细胞组织分离培养技术在高产优质北虫草新菌株选育中的应用

北虫草是天然冬虫夏草的理想代用品,具有很高的药用价值,近年来对其进行高产优质菌株选育日渐成为人工栽培工作的重要内容。实际研究中,积极地对相关的培养基成分以及栽培原料进行选用,以提高菌株量及其生物转化率至关重要。本次研究利用细胞组织分离培养技术进行高产优质北虫草新菌株选育,进行相应的培养基配方设计分析。经研究发现,在利用一定配方的培养基进行培养之后,可用于生产的新菌株具有菌丝粗壮、挺立、见光后转色快等特点。另外,联合使用一定的营养液可以达到较高的产量以及较高的生物转化率。除此之外,在培养过程中通过在培养基添加牛鞭等中药,可以有效提高北虫草的营养成份。

小鼠原代肝细胞的分离培养及体外脂肪变性模型构建方法的优化

目的优化改进原代肝细胞分离培养方法并建立肝脂肪变性(hepatic steatosis)的细胞模型,以提升实验效率与准确性。方法在原代肝细胞培养及已有的脂肪变性模型上进行优化,对逆向灌注插管及固定方式进行细化,精确小鼠肝脏灌注消化的速度与时间,并在撕去肝脏包膜及过滤过程中应用含2%胎牛血清(FBS)的培养基;探索诱导脂肪变性细胞模型选用的游离脂肪酸种类、浓度与比例,精确诱导时间。结果所得小鼠原代肝细胞存活率达90%以上,量足、形态好、状态佳;所构建的脂肪变性细胞模型胞质内脂滴明显、糖脂代谢能力下降,并表现出轻度炎性反应及胰岛素抵抗状态。结论优化完善的技术手段,帮助得到稳定且模拟活体生理状态的脂肪变性细胞模型。

高纯度分离子宫内膜腺上皮及间质细胞和体外培养技术

【目的】探索一种简便、高纯度分离在位子宫内膜腺上皮细胞和间质细胞的方法,建立高纯度体外子宫内膜细胞培养模型。【方法】选择正常的新鲜子宫内膜组织20例,通过酶解,过滤及贴壁纯化等技术,每例均用Ryan方法(对照组)及改良的新方法(改良组)分离、纯化及培养子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞,并进行传代。【结果】18例标本获得成功,对照组分离的间质细胞纯度为(84.22±5.17)%,腺上皮细胞纯度为(62.11±6.23)%;改良组分离的间质细胞纯度达(97.89±0.96)%,腺上皮细胞纯度(95.12±2.11)%,与对照组比较,差异有显著性意义(P<0.01)。【结论】改良方法简便,可高纯度分离子宫内膜腺上皮细胞及间质细胞。在体外建立高纯度子宫内膜细胞培养模型,更利于在细胞和分子水平上研究子宫内膜的各种功能及干预调节。

骨髓神经组织定向干细胞的分离培养鉴定

目的:为临床中枢神经系统疾患的细胞移植及组织工程修复周围神经提供一种应用广泛、可来源于自体、无免疫排斥和伦理道德等问题的移植用种子细胞。方法:采用DMEM/F12(1∶1)无血清神经干细胞培养液,通过先贴壁、后悬浮的方法从大鼠骨髓中分离、培养单克隆生长的神经组织定向干细胞(neural tissue-committed stem cells,NTC-SCs),通过免疫细胞化学检测NTCSCs细胞球CXCR4和Nestin蛋白,以及细胞球自然分化后神经元β-TublinⅢ、MAP2ab以及神经胶质细胞CNPase、GFAP等蛋白的表达。结果:NTCSCs细胞球表达神经干细胞标志蛋白Nestin和组织定向干细胞标志蛋白CXCR4;NTCSCs细胞球在含15%胎牛血清的DMEM培养液中可自然分化,免疫荧光显示神经元和神经胶质蛋白β-TublinⅢ、MAP2ab、CNPase、GFAP等标志物阳性。结论:本研究提供了一种操作简便、成本低廉的NTCSCs的分离培养方法,NTCSCs作为种子细胞为脑、脊髓等神经系统疾患和创伤的修复和治疗提供了广阔的应用前景。

原代肝细胞分离培养技术现状及展望

原代肝细胞的分离和培养是建立体外HBV感染的细胞模型和临床应用生物人工肝的关键步骤,许多学者对肝细胞分离和培养技术做了大量探索.本文就近年来建立的各种肝细胞分离技术和培养技术的优缺点进行比较,并对该领域今后的发展前景作了展望.

大鼠胎心细胞的分离培养技术

目的 介绍一套高效率的大鼠胎心细胞的分离培养方法和应注意的事项。方法 无菌条件下取胎心 ,经酶解消化法分离胎心细胞 ,通过差速贴壁和添加Brdu来提高胎心细胞纯度。结果 培养的心肌细胞的纯度可达94% ,活细胞数 >85 % ,形态典型 ,可同步自律搏动达 2～ 3周。结论 该方法可为实验研究提供纯度高、活细胞数较多。

微生物检验过程中微滤膜分离技术的应用价值

目的探讨微生物检验过程中微滤膜分离技术的应用价值。方法以2022年1月—2023年6月济南市疾病预防控制中心接收的86份微生物待检样本为研究对象。从每份待检样本中各取10 mL以平板计数法进行微生物检验,另各取10 mL基于微滤膜分离技术获取菌细胞进行微生物检验。比较2种检验方法的微生物检出率、微生物检验出报告时间与活菌回收率,评价检验效果。结果2种方法共检出阳性样本47份,其中微滤膜分离技术检出45份,占比为95.74%,平板计数法检出阳性样本47份,占比为100%。2种方法的初检86份样本的阳性检出率比较,差异无统计学意义(P>0.05);基于复检结果,微滤膜分离技术初诊漏检2例,2种方法的复检阳性率与漏检率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。微滤膜分离技术的平均培养时间(20.24±3.17)h,短于平板计数法的(32.75±4.36)h,差异有统计学意义(P<0.05)。随机抽样回收率实验,微滤膜分离技术的阳性菌回收率分别为87.69%、87.50%、79.07%、67.86%、83.51%,高于平板计数法的72.01%、71.38%、64.19%、47.32%、65.64%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论微生物检验中应用微滤膜分离技术的阳性检出率与平板计数法相当,但前者的培养时间更短,微生物检验出报告时间早,阳性菌回收率更高,效果优于平板计数法。

大鼠睾丸间质细胞分离和原代培养技术

大鼠睾丸间质细胞分离和原代培养技术徐国刚１吴晓芸２丁训诚２蒋学之１１．上海医科大学劳动卫生教研室（２０００３２）２．上海计划生育研究所生殖毒理监测中心睾丸间质细胞（Ｌｅｙｄｉｇｃｅｌ）的主要功能是合成和分泌雄性激素。通过分离和体外培养，不仅可以研究化...

人胎脑组织神经干细胞的分离培养、克隆和分化

目的 :从人胚胎脑组织中分离出具有自我更新和多分化潜能的神经干细胞 ,并在体外大量扩增。方法 :利用无血清培养技术和单细胞克隆技术从 4月龄人胚脑皮层和中脑中分离培养出神经干细胞 ,加入BrdU让其扩增 ,待形成大量神经干细胞球后 ,部分克隆球进行Nestin和BrdU的免疫荧光标记 ,另一部分神经干细胞球接种于含血清的培养基中让其贴壁分化 ,2周后分别行MAP -2、GFAP和CNP免疫荧光检测。结果 :神经干细胞球Nestin和BrdU免疫荧光检测均呈阳性。神经干细胞球分化后的细胞呈MAP-2、GFAP和CNP阳性。结论 :人胚脑组织中分离得到的神经干细胞具有自我更新和增殖能力 ,并具有分化为神经元。

表皮干细胞体外分离与培养

探索和建立表皮干细胞体外分离与培养的技术方法。通过酶消化法获得幼鼠表皮 ,并制成单表皮细胞悬液 ,以表皮干细胞培养基 ,即无钙EMEM培养基 (添加 9%FBS ,0 0 5mmol/LCaCl2 ,4ng/mlEGF ,0 5ng/ml硫酸庆大霉素及 5 0 %成纤维细胞条件培养基 )置细胞培养箱内培养。成纤维细胞条件培养基为无钙EMEM培养基(添加 9%FBS、0 0 5mmol/LCaCl2 、0 5 μg/ml硫酸庆大霉素 )培养幼鼠皮肤块 4 8h后所得培养液。将 1×10 6/ml上述培养的角质形成细胞经TGG细胞消化液 37℃下振荡消化后 ,接种至鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内 ,37℃下静置 10～ 15min,留用快速贴壁细胞继续培养 ,所得细胞分别以能否呈克隆状生长和透射电镜观察其超微结构及β1整合素、K19免疫细胞化学染色进行鉴定。结果显示 ,鼠Ⅳ型胶原包被的培养瓶内快速贴壁细胞经继续培养 ,可见细胞呈克隆状生长。电镜观察其超微结构示非成熟细胞特征 ,β1整合素、K19免疫细胞化学染色阳性。研究表明 ,表皮干细胞可在体外分离与培养 ,本实验方法为较好方法之一。

人外周血内皮祖细胞分离培养与鉴定

目的探讨人外周血内皮祖细胞体外分离培养和诱导分化的实验方法,为其在神经系统疾病中的应用提供理论依据。方法抽取健康成年男性志愿者外周血10ml,密度梯度离心获得单个核细胞,经体外培养后于倒置相差荧光显微镜下观察细胞生长情况及形态变化;免疫荧光染色检测细胞表面标志物CD133、CD34和凝血因子Ⅷ表达水平;流式细胞术检测CD133-FITC和CD34-PE双阳性细胞所占比例及CD34-PE单阳性细胞所占比例。结果倒置相差荧光显微镜下观察,人外周血单个核细胞经体外培养至第2天时,呈贴壁生长;至第4～6天时细胞集落形成,集落周围有内皮样细胞,细胞质和细胞膜呈红色和绿色双色荧光,细胞核呈蓝色荧光,提示内皮祖细胞特异性吸附Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白和FITC标记的Ⅰ型荆豆凝集素,具有内皮细胞功能。免疫荧光染色CD133、CD34和凝血因子Ⅷ表达阳性;流式细胞术检测CD133-FITC和CD34-PE双阳性细胞所占比例为38.30%,CD34-PE单阳性细胞所占比例为82.60%。结论初步确立人外周血内皮祖细胞体外分离培养和诱导分化的实验方法,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础。

人股骨头骨微血管内皮细胞的分离培养方法

目的：探讨培养人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法.方法：2013年10月至2014年1月15例行髋关节置换患者切除的内部无病变的股骨头,男2例,女13例;年龄38～92岁,平均71.2岁.无菌条件下将股骨头内松质骨咬成碎骨粒,放入培养基.采用酶消化法,密度梯度离心法分离细胞;差速贴壁法,选择性培养基法纯化细胞.倒置显微镜观察细胞特点,并采用vWF、CD31免疫荧光进行细胞鉴定.结果：原代培养24 h后倒置显微镜下观察细胞数量与患者年龄呈正相关,年龄越大细胞越少.培养4～5 d细胞呈短梭形、多角形或“鹩卵石”状.培养7～10d细胞生长密集,细胞融合呈漩涡状,接触抑制明显.vWF、CD31免疫荧光检测阳性率100％,表明细胞为骨微血管内皮细胞.结论：人股骨头骨微血管内皮细胞分离培养方法简单、稳定、有效、可重复性好,可以获得纯度较高的股骨头骨微血管内皮细胞.

鼠口腔黏膜上皮干细胞的分离培养与鉴定

目的探索和建立鼠口腔黏膜上皮干细胞体外分离与培养的技术方法。方法利用纤维结合素-胶原包被的培养瓶快速黏附法分离鼠口腔黏膜上皮干细胞,以鼠成纤维细胞条件培养基和无钙EMEM培养基配制表皮干细胞培养基进行培养。通过β1整合素和角蛋白15(K15)免疫组化染色对培养细胞进行鉴定。结果鼠口腔黏膜上皮干细胞呈明显克隆性生长,β1整合素和角蛋白15(K15)免疫组化染色呈强阳性。结论利用纤维结合素-胶原包被的培养瓶快速黏附法分离鼠口腔黏膜上皮干细胞,用鼠成纤维细胞条件培养基和无钙EMEM培养基配制的表皮干细胞培养基进行培养,可以初步实现对鼠口腔黏膜上皮干细胞体外分离与培养。

人脐静脉血管内皮细胞的高效分离与培养

目的:建立人脐静脉内皮细胞(HUVEC)体外分离、培养、鉴定的高效方法。方法:胰酶消化法从脐静脉获得HUVEC,观察其形态并传代培养,检测其摄取Dil标记的乙酰化低密度脂蛋白(Dil-AcLDL)的情况,传3代流式检测内皮细胞特异性表达。结果:消化分离的细胞呈小圆形且聚集成团;2h细胞开始贴壁,呈条索状;7d细胞增多呈漩涡样生长;此后细胞继续增多接近融合,呈铺路石样改变。流式检测细胞高表达血管内皮细胞特异性标志CD144、vWF、CD31,部分表达CD34,而白细胞共同抗原CD45为阴性表达。镜下发现贴壁细胞原代、第5代摄取Dil-AcLDL,胞浆呈现红色荧光,提示为有活性的内皮细胞。结论:利用胰酶消化法能从人脐静脉获得大量内皮细胞,体外培养后能成功增殖传代。

兔骨髓间充质干细胞体外分离培养及冻存研究

目的:寻求体外培养、冻存、复苏兔骨髓间充质干细胞(mensechymalstemcells,MSCs)的方法,为兔MSCs进一步的实验研究打下基础。方法:取新西兰白兔胫骨穿刺获取骨髓液,以贴壁筛选法分离、纯化、培养和扩增获得MSCs,并行液氮冻存,通过倒置显微镜观察其生物学表现。结果:MSCs为贴壁生长,形态为均匀成纤维细胞样,增殖能力强,传代及冻存后细胞仍然保持其生物学特性。结论:MSCs可采取贴壁筛选法进行较好的纯化和扩增,并可长期保存于液氮中,在一定的条件下可复苏存活。

新生大鼠心肌细胞分离与原代培养

目的应用酶消化法消化心肌组织、培养心肌细胞.方法 0.1%的胰蛋白酶重复消化乳鼠心肌组织多次,收集的细胞用含15%胎牛血清的MEM培养基混悬后过滤,纯化心肌细胞后置CO2培养箱孵育.结果培养的心肌细胞4～6 h后开始贴壁生长,12～24 h明显增殖,3～4 d后细胞汇合成片.在倒置显微镜下心肌细胞呈圆形、梭形、多角形,伸出伪足,出现自发性节律性搏动.结论应用酶消化法可简便、快速地获得大量活力高的心肌细胞.