;出现DNAladder;12h后,Bcl-2蛋白表达量明显增加。结论MMC诱导喉癌细胞凋亡,MMC可能由于上调了Bcl-2蛋白的表达而减弱了自身对喉癌细胞的诱导凋亡。

乙醛脱氢酶1作为喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞标志物的实验研究

目的探讨乙醛脱氢酶1（ALDH1）在人喉癌Hep-2细胞系中的表达，观察ALDH1高表达细胞的体外生长特性，确定喉癌Hep-2细胞系肿瘤干细胞标志物。方法采用荧光细胞化学染色和流式细胞术观察和检测喉癌Hep-2细胞系中的ALDH1的表达。采用流式分选术分离ALDHI高表达细胞，以四甲基偶氮唑蓝（MTT）法观察ALDH1不同亚群细胞的体外增殖能力，以流式细胞术检测ALDH1高表达细胞的体外分化能力。采用裸鼠成瘤实验比较不同亚群细胞的成瘤能力。结果喉癌Hep-2细胞系中ALDH1呈不同程度的表达，其中ALDHI高表达细胞占2．9％±0．6％。ALDH1高表达细胞的体外增殖能力高于ALDH1低表达和未分选细胞。在含血清的培养液中，经过6d培养，ALDH1高表达细胞由最初分选后的94．2％±3．8％下降至分选前水平。ALDH1高表达细胞的成瘤能力显著高于其他亚群。结论喉癌Hep-2细胞系中，ALDH1高表达细胞具有很强的体外分化能力、增殖能力和成瘤能力，可以作为Hep-2细胞系肿瘤干细胞的标志物之一。

5-杂氮-2'-脱氧胞苷抑制人喉癌裸鼠移植瘤的机制探讨

目的:探讨5-杂氮-2′-脱氧胞苷对Hep-2人喉癌裸鼠移植瘤生长的影响,寻找喉癌治疗的新靶点。方法:建立喉癌裸鼠移植瘤模型,用5-杂氮-2′-脱氧胞苷处理裸鼠,观察移植瘤的生长情况并绘制其生长曲线。用RT-PCR和免疫组织化学技术检测死亡相关蛋白激酶(Death-associatedproteinkinaseDAPK)基因mRNA及蛋白表达的变化。结果:5-杂氮-2′-脱氧胞苷对人喉癌裸鼠移植瘤处理后用药组和对照组之间裸鼠的体重无明显差异(t=0.011,P>0.05),而移植瘤的体积用药组较对照组明显减小,统计学差异有显著性(t=10.11,P<0.01)。在喉癌移植瘤组织中,对照组DAPK均不表达,而用药组出现表达。结论:5-杂氮-2′-脱氧胞苷在体内能使因甲基化而失活的抑癌基因再转录,诱导其表达,进而抑制喉癌移植瘤的生长。

人喉癌细胞系Hep-2中CD133阳性肿瘤干细胞的分离及意义

目的:研究喉癌细胞系Hep-2中CD133的表达;比较CD133^+细胞、未分选细胞、CD133^-细胞的体外增殖、克隆形成能力及其在裸鼠体内的成瘤能力;探讨喉癌肝细胞对化疗药物顺铂(cisplatin,DDP)的抵抗作用。方法:采用流式细胞仪检测CD133在Hep-2细胞系中的表达;免疫磁珠分选技术纯化CD133阳性肿瘤细胞;使用四甲基偶氮唑蓝(MTT)法和平板克隆形成实验检测分选所得各细胞亚群细胞以及未分选细胞的体外增殖能力和克隆形成能力;将CD133阳性肿瘤细胞和CD133阴性肿瘤细胞以一定的数量级注入重症联合免疫缺陷小鼠腹部皮下,比较其成瘤差异性;此外,使用DDP干预分选所得各细胞亚群细胞,检测比较CD133阳性肿瘤细胞和CD133阴性肿瘤细胞的体外增殖能力与体内成瘤能力。结果:流式细胞仪示CD133在Hep-2细胞系中呈微量恒定表达,表达概率为40.12±1.32%;CD133阳性肿瘤细胞的体外增殖能力显著强于CD133阴性肿瘤细胞的增殖能力(P<0.05),且其克隆形成能力也强于CD133阴性肿瘤细胞;体内成瘤实验结果显示CD133阳性肿瘤细胞较CD133阴性细胞、未分选细胞在重症联合免疫缺陷小鼠体内具有更强的成瘤性(P<0.05);在DDP的干预下,相对于CD133阴性肿瘤细胞,CD133阳性肿瘤细胞表现出更强的抵抗力。结论:喉癌Hep-2细胞系中,CD133阳性癌细胞具有强的体外增殖能力、体内成瘤能力且对化疗药物具有较强的抵抗性,可作为喉癌肿瘤干细胞的标志之一。

人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系探讨

目的 探讨人喉鳞癌细胞端粒长度与放射敏感性的关系,以寻求能够预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物。方法 体外长期传代的人喉鳞癌细胞系Hep 2 经0、2、4、8、12Gy剂量照射3 次后的存活后代体外培养20代,以克隆形成实验测定其放射敏感性参数SF2,用Southern blotting法测定其端粒长度(TRF)。结果 体外长期传代的Hep 2 细胞系随着受照剂量的增加, 其放射存活后代的SF2逐渐升高(P<0.05),其TRF逐渐缩短(P<0.01);而且,SF2与TRF呈现明显的正相关关系(r=0.921,P<0.01)。结论 通过不同放射剂量处理体外长期传代的人喉鳞癌细胞系可获得不同放射敏感性的细胞存活后代,且放射存活后代的放射敏感性与其细胞端粒长度具有较好的负相关关系,提示端粒长度检测有望成为预测肿瘤细胞内在放射敏感性的分子标志物。

肾上腺髓质素对于喉癌细胞的增殖作用

目的观察肾上腺髓质素(adrenomedullin,ADM)对于喉癌细胞系Hep-2的促进增殖作用。方法采用氚胸腺嘧啶(H3-thymidine,H3-TDR)掺入方法观察不同药物作用下ADM对于喉癌细胞系Hep-2增殖的影响。结果在ADM浓度为1×10-10、1×10-9、1×10-8mol/L时均可以显著促进Hep-2细胞增殖(t=-2654.8、P<0.01,t=-1732.3、P<0.01和t=-836.5、P<0.01),三组浓度的ADM促进Hep-2增殖作用差别有显著性(F=18.5,P<0.01),且有剂量依赖性(r=0.9996,P<0.01)。加入ADM受体阻断剂ADM(22-52)Hep-2细胞的H3-TDR掺入量与单纯ADM孵育组掺入量差别有显著(t=2721.5,P>0.05)。Hep-2细胞经ADM孵育后分别加入丝裂素活化蛋白激酶/细胞外信号调节激酶(mitogen-acti-vatedproteinkinase/extracellularsignal-regulatedkinase,MAPK/MEK)阻断剂PD098059、蛋白激酶A(proteinkinaseA,PKA)阻断剂H-89、H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组掺入量差别有显著意义(t=2723.8,P<0.01、t=2095.2,P<0.01〉;但加入P38MAPK通路阻断剂SB202190后,H3-TDR掺入量与单纯ADM刺激组差别无显著性。(t=121.83,P>0.05)。结论肾上腺髓质素对于喉癌细胞Hep-2的增殖有促进作用,阻断ADM受体后Hep-2细胞生长受抑制,ADM促进Hep-2细胞生长信号可以通过MEK、PKA通路起作用,未发现p38MAPK参与该作用。

人喉鳞癌细胞端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性的关系

背景与目的:肿瘤细胞的端粒长度、端粒酶活性与其增殖能力和恶性程度关系密切,而且端粒和端粒酶还可能参与放射诱导的DNA损伤的修复;由此推测肿瘤细胞的端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性之间可能存在联系。本研究旨在探讨人喉鳞癌细胞端粒长度、端粒酶活性与放射敏感性的关系。方法:体外长期传代的人喉鳞癌细胞系Hep鄄2经0、2、4、8、12Gy剂量照射3次后的存活后代体外培养20代,以克隆形成实验测定其放射敏感性参数SF2,Southernblot法测定其端粒长度(meanlengthoftelomererestrictionfragments,TRF),TRAP鄄ELISA法测定其端粒酶活性(telomeraseactivity,TA)。结果:人喉鳞癌细胞不同放射剂量存活后代的SF2:0.47～0.64,TRF:3.76～9.43kb,TA:2.606～1.761,且它们各自的SF2、TRF、TA存在差异(P均<0.05);而且,SF2与TRF呈现明显的正相关(r=0.921,P<0.01),SF2与TA呈现明显的负相关(r=-0.929,P<0.01),TRF与TA呈现明显的负相关(r=-0.944,P<0.01)。结论:人喉鳞癌细胞接受不同放射剂量存活后代的放射敏感性与其端粒长度和端粒酶活性具有一定的相关性,提示端粒长度与端粒酶活性检测对预测肿瘤细胞放射敏感性有一定意义。