脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯功能影响的研究

本文用细胞内微注射法对不同强度的脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯 (GJIC)功能的效应进行了研究 ,并与正弦磁场的作用以及脉冲磁场所感生的不同电场的作用进行了比较和探索。研究发现 0 .41mT以上强度的脉冲磁场具有抑制GJIC的作用 ,这种作用与磁场强度有关。其抑制GJIC的效应比正弦磁场为强。经相同磁场不同强度感应电场作用的比较 ,得出 ,GJIC的抑制主要由磁场引起 ,而与感应电场关系不大。

沙利度胺对前列腺癌PC-3细胞的增殖及细胞缝隙连接通讯的影响

目的:观察沙利度胺对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对PC-3细胞中Cx43表达水平的影响。方法:将处于对数生长期的前列腺癌PC-3细胞分别给予递增浓度的沙利度胺(0、12.5、25、50、100μg/mL)处理24 h和48 h。采用CCK-8法检测不同浓度沙利度胺对PC-3细胞的增殖抑制影响,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡情况,RT-PCR法检测Cx43mRNA的表达及Westernblot检测Cx43蛋白的表达。结果:沙利度胺浓度在25～100μg/mL能明显抑制PC-3细胞体外增殖,随着时间、浓度增加,抑制率相应升高。不同浓度组沙利度胺处理PC-3细胞24～48 h后,Cx43 mRNA和蛋白有不同程度的升高(P<0.05)。结论:沙利度胺可通过抑制人前列腺癌PC-3细胞增殖、诱导其凋亡,产生抗肿瘤作用。沙利度胺可上调前列腺癌PC-3细胞Cx43mRNA及蛋白的表达水平,并可能促进前列腺癌PC-3细胞的细胞缝隙连接通讯功能的恢复,从而抑制肿瘤生长。

纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究

将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞(Hep-G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)功能变化的影响。经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上。此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高。实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关。研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。

转染Cx43基因对人膀胱肿瘤细胞缝隙连接通讯及其生长变化的研究

目的:研究Cx43基因对膀胱癌细胞的缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及其增殖的抑制作用,探索以Cx43基因治疗膀胱癌的可行性。方法:将含Cx43c DNA的质粒以脂质体介导转染Cx43表达缺失的BIU-87人膀胱癌细胞,通过原位杂交、RT-PCR和免疫组化染色检测Cx43m RNA及蛋白表达,划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)检测GJIC,MTT法测定细胞增殖率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:转染后BIU-87细胞有不同程度的Cx43 m RNA和蛋白表达及GJIC恢复。Cx43高表达的克隆细胞增殖明显下降,细胞凋亡并未增加。结论:Cx43基因及GJIC在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用,可能成为膀胱癌基因治疗的优选靶点之一。

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(hum an m esenchym al stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junc-tional intercellu lar commun ication,G JIC)功能。方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescencered istribution after photob leach ing,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的G JIC功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26±0.76)%。结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式。

亚砷酸钠和氧苯胂对人皮肤成纤维细胞缝隙连接通讯的动态影响及作用特征

目的 了解和比较不同砷化合物对细胞缝隙连接通讯的动态影响及作用特征 ,进一步阐明砷的致癌机理。方法 用激光共聚焦显微镜 ,以细胞漂白后荧光强度的恢复作为评价缝隙连接通讯的指标 ,按激光漂白后荧光恢复实验技术测定亚砷酸钠和氧苯胂对人皮肤成纤维细胞缝隙连接通讯的影响。结果 亚砷酸钠和氧苯胂均可明显抑制激光漂白后细胞荧光强度的恢复 ,其作用有明显的剂量 反应关系 ;进一步的研究发现 ,在去除亚砷酸钠作用后的不同时间 ,实验组细胞荧光强度恢复增加值显著低于对照组 ,表明细胞缝隙连接通讯功能没有恢复 ;而在去除氧苯胂作用 4h后 ,实验组荧光强度恢复增加值与对照组无显著性差异 ,表明细胞缝隙连接通讯有所恢复。结论 无机砷和有机砷均可明显抑制细胞缝隙连接通讯 ,但二者的作用特征有所不同。

喹啉衍生物PQ1联合顺铂对前列腺癌PC3细胞的增殖及细胞缝隙连接通讯的影响

目的：探讨喹啉衍生物PQ1联合顺铂对前列腺癌PC3细胞的增殖及细胞缝隙连接通讯的影响。方法：体外培养前列腺癌PC3细胞,对比空白对照组、10 mg/ml顺铂对照组及顺铂联合不同浓度（1、2、5、10、15μmol/L）喹啉衍生物PQ1各组PC3细胞增殖情况,通过RT-PCR法及Western印迹法检测各组间细胞缝隙连接相关蛋白Cx43 mRNA及蛋白表达情况。结果：喹啉衍生物PQ1浓度在1~10μmol/L联合顺铂能明显抑制PC3细胞的体外增殖,随浓度、时间的增加,抑制率相应升高。不同浓度联合药物处理PC3细胞后,Cx43 mRNA及蛋白表达也有不同程度升高。结论：喹啉衍生物可以通过上调前列腺癌PC3细胞间缝隙连接相关蛋白Cx43 mRNA及蛋白的表达水平来促进前列腺癌PC3细胞的细胞间缝隙连接功能,增强顺铂对前列腺癌PC3细胞的杀伤作用。

纳米SiO_2颗粒对HL-7702细胞的毒性作用和缝隙连接通讯的影响

目的:探讨纳米二氧化硅(SiO2)颗粒对HL-7702细胞的毒性作用和细胞缝隙连接通讯(GJIC)的影响,为纳米SiO2体内外毒性的预测和安全性应用提供实验依据。方法:透射电镜(TEM)观察2种SiO2颗粒的粒径、分散性和形状;动态光散射法(DLS)检测SiO2颗粒在高纯水和培养液中的粒度分布;MTT法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)活力实验检测细胞膜完整性;划痕染料示踪技术检测GJIC。结果:透射电镜,2种SiO2颗粒呈圆形,大小均一,分散性良好,2种颗粒的粒径分别为(447.60±20.78)和(67.42±5.69)nm,分别为亚微米级和纳米级颗粒。动态光散射法,2种颗粒在高纯水和RPMI-1640培养液中的水合粒径分别为(684.37±18.76)、(697.02±19.57)nm和(128.31±7.64)、(133.74±8.97)nm,颗粒均未发生聚集,分散性良好。MTT法,2种SiO2颗粒作用细胞24h后,同一粒径的颗粒,随着浓度的增加,细胞存活率下降;同一浓度下,纳米颗粒比亚微米颗粒的毒性大。LDH活力实验,当作用细胞24h后,2种SiO2颗粒均能够损伤细胞膜,同一浓度下,纳米SiO2颗粒比亚微米颗粒对细胞膜的损伤能力大;同一粒径的颗粒,随着作用浓度的增加,细胞膜的损伤程度加重。划痕染料示踪实验,纳米SiO2颗粒可抑制GJIC,并且随着作用浓度的增加,抑制作用增强;而在相同浓度下,纳米SiO2颗粒比亚微米颗粒对GJIC的抑制作用更明显。结论:纳米SiO2颗粒能够对HL-7702细胞产生毒性作用,且抑制GJIC。

前列腺癌微环境中癌相关成纤维细胞对细胞缝隙连接通讯的影响

目的观察前列腺癌微环境中癌相关成纤维细胞(CAFs)对细胞缝隙连接通讯(GJIC)的影响。方法取前列腺癌组织分离培养及鉴定CAFs,分别将(0、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L)浓度的CAFs培养液与处于对数生长期的前列腺癌PC-3细胞(购自中国科学院上海生命科学研究院细胞资源中心)共同培养,采用荧光漂白恢复技术检测各组前列腺癌PC-3细胞缝隙连接(GJ)功能,蛋白质印迹法(Western blot)检测各组细胞间隙连接蛋白43(Cx43)蛋白的表达。组间比较采用方差分析。结果成功分离培养CAFs,前列腺癌PC-3细胞与不同浓度CAFs(0.00、0.25、0.50、0.75、1.00 g/L)共培养后,细胞内荧光恢复程度逐渐减弱[(49.40±5.42)%、(45.36±3.23)%、(36.57±3.95)%、(29.18±5.51)%、(21.81±4.58)%,F=18.067,P<0.05],细胞GJIC水平逐渐减弱,呈明显的剂量-效应依赖关系,差异有统计学意义(t=1.109、3.313、4.531、6.734,P<0.05)。同时,各组CAFs中的Cx43蛋白的表达水平分别为0.723±0.065、0.641±0.084、0.425±0.078、0.314±0.067、0.267±0.059。随着共培养CAFs浓度的增加,细胞内Cx43蛋白表达水平反而逐渐降低,差异有统计学意义(t=1.337、5.084、7.589、8.997,P<0.05)。结论CAFs可下调前列腺癌PC-3细胞Cx43蛋白的表达水平,抑制前列腺癌PC3细胞的细胞间缝隙连接功能。

脑蛋白水解液对大鼠胶质细胞缝隙连接通讯的影响

细胞通讯足多细胞生物的一个基本需要，在复杂的细胞信号传导网络中，缝隙连接是动物细胞间最普遍存在的细胞连接方式，通过电、化学偶联对细胞的生长、分化和增殖发挥调控作用，在神经系统疾病的诊治中越来越发挥重要作用。

吴茱萸碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞缝隙连接通讯及胶原合成的影响

目的观察吴茱萸碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和细胞间缝隙连接蛋白43（Cx43）蛋白以及胶原合成的影响。方法取手术切除瘢痕疙瘩组织成纤维细胞原代培养，将瘢痕疙瘩成纤维细胞分为空白对照组和用含不同浓度（0．5、1．0、2．0、4．0μmol／L）吴茱萸碱培养液处理的实验组，给药24、48h后噻唑蓝（MTT）法检测细胞的活性，酶联免疫吸附试验（ELISA）法检测不同浓度吴茱萸碱对瘢痕疙瘩成纤维细胞Cx43蛋白、Ⅰ和Ⅲ型胶原合成的影响。结果在0．5、1．0、2．0、4．0μmol／L实验组中24h细胞抑制率分别为6．2％、9．1％、12．5％、17．6％，48h细胞抑制率分别为10．9％、21．7％、33．4％、43．3％，显示吴茱萸碱显著抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖，且存在一定的时间和浓度依赖性；ELISA结果显示：48h后在0．5、1．0、2．0、4．0μmol／L实验组中Cx43蛋白吸光度（A）值分别为0．252、0．315、0．383、0．547；I型胶原A值分别为0．507、0．412、0．336、0．226；m型胶原A值分别为0．246、0．228、0．179、0．115；吴茱萸碱作用后瘢痕疙瘩成纤维细胞的细胞缝隙连接Cx43蛋白表达增强，Ⅰ、Ⅲ型胶原表达减弱。结论吴茱萸碱有效促进细胞缝隙连接Cx43蛋白表达，提高细胞缝隙连接通讯（GJIC）水平，抑制瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和Ⅰ、Ⅲ型胶原合成。

细胞缝隙连接通讯功能检测方法的研究进展

细胞缝隙连接通讯(GJIC)是细胞间重要的通讯方式之一,已在兽医学科的相关研究中得到广泛应用。目前对缝隙连接检测方法的应用和评议并不统一。本文从代谢偶联、电化学生理、染料偶联三个方面,介绍GJIC功能的检测方法和应用,并对各种检测方法在实际应用中所表现出优势和局限性进行了阐述和探讨,为缝隙连接通讯检测方法的选择和联合应用提供参考。

TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响

目的:观察转化生长因子TGF-β1对成年大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白Cx43表达以及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的影响,旨在探讨TGF-β1对Leydig细胞的影响是否与其改变细胞间GJIC功能相关。方法:将原代培养纯化的Leydig细胞分为6组:实验组分别以1、2、5、10 ng/ml的TGF-β1处理细胞20 h,空白对照组以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液处理细胞,部分实验中以GJIC抑制剂甘珀酸(Carbenox-olone)处理细胞作为阳性对照组。采用免疫荧光法和Western印迹观察Cx43在细胞中的定位和表达变化,用荧光漂白恢复实验(FRAP)检测细胞间GJIC功能的改变。结果:Cx43表达呈斑点状散在分布于Leydig细胞的胞质和胞膜中,TGF-β1处理20 h后,Cx43在胞质中的表达强度随着TGF-β1浓度的增加较空白对照组明显增强,而其在胞膜中的表达则无明显改变。Western印迹结果显示磷酸化状态的Cx43随着TGF-β1浓度增加表现出较空白对照明显增强的趋势(P<0.05),而非磷酸化状态则无显著差异。FRAP结果显示经5 ng/ml TGF-β1作用20 h后细胞内荧光强度较空白对照明显减弱,具有显著性差异(P<0.01),且其平均荧光恢复率仅为(43.58±1.87)%。结论:TGF-β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC功能,这种抑制作用可能通过增加其连接蛋白Cx43在细胞质中的表达,提高其磷酸化水平来实现。

三七皂甙对急性肝功能衰竭大鼠肝细胞缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯的影响

目的从细胞间缝隙连接通讯的角度,探讨三七皂甙(panaxnotoginsengsaponins,PNS)在急性肝功能衰竭(AHF)修复中的作用及机制。方法雄性Wistar大鼠200只(SPF级,江西省实验动物质量检测中心提供),体重180～200g,适应性喂养1周,随机分成3组:对照组(n=30),模型组(n=100),三七皂甙组(PNS组,n=70)。模型组和PNS组采用四氯化碳腹腔注射法建立AHF模型,分别在造模后1、3、7、10和14d5个时间点开腹,采取肝组织行免疫组化检查Cx32、切开标记荧光染料传输(IL/DT)查GJIC功能。结果动物在造模后立即出现精神萎靡、活动及摄食减少、嗜睡,严重者有全身多脏器出血、昏迷甚至死亡。PNS组与模型组的病死率差异有显著性P(<0.05)。Cx32的免疫组化显示,造模初期PNS组的Cx32分布及数量与模型组相似,随着时间的推移,数量呈进行性增加的趋势。荧光染料传输发现,模型组的染料传输能力在造模后比对照组明显减低(P<0.01),并在第3天达到最低程度,此后虽逐渐恢复,但到第14天与对照组间差异仍有极显著性(P<0.01);PNS组的染料传输在造模后第1天比对照组明显减低(P<0.01),程度与模型组相仿(P>0.05),但与模型组不同的是PNS组在第3天由荧光染料传输所反映的GJIC功能已经开始恢复,与模型组相比差异有极显著性(P<0.01),到第14天恢复正常,与对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论PNS可以上调AHF大鼠肝细胞间的CX/GJIC,从而加快损伤中后期肝细胞间的信息交流,促进肝脏细胞的增生及肝组织结构的重建。

大肠癌细胞间缝隙连接通讯与E-钙粘素的检测

目的 定性检测大肠癌组织缝隙连接蛋白 (Cx4 3)与E 钙粘素 (E Cad)的表达 ;定量测定正常上皮与大肠癌细胞间缝隙连接通讯 (GJIC)。方法 鼠大肠癌与对照组织中Cx4 3和E Cad的表达用免疫组化法检测 ;GJIC用荧光漂白恢复法检测。结果 大肠癌Cx4 3和E Cad阳性率 (40 % ,4 3% )明显低于对照组织(90 % ,87% ) ,33%肿瘤标本二者皆不表达 ,该组肿瘤的分化度也较差 ;大肠癌细胞HR ,Lovo ,HT 2 9间GJIC明显低于正常上皮细胞。结论 在鼠大肠上皮细胞恶变过程中伴有Cx4 3与E Cad的表达抑制或缺失与大肠癌的发生发展有关。

吴茱萸次碱改善溶血性磷脂酰胆碱诱导的内皮细胞缝隙连接细胞间通讯功能障碍

目的探讨吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)抗溶血性磷脂酰胆碱(LPC)损伤的内皮保护效应及对缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的调节作用。方法在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),预先加入不同浓度的Rut(1.0、0.3、0.1μmol·L-1),处理10 min后加入LPC(10 mg·L-1)共同孵育24 h。应用辣椒素受体(TRPV1)竞争性拮抗剂CAPZ(10μmol·L-1)研究TRPV1是否介导Rut的保护效应。荧光定量PCR检测缝隙连接蛋白Cx37、Cx40的mRNA水平,Western blot检测Cx37和Cx40的蛋白水平,划痕负载试验测定GJIC功能。检测内皮细胞活力(MTT法)、活性氧(ROS)水平和细胞培养液中NO水平及单核细胞黏附,以评价内皮细胞损伤程度。结果 LPC明显下调HUVEC中Cx37和Cx40的mRNA和蛋白水平,抑制缝隙连接染料迁移。而Rut可明显恢复Cx37、Cx40的表达,改善GJIC功能,并减轻LPC诱导血管内皮损伤,表现为增加细胞活力和NO水平,抑制ROS生成和单核细胞黏附。预先给予CAPZ可取消这些效应。结论 Rut可抑制LPC诱导的内皮细胞损伤,恢复Cx37和Cx40的表达而改善GJIC,其机制与激活TRPV1有关。

N-6/N-3多不饱和脂肪酸不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响

目的观察n-6／n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响。方法n-6／n-3PUFA不同比例（1～10）处理MCF-7（ER^＋）和MDA-MB-231（ER^-）乳腺癌细胞，采用免疫细胞化学观察细胞核Ki-67表达，Western blot检测细胞膜和细胞质缝隙连接蛋白Cx26、Cx43表达，划痕负载染料迁移法分析细胞缝隙连接通讯功能。结果免疫组化结果显示，单纯n-6和10：1n-6／n-3 PUFA增强两种乳腺癌细胞Ki-67表达（P〈0．05），5：1 n-6／n-3 PUFA虽无明显变化，但单纯n-3和1：1n-6／n-3 PUFA抑制细胞Ki-67表达（P〈0．01）。免疫印迹发现，单纯n-3和1：1n-6／n-3 PUFA能明显上调MCF-7细胞膜和细胞质的Cx26、Cx43蛋白表达，单纯n-6 PUFA却下调两种蛋白表达；在MDA-MB-231细胞，n-6／n-3 PUFA不同比例对膜和细胞质的Cx43蛋白表达与MCF-7细胞具有相同趋势，但对Cx26蛋白则无明显作用。用划痕负载染料迁移法却发现，n-6／n-3 PUFA不同比例对细胞缝隙连接通讯功能均无明显影响。结论单纯n-3和1：1n-6／n-3PUFA对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖活性的抑制作用，可能是Cx26和Cx43蛋白通过独立于缝隙连接细胞通讯功能的调节所致。

吴茱萸碱通过增强细胞缝隙连接通讯改善前列腺癌PC-3细胞对顺铂耐药的研究

目的 观察吴茱萸碱联合顺铂对前列腺癌PC-3细胞增殖和细胞间缝隙连接通讯（GJIC）的影响.方法 体外培养PC-3细胞,分为顺铂组（5、10、15、20 μmol/L）和顺铂（5、10、15、20 μmol/L）＋吴茱萸碱组（0.4μmol/L）作用PC-3细胞.细胞计数试剂盒（CCK-8）法检测细胞增殖率变化;流式细胞术检测细胞凋亡变化;Western blot分别检测间隙连接蛋白43（Cx43）蛋白表达;荧光光漂白恢复技术检测细胞缝隙连接（GJ）功能改变.结果 顺铂组荧光恢复率分别为（41.93±1.30）％、（36.32±2.33）％、（30.81±1.43）％、（22.54±1.70）％,顺铂＋吴茱萸碱组分别为（69.86±2.16）％、（50.03±5.00）％、（45.38 ±2.59）％、（34.01±4.01）％.与顺铂组比较,顺铂联合吴茱萸碱组荧光恢复率、细胞凋亡水平、Cx43蛋白表达水平均明显升高（P＜0.05）.结论 吴茱萸碱可改善前列腺癌PC-3细胞株对顺铂耐药性,增强顺铂对前列腺癌PC-3细胞杀伤作用.

细胞缝隙连接通讯在镉致大鼠肝细胞毒性损伤中的双重作用

为了探讨细胞缝隙连接通讯(GJIC)在镉致大鼠肝细胞损伤中的作用及α-硫辛酸(LA)的保护效应,本研究用2.5μmol/L醋酸镉(Cd)、50μmol/L LA、50μmol/L甘珀酸(CXB)处理大鼠肝细胞系BRL 3A细胞,采用显微镜观察细胞形态、CCK8法测定细胞相对存活率、试剂盒检测LDH漏出率、Western-blot法检测Bax、Bcl-2蛋白表达量、用Transwell建立细胞共培养系统、流式细胞术检测细胞凋亡率。结果显示,2.5μmol/L Cd能引起BRL 3A细胞相对存活率下降,LDH漏出率增加,Bax/Bcl-2比值升高,LA可部分缓解这些损害;GJIC抑制剂CBX可进一步加剧镉引起的细胞形态变化以及LDH漏出率的增加;在Transwell共培养系统中,CBX可有效降低镉暴露凋亡细胞诱导相邻正常细胞的凋亡率,而LA的保护作用不明显。上述结果表明GJIC在镉致大鼠肝细胞毒性损伤中具有双重作用。