脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯功能影响的研究

本文用细胞内微注射法对不同强度的脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯 (GJIC)功能的效应进行了研究 ,并与正弦磁场的作用以及脉冲磁场所感生的不同电场的作用进行了比较和探索。研究发现 0 .41mT以上强度的脉冲磁场具有抑制GJIC的作用 ,这种作用与磁场强度有关。其抑制GJIC的效应比正弦磁场为强。经相同磁场不同强度感应电场作用的比较 ,得出 ,GJIC的抑制主要由磁场引起 ,而与感应电场关系不大。

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(hum an m esenchym al stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junc-tional intercellu lar commun ication,G JIC)功能。方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescencered istribution after photob leach ing,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的G JIC功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26±0.76)%。结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式。

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的荧光漂白恢复法测定

目的:研究脉冲电磁场(pulsedelectromagneticfields,PEMF)对人骨髓间充质干细胞(humanmesenchymalstemcells,hMSCs)缝隙连接所介导的细胞通讯(gapjunctionalintercellularcommunication,GJIC)的影响。方法:实验于2004-07/09在解放军第三军医大学中心实验室完成。应用荧光漂白恢复(fluorescenceredistributionafterphotobleaching,FRAP)技术,通过激光共聚焦显微镜检测hMSCs经PEMF刺激后的GJIC功能变化。结果:经PEMF刺激后的hMSCs,平均荧光漂白恢复率为(64.12±0.83)%,对照组为35.26±0.76)%,前者较后者有显著性增加((t=-15.49,P<0.01)。结论:PEMF刺激能促进hMSCs的缝隙连接通讯功能。

培养细胞缝隙连接通讯功能测定的新方法

用粘附式细胞仪（ＡＣＡＳ５７０）检测了培养细胞缝隙连接通讯功能。预先用荧光探针６－羟基荧光素乙酰乙酸盐进行细胞染色，然后光漂白细胞中的荧光分子。由于邻近细胞中未漂白的荧光分子通过缝隙连接扩散到漂白的细胞内，故可监测漂白细胞荧光强度的恢复。根据荧光恢复的比率，了解缝隙连接通讯功能的状态。

六味地黄丸通过干预缝隙连接通讯功能调控树突状细胞抗原交叉提呈能力研究

【目的】探讨六味地黄丸是否通过提高缝隙连接通讯功能(GJIC)增强树突状细胞(DC)抗原交叉提呈能力,并对其机制进行相关探索。【方法】采用Western Blot实验、免疫荧光法观察六味地黄丸含药血清对黑色素瘤细胞(B16)缝隙连接蛋白43(Cx43)表达及膜定位的影响;采用钙黄绿素(Ca-AM)/DiI荧光示踪实验观察六味地黄丸含药血清对B16细胞GJIC功能的影响;采用流式细胞术观察GJIC在六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力中的作用;采用碘化丙啶(PI)/Hoechst染色实验观察CD8+T淋巴细胞的免疫杀伤效果。【结果】Western Blot及免疫荧光实验结果显示,六味地黄丸含药血清上调Cx43表达;荧光示踪实验证明,六味地黄丸含药血清显著增强B16细胞GJIC功能;流式细胞术分析表明,六味地黄丸含药血清增强DC抗原提呈能力;PI/Hoechst染色结果显示,六味地黄丸含药血清干预B16-OVA后CD8+T细胞的免疫杀伤效果更加显著。【结论】六味地黄丸通过上调黑色素瘤细胞Cx43表达,改善GJIC功能,进而增强DC的交叉提呈能力,从而激活更强的CD8+T细胞免疫杀伤反应。

工频磁场对细胞缝隙连接通讯功能的影响

为了探讨极低频（ＥＬＦ）磁场可能存有的促癌作用或协同促癌作用，观察了５０Ｈｚ磁场对ＣＨＬ细胞间缝隙连接通讯（ＧＪＩＣ）功能的影响。利用离子电渗注射法将荧光染料引入细胞内，以５分钟后的荧光偶合细胞（ＤＣＣ）数作为ＧＪＩＣ功能的指标。研究了不同浓度的十四酰基咐拜醇酯（ＴＰＡ）、不同强度的工频磁场及工频磁场与ＴＰＡ（５ｎｇ／ｍｌ）共同作用对ＣＨＬ细胞ＧＪＩＣ的影响。结果表明，ＴＰＡ对ＧＪＩＣ的抑制具有浓度依赖关系，ＴＰＡ抑制ＣＨＬ细胞ＧＪＩＣ的阈浓度在１～５ｎｇ／ｍｌ之间；ＣＨＬ细胞经０.８０ｍＴ的工频磁场暴露２４小时后的ＤＣＣ数降至６．０８±１．５９，与空白对照组（９．８４±２．２７）比较，差异有显著性（Ｐ＜０．０５）；０．２０，０．４０，０．８０ｍＴ强度的工频磁场与５ｎｇ／ｍｌＴＰＡ共同作用后的ＤＣＣ数分别降至５．５２±１．５３，５．００±１．２２，４．００±１．２９，与单用５ｎｇ／ｍｌＴＰＡ组（６．３８±１．３９）比较，差异也有显著性（Ｐ＜０．０５）。说明一定强度的工频磁场具有抑制或协同抑制ＧＪＩＣ的作用，提示其可能存有促癌或协同促癌作用。

吴茱萸次碱改善溶血性磷脂酰胆碱诱导的内皮细胞缝隙连接细胞间通讯功能障碍

目的探讨吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)抗溶血性磷脂酰胆碱(LPC)损伤的内皮保护效应及对缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的调节作用。方法在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),预先加入不同浓度的Rut(1.0、0.3、0.1μmol·L-1),处理10 min后加入LPC(10 mg·L-1)共同孵育24 h。应用辣椒素受体(TRPV1)竞争性拮抗剂CAPZ(10μmol·L-1)研究TRPV1是否介导Rut的保护效应。荧光定量PCR检测缝隙连接蛋白Cx37、Cx40的mRNA水平,Western blot检测Cx37和Cx40的蛋白水平,划痕负载试验测定GJIC功能。检测内皮细胞活力(MTT法)、活性氧(ROS)水平和细胞培养液中NO水平及单核细胞黏附,以评价内皮细胞损伤程度。结果 LPC明显下调HUVEC中Cx37和Cx40的mRNA和蛋白水平,抑制缝隙连接染料迁移。而Rut可明显恢复Cx37、Cx40的表达,改善GJIC功能,并减轻LPC诱导血管内皮损伤,表现为增加细胞活力和NO水平,抑制ROS生成和单核细胞黏附。预先给予CAPZ可取消这些效应。结论 Rut可抑制LPC诱导的内皮细胞损伤,恢复Cx37和Cx40的表达而改善GJIC,其机制与激活TRPV1有关。

TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响

目的:观察转化生长因子TGF-β1对成年大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白Cx43表达以及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的影响,旨在探讨TGF-β1对Leydig细胞的影响是否与其改变细胞间GJIC功能相关。方法:将原代培养纯化的Leydig细胞分为6组:实验组分别以1、2、5、10 ng/ml的TGF-β1处理细胞20 h,空白对照组以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液处理细胞,部分实验中以GJIC抑制剂甘珀酸(Carbenox-olone)处理细胞作为阳性对照组。采用免疫荧光法和Western印迹观察Cx43在细胞中的定位和表达变化,用荧光漂白恢复实验(FRAP)检测细胞间GJIC功能的改变。结果:Cx43表达呈斑点状散在分布于Leydig细胞的胞质和胞膜中,TGF-β1处理20 h后,Cx43在胞质中的表达强度随着TGF-β1浓度的增加较空白对照组明显增强,而其在胞膜中的表达则无明显改变。Western印迹结果显示磷酸化状态的Cx43随着TGF-β1浓度增加表现出较空白对照明显增强的趋势(P<0.05),而非磷酸化状态则无显著差异。FRAP结果显示经5 ng/ml TGF-β1作用20 h后细胞内荧光强度较空白对照明显减弱,具有显著性差异(P<0.01),且其平均荧光恢复率仅为(43.58±1.87)%。结论:TGF-β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC功能,这种抑制作用可能通过增加其连接蛋白Cx43在细胞质中的表达,提高其磷酸化水平来实现。

镉对BRL 3A细胞缝隙连接通讯功能的影响

为探讨镉对大鼠肝细胞(BRL 3A)缝隙连接通讯功能的影响,以0、2.5、10μmol/L醋酸镉溶液分别处理BRL 3A细胞12h,采用实时分析技术测定细胞指数,显微镜观察细胞形态,划痕染料标记示踪法检测细胞缝隙连接通讯(GJIC),激光共聚焦观察缝隙连接蛋白Cx43的分布,免疫印迹测定Cx43的表达及其磷酸化水平。结果显示,随着镉浓度的增大(2.5、10μmol/L),细胞指数值降低,细胞间荧光黄两侧扩散距离极显著减少(P<0.01),Cx43在细胞膜上分布减少、胞内增多,Cx43的表达及其磷酸化水平极显著降低(P<0.01)。结果表明,镉对BRL 3A细胞有明显细胞毒性,可抑制GJIC,其机制可能是镉诱导BRL 3A细胞Cx43分布异常、表达减少及磷酸化水平降低。

三七皂甙对急性肝功能衰竭大鼠肝细胞缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯的影响

目的从细胞间缝隙连接通讯的角度,探讨三七皂甙(panaxnotoginsengsaponins,PNS)在急性肝功能衰竭(AHF)修复中的作用及机制。方法雄性Wistar大鼠200只(SPF级,江西省实验动物质量检测中心提供),体重180～200g,适应性喂养1周,随机分成3组:对照组(n=30),模型组(n=100),三七皂甙组(PNS组,n=70)。模型组和PNS组采用四氯化碳腹腔注射法建立AHF模型,分别在造模后1、3、7、10和14d5个时间点开腹,采取肝组织行免疫组化检查Cx32、切开标记荧光染料传输(IL/DT)查GJIC功能。结果动物在造模后立即出现精神萎靡、活动及摄食减少、嗜睡,严重者有全身多脏器出血、昏迷甚至死亡。PNS组与模型组的病死率差异有显著性P(<0.05)。Cx32的免疫组化显示,造模初期PNS组的Cx32分布及数量与模型组相似,随着时间的推移,数量呈进行性增加的趋势。荧光染料传输发现,模型组的染料传输能力在造模后比对照组明显减低(P<0.01),并在第3天达到最低程度,此后虽逐渐恢复,但到第14天与对照组间差异仍有极显著性(P<0.01);PNS组的染料传输在造模后第1天比对照组明显减低(P<0.01),程度与模型组相仿(P>0.05),但与模型组不同的是PNS组在第3天由荧光染料传输所反映的GJIC功能已经开始恢复,与模型组相比差异有极显著性(P<0.01),到第14天恢复正常,与对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论PNS可以上调AHF大鼠肝细胞间的CX/GJIC,从而加快损伤中后期肝细胞间的信息交流,促进肝脏细胞的增生及肝组织结构的重建。

毫米波对人角质形成细胞缝隙连接通讯功能的影响

目的 研究低功率毫米波对人皮肤角质形成细胞 (HaCaT)缝隙连接通讯 (GJIC)的影响。方法 采用荧光淬灭后恢复技术 ,用激光共聚焦显微镜检测频率为 30 16GHz、功率密度分别为1 0和 3 5mW/cm2 毫米波辐照对细胞缝隙连接通讯功能的影响。结果 12 氧 14 酰佛波酯 (TPA)5 μg/L可抑制细胞GJIC功能 ,激光淬灭后平均荧光恢复率由正常对照的 (5 5± 17) %降至 (34±13) % ,差异有非常显著性。功率密度为 1 0和 3 5mW /cm2 毫米波单独辐照不改变细胞GJIC功能 ,其平均荧光恢复率分别为 (5 2± 16 ) %和 (5 0± 17) % ;当毫米波与TPA联合作用时 ,TPA诱导的细胞GJIC功能抑制被削弱 ,其中 1 0mW /cm2 毫米波使TPA诱导的细胞GJIC功能抑制部分恢复 ,其平均荧光恢复率为 (47± 16 ) % ,差异有非常显著性 ;而 3 5mW /cm2 毫米波使细胞GJIC功能完全恢复至正常对照水平 ,其平均荧光恢复率为 (5 0± 16 ) % ,差异有非常显著性。结论 毫米波辐照可消除或减小TPA诱导的细胞GJIC功能抑制。

吴茱萸碱对大鼠肝癌细胞缝隙连接细胞通讯功能及连接蛋白表达的影响

目的探讨吴茱萸碱抗肿瘤的作用机制。方法用终浓度为0.1,0.2,0.3μmol/L的吴茱萸碱作用于CBRH7919细胞,同时设不加吴茱萸碱的空白对照组。采用划痕标记染料示踪技术检测各组细胞缝隙连接细胞通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能;异硫氰酸荧光素间接免疫荧光法检测连接蛋白(connexin,Cx)26、Cx32表达的变化。结果与空白对照组相比,吴茱萸碱各浓度组CBRH7919细胞Cx26、Cx32表达显著增加,GJIC功能增强,并呈一定的剂量效应依赖关系。结论吴茱萸碱上调CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达及促进CBRH7919细胞的GJIC功能,可能是其抗肿瘤的机制之一。

大肠癌细胞与血管内皮细胞间缝隙连接通讯的建立与功能检测

目的建立大肠癌细胞与血管内皮细胞间缝隙连接细胞通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)模型,探讨癌细胞与血管内皮细胞之间GJIC的变化在癌转移中的作用。方法采用细胞培养、免疫组化技术及激光漂白后荧光恢复技术,检测单独培养的内皮细胞及与不同转移能力的人大肠癌细胞系LoVo细胞、HT29细胞共培养之内皮细胞间缝隙连接细胞间通讯的状况。结果相邻接触的内皮细胞在激光漂白后出现荧光恢复现象,低转移能力的HT29细胞与内皮细胞共培养组荧光恢复明显减缓;高转移能力的LoVo细胞与内皮细胞共培养组荧光恢复更慢([25.68±15.74)%和(15.13±7.76)%,P<0.05]。结论大肠癌细胞与血管内皮细胞黏附后,其间的缝隙连接细胞间通讯减少,并且高转移能力的LoVo细胞与血管内皮细胞间的缝隙连接通讯减少尤其明显。肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附后,其间的缝隙连接细胞间通讯发生改变,与恶性肿瘤的转移特性密切相关。

大鼠肝脏缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯在急性肝功能衰竭不同阶段的表达

目的研究缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯(CX/GJIC)在急性肝功能衰竭(AHF)大鼠肝脏不同阶段的变化规律。方法雄性Wistar大鼠30只为对照组,选择造模后成活的同种大鼠30只为模型组,分别在造模后1、3、7、10、14d5个时间点开腹,采取肝组织行免疫组化、切开标记荧光染料传输(IL/DT)和RT-PCR检查。结果(1)模型组肝组织Cx32较对照组明显减少,并随时间延长呈进行性增加的趋势。(2)模型组的荧光染料传输能力比对照组显著减低,差异有高度统计学意义(P<0.01),此后虽逐渐恢复,但第14天与对照组间的差异仍有高度统计学意义(P<0.01)。(3)模型组Cx32mRNA转录在前3d明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠肝细胞间的CX/GJIC在急性肝功能衰竭早期呈现下调现象,此后逐步恢复。

人脐动脉内皮细胞和平滑肌细胞体外培养鉴定及缝隙连接通讯功能测定

目的:应用双光子激光扫描共聚焦显微镜鉴定体外培养的脐动脉内皮细胞(ECs)和平滑肌细胞(SMCs),应用荧光光漂白恢复技术(FRAP)测定血管ECs、SMCs之间的缝隙连接通讯(GJIC)功能。方法:人脐动脉ECs、SMCs分离培养,Ⅷ因子和SMα-actin相关抗原鉴定ECs和SMCs,应用FRAP技术测定血管内皮细胞、平滑肌细胞之间的GJIC功能,记录实时成像结果,应用动态比(M)计算漂白区域内标记荧光的分子中动态分子的比例。结果:第一组ECs和SMCs单独培养,选择漂白细胞与周围至少3个同种细胞相连接,SMCs被漂白后平均M值为31.79±5.69;ECs被漂白后平均M值为23.43±2.11;第二组ECs和SMCs混合培养,选择ECs和SMCs独立相连的2个细胞,SMCs被漂白后平均M值为14.47±3.28,ECs被漂白后平均M值为6.41±0.80。结论:FRAP实时动态恢复曲线可直接观察荧光恢复强度及速度,参照FRAP恢复曲线,M值可做为组间GJIC比较相对定量的可靠指标,通过检测证实ECs和SMCs之间存在GJIC,且荧光由ECs向SMCs方向的传递大于由SMCs向ECs方向的传递。

全反式维甲酸对脑胶质瘤细胞缝隙连接细胞间通讯功能的影响

目的 观察大鼠脑胶质瘤C6细胞缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能,并研究全反式维甲酸(ATRA)对C6 细胞GJIC功能的影响。方法 (1)全反式维甲酸(ATRA)上调C6胶质瘤细胞GJIC功能;(2)划痕荷载染料传输 实验(SLDT)检测C6细胞ATRA处理前、后的细胞GJIC功能强弱;(3)光学显微镜观察ATRA处理前、后的细胞 形态学变化。结果 (1)C6细胞GJIC功能低下;(2)ATRA上调C6胶质瘤细胞GJIC功能;(3)上调C6胶质瘤细 胞GJIC功能后细胞增殖受到抑制。结论 (1)ATRA是C6细胞GJIC功能上调剂之一;(2)GJIC功能强弱可影响 肿瘤细胞增殖。

黄芪甲苷减轻镉致TM3细胞Cx43表达下降及缝隙连接细胞间通讯功能减退

目的探讨黄芪甲苷(As)对镉(Cd)致TM3细胞连接蛋白43(Cx43)表达改变及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能改变的保护作用。方法用TM3细胞系作为研究对象,设对照组、As(20 mg/L)组、Cd(10μmol/L)组、Cd加As组,免疫组织化学方法分析Cx43阳性产物表达,荧光定量PCR检测Cx43 mRNA表达,Western blot检测Cx43蛋白表达,划痕标记染料示踪技术(SLDT)检测GJIC功能。结果与对照组相比,Cd组TM3细胞Cx43阳性产物表达的平均吸光度值(A_(OD))显著降低(P<0.01),Cx43 mRNA和蛋白表达下降(P<0.01),TM3细胞GJIC功能降低(P<0.01);Cd+As组TM3细胞Cx43阳性产物表达虽较对照组减弱但明显高于相应Cd组(P<0.01),Cx43 mRNA、蛋白表达及GJIC功能虽比对照组降低,但较Cd组高(P<0.01)。结论黄芪甲苷对镉致TM3细胞Cx43表达下降及GJIC功能减退有明显的拮抗作用。

细胞缝隙连接通讯功能检测方法的研究进展

细胞缝隙连接通讯(GJIC)是细胞间重要的通讯方式之一,已在兽医学科的相关研究中得到广泛应用。目前对缝隙连接检测方法的应用和评议并不统一。本文从代谢偶联、电化学生理、染料偶联三个方面,介绍GJIC功能的检测方法和应用,并对各种检测方法在实际应用中所表现出优势和局限性进行了阐述和探讨,为缝隙连接通讯检测方法的选择和联合应用提供参考。

紫草素对Cx32蛋白组成的细胞缝隙连接功能的影响

目的探究紫草素对宫颈癌Hela细胞缝隙连接通讯功能(gap junctional intercellular communication,GJIC)和缝隙连接蛋白32(Cx32蛋白)表达水平的影响。方法将细胞分成两组培养,加多西环素为诱导组,不加多西环素为非诱导组,采用CCK-8(Cell Counting Kit-8)法检测不同浓度紫草素对Hela细胞毒性的影响;采用细胞接种荧光示踪法(parachute assay)观察不同浓度紫草素对缝隙连接(gap junction,GJ)功能的影响;采用蛋白免疫印迹法(western-blot)研究紫草素在影响GJ功能浓度范围内对Cx32蛋白表达的影响。结果紫草素在0~4μmol/L浓度时对非诱导组Hela细胞无毒性作用;紫草素在0~3μmol/L浓度时对诱导组Hela细胞无毒性作用;诱导组细胞在紫草素1~3μmol/L浓度时荧光传递量会随浓度增加;紫草素(1~3μmol/L)能浓度依赖性增强GJ功能及Cx32蛋白表达量。结论紫草素能够增强Cx32组成的细胞GJ功能,这种增强作用可能与其增加Cx32蛋白表达水平有关。