脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯功能影响的研究

本文用细胞内微注射法对不同强度的脉冲磁场对细胞缝隙连接通讯 (GJIC)功能的效应进行了研究 ,并与正弦磁场的作用以及脉冲磁场所感生的不同电场的作用进行了比较和探索。研究发现 0 .41mT以上强度的脉冲磁场具有抑制GJIC的作用 ,这种作用与磁场强度有关。其抑制GJIC的效应比正弦磁场为强。经相同磁场不同强度感应电场作用的比较 ,得出 ,GJIC的抑制主要由磁场引起 ,而与感应电场关系不大。

沙利度胺对前列腺癌PC-3细胞的增殖及细胞缝隙连接通讯的影响

目的:观察沙利度胺对前列腺癌PC-3细胞增殖和凋亡的作用及对PC-3细胞中Cx43表达水平的影响。方法:将处于对数生长期的前列腺癌PC-3细胞分别给予递增浓度的沙利度胺(0、12.5、25、50、100μg/mL)处理24 h和48 h。采用CCK-8法检测不同浓度沙利度胺对PC-3细胞的增殖抑制影响,Annexin V-FITC/PI双染色法检测细胞凋亡情况,RT-PCR法检测Cx43mRNA的表达及Westernblot检测Cx43蛋白的表达。结果:沙利度胺浓度在25～100μg/mL能明显抑制PC-3细胞体外增殖,随着时间、浓度增加,抑制率相应升高。不同浓度组沙利度胺处理PC-3细胞24～48 h后,Cx43 mRNA和蛋白有不同程度的升高(P<0.05)。结论:沙利度胺可通过抑制人前列腺癌PC-3细胞增殖、诱导其凋亡,产生抗肿瘤作用。沙利度胺可上调前列腺癌PC-3细胞Cx43mRNA及蛋白的表达水平,并可能促进前列腺癌PC-3细胞的细胞缝隙连接通讯功能的恢复,从而抑制肿瘤生长。

纳秒脉冲诱导肿瘤细胞缝隙连接通讯恢复的实验研究

将纳秒脉冲作用于人肝癌细胞(Hep-G2),通过荧光漂白恢复(FRAP)技术,检测荧光萃灭后肿瘤细胞的荧光强度变化情况,以研究纳秒脉冲对肿瘤细胞缝隙连接通讯(GJIC)功能变化的影响。经纳秒脉冲处理后,与对照组相比,处理组荧光恢复率显著增加,且随着时间的推移,所有处理组的荧光恢复率都达到对照组的3倍以上。此外,处理组肿瘤细胞的荧光漂白恢复率随脉冲个数的增加而升高。实验结果表明,纳秒脉冲促进了肿瘤细胞缝隙连接通讯功能的恢复,且在固定的脉冲宽度和幅值下,GJIC对纳秒脉冲作用的响应程度与施加的脉冲个数呈正相关。研究结果不仅为纳秒脉冲用于GJIC障碍性疾病的治疗提供了一条全新的途径,而且也深化了纳秒脉冲诱导肿瘤细胞凋亡机制的研究。

TGF-β1对大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白43介导缝隙连接通讯功能的影响

目的:观察转化生长因子TGF-β1对成年大鼠睾丸Leydig细胞间连接蛋白Cx43表达以及由Cx43介导的缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能的影响,旨在探讨TGF-β1对Leydig细胞的影响是否与其改变细胞间GJIC功能相关。方法:将原代培养纯化的Leydig细胞分为6组:实验组分别以1、2、5、10 ng/ml的TGF-β1处理细胞20 h,空白对照组以含10%胎牛血清的DMEM/F12培养液处理细胞,部分实验中以GJIC抑制剂甘珀酸(Carbenox-olone)处理细胞作为阳性对照组。采用免疫荧光法和Western印迹观察Cx43在细胞中的定位和表达变化,用荧光漂白恢复实验(FRAP)检测细胞间GJIC功能的改变。结果:Cx43表达呈斑点状散在分布于Leydig细胞的胞质和胞膜中,TGF-β1处理20 h后,Cx43在胞质中的表达强度随着TGF-β1浓度的增加较空白对照组明显增强,而其在胞膜中的表达则无明显改变。Western印迹结果显示磷酸化状态的Cx43随着TGF-β1浓度增加表现出较空白对照明显增强的趋势(P<0.05),而非磷酸化状态则无显著差异。FRAP结果显示经5 ng/ml TGF-β1作用20 h后细胞内荧光强度较空白对照明显减弱,具有显著性差异(P<0.01),且其平均荧光恢复率仅为(43.58±1.87)%。结论:TGF-β1可显著下调Leydig细胞间的GJIC功能,这种抑制作用可能通过增加其连接蛋白Cx43在细胞质中的表达,提高其磷酸化水平来实现。

纳米SiO_2颗粒对HL-7702细胞的毒性作用和缝隙连接通讯的影响

目的:探讨纳米二氧化硅(SiO2)颗粒对HL-7702细胞的毒性作用和细胞缝隙连接通讯(GJIC)的影响,为纳米SiO2体内外毒性的预测和安全性应用提供实验依据。方法:透射电镜(TEM)观察2种SiO2颗粒的粒径、分散性和形状;动态光散射法(DLS)检测SiO2颗粒在高纯水和培养液中的粒度分布;MTT法检测细胞存活率;乳酸脱氢酶(LDH)活力实验检测细胞膜完整性;划痕染料示踪技术检测GJIC。结果:透射电镜,2种SiO2颗粒呈圆形,大小均一,分散性良好,2种颗粒的粒径分别为(447.60±20.78)和(67.42±5.69)nm,分别为亚微米级和纳米级颗粒。动态光散射法,2种颗粒在高纯水和RPMI-1640培养液中的水合粒径分别为(684.37±18.76)、(697.02±19.57)nm和(128.31±7.64)、(133.74±8.97)nm,颗粒均未发生聚集,分散性良好。MTT法,2种SiO2颗粒作用细胞24h后,同一粒径的颗粒,随着浓度的增加,细胞存活率下降;同一浓度下,纳米颗粒比亚微米颗粒的毒性大。LDH活力实验,当作用细胞24h后,2种SiO2颗粒均能够损伤细胞膜,同一浓度下,纳米SiO2颗粒比亚微米颗粒对细胞膜的损伤能力大;同一粒径的颗粒,随着作用浓度的增加,细胞膜的损伤程度加重。划痕染料示踪实验,纳米SiO2颗粒可抑制GJIC,并且随着作用浓度的增加,抑制作用增强;而在相同浓度下,纳米SiO2颗粒比亚微米颗粒对GJIC的抑制作用更明显。结论:纳米SiO2颗粒能够对HL-7702细胞产生毒性作用,且抑制GJIC。

转染Cx43基因对人膀胱肿瘤细胞缝隙连接通讯及其生长变化的研究

目的:研究Cx43基因对膀胱癌细胞的缝隙连接通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)及其增殖的抑制作用,探索以Cx43基因治疗膀胱癌的可行性。方法:将含Cx43c DNA的质粒以脂质体介导转染Cx43表达缺失的BIU-87人膀胱癌细胞,通过原位杂交、RT-PCR和免疫组化染色检测Cx43m RNA及蛋白表达,划痕标记荧光染料示踪技术(SLDT)检测GJIC,MTT法测定细胞增殖率,TUNEL法检测细胞凋亡。结果:转染后BIU-87细胞有不同程度的Cx43 m RNA和蛋白表达及GJIC恢复。Cx43高表达的克隆细胞增殖明显下降,细胞凋亡并未增加。结论:Cx43基因及GJIC在膀胱癌的发生、发展过程中起重要作用,可能成为膀胱癌基因治疗的优选靶点之一。

吴茱萸次碱改善溶血性磷脂酰胆碱诱导的内皮细胞缝隙连接细胞间通讯功能障碍

目的探讨吴茱萸次碱(rutaecarpine,Rut)抗溶血性磷脂酰胆碱(LPC)损伤的内皮保护效应及对缝隙连接细胞间通讯功能(GJIC)的调节作用。方法在培养的人脐静脉内皮细胞(HUVEC),预先加入不同浓度的Rut(1.0、0.3、0.1μmol·L-1),处理10 min后加入LPC(10 mg·L-1)共同孵育24 h。应用辣椒素受体(TRPV1)竞争性拮抗剂CAPZ(10μmol·L-1)研究TRPV1是否介导Rut的保护效应。荧光定量PCR检测缝隙连接蛋白Cx37、Cx40的mRNA水平,Western blot检测Cx37和Cx40的蛋白水平,划痕负载试验测定GJIC功能。检测内皮细胞活力(MTT法)、活性氧(ROS)水平和细胞培养液中NO水平及单核细胞黏附,以评价内皮细胞损伤程度。结果 LPC明显下调HUVEC中Cx37和Cx40的mRNA和蛋白水平,抑制缝隙连接染料迁移。而Rut可明显恢复Cx37、Cx40的表达,改善GJIC功能,并减轻LPC诱导血管内皮损伤,表现为增加细胞活力和NO水平,抑制ROS生成和单核细胞黏附。预先给予CAPZ可取消这些效应。结论 Rut可抑制LPC诱导的内皮细胞损伤,恢复Cx37和Cx40的表达而改善GJIC,其机制与激活TRPV1有关。

N-6/N-3多不饱和脂肪酸不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响

目的观察n-6／n-3多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acid，PUFA）不同比例对乳腺癌细胞缝隙连接细胞通讯的影响。方法n-6／n-3PUFA不同比例（1～10）处理MCF-7（ER^＋）和MDA-MB-231（ER^-）乳腺癌细胞，采用免疫细胞化学观察细胞核Ki-67表达，Western blot检测细胞膜和细胞质缝隙连接蛋白Cx26、Cx43表达，划痕负载染料迁移法分析细胞缝隙连接通讯功能。结果免疫组化结果显示，单纯n-6和10：1n-6／n-3 PUFA增强两种乳腺癌细胞Ki-67表达（P〈0．05），5：1 n-6／n-3 PUFA虽无明显变化，但单纯n-3和1：1n-6／n-3 PUFA抑制细胞Ki-67表达（P〈0．01）。免疫印迹发现，单纯n-3和1：1n-6／n-3 PUFA能明显上调MCF-7细胞膜和细胞质的Cx26、Cx43蛋白表达，单纯n-6 PUFA却下调两种蛋白表达；在MDA-MB-231细胞，n-6／n-3 PUFA不同比例对膜和细胞质的Cx43蛋白表达与MCF-7细胞具有相同趋势，但对Cx26蛋白则无明显作用。用划痕负载染料迁移法却发现，n-6／n-3 PUFA不同比例对细胞缝隙连接通讯功能均无明显影响。结论单纯n-3和1：1n-6／n-3PUFA对MCF-7和MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖活性的抑制作用，可能是Cx26和Cx43蛋白通过独立于缝隙连接细胞通讯功能的调节所致。

人骨髓间充质干细胞缝隙连接通讯功能的研究

目的研究人骨随间充质干细胞(hum an m esenchym al stem cells,hMSCs)的细胞间缝隙连接通讯(gap junc-tional intercellu lar commun ication,G JIC)功能。方法透射电镜观察细胞缝隙连接结构,应用荧光光漂白恢复(fluorescencered istribution after photob leach ing,FRAP)技术,5,6-CFDA荧光负载hMSCs,激光淬灭细胞内荧光,通过激光共聚焦显微镜测定体外培养的hMSCs的G JIC功能。结果细胞内荧光被淬灭后可通过缝隙连接通道恢复,hMSCs平均荧光漂白恢复率为(35.26±0.76)%。结论缝隙连接是间充质干细胞间的重要通讯方式。

大肠癌细胞与血管内皮细胞间缝隙连接通讯的建立与功能检测

目的建立大肠癌细胞与血管内皮细胞间缝隙连接细胞通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)模型,探讨癌细胞与血管内皮细胞之间GJIC的变化在癌转移中的作用。方法采用细胞培养、免疫组化技术及激光漂白后荧光恢复技术,检测单独培养的内皮细胞及与不同转移能力的人大肠癌细胞系LoVo细胞、HT29细胞共培养之内皮细胞间缝隙连接细胞间通讯的状况。结果相邻接触的内皮细胞在激光漂白后出现荧光恢复现象,低转移能力的HT29细胞与内皮细胞共培养组荧光恢复明显减缓;高转移能力的LoVo细胞与内皮细胞共培养组荧光恢复更慢([25.68±15.74)%和(15.13±7.76)%,P<0.05]。结论大肠癌细胞与血管内皮细胞黏附后,其间的缝隙连接细胞间通讯减少,并且高转移能力的LoVo细胞与血管内皮细胞间的缝隙连接通讯减少尤其明显。肿瘤细胞与血管内皮细胞粘附后,其间的缝隙连接细胞间通讯发生改变,与恶性肿瘤的转移特性密切相关。

高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯的影响

【目的】研究高糖对人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞通讯活性(GJIC)的影响。【方法】将人晶状体上皮细胞(SRA01/04)培养于正常葡萄糖浓度(5.5mmol/L),传代时将其接种于16个35mm的培养皿中,实验分为4组(每组4个培养皿):正常糖浓度组(培养基葡萄糖含量是5.5mmol/L)、高糖组(培养基葡萄糖含量是30mmol/L)、佛波酯(TPA)组(阳性对照)及二甲基亚砜(DMSO)组(阴性对照)。当细胞生长至90%融合时,用划痕荧光染料示踪技术(SL/DT)检测其缝隙连接细胞间通讯活性。【结果】在高糖培养的人晶状体上皮细胞划痕荧光黄向两侧传递的细胞列数为2.23±0.33,明显少于正常糖浓度培养的人晶状体上皮细胞(3.75±0.57,P<0.01)。TPA显著抑制晶状体上皮细胞的GJIC,与正常糖浓度组比较差异具有显著性(1.65±0.26vs3.75±0.57,P<0.01)。【结论】人晶状体上皮细胞缝隙连接细胞间通讯活性在高糖中受到抑制,可能在糖尿病晶状体渗透水肿和离子代谢紊乱中发挥作用。

大肠癌细胞间缝隙连接通讯与E-钙粘素的检测

目的 定性检测大肠癌组织缝隙连接蛋白 (Cx4 3)与E 钙粘素 (E Cad)的表达 ;定量测定正常上皮与大肠癌细胞间缝隙连接通讯 (GJIC)。方法 鼠大肠癌与对照组织中Cx4 3和E Cad的表达用免疫组化法检测 ;GJIC用荧光漂白恢复法检测。结果 大肠癌Cx4 3和E Cad阳性率 (40 % ,4 3% )明显低于对照组织(90 % ,87% ) ,33%肿瘤标本二者皆不表达 ,该组肿瘤的分化度也较差 ;大肠癌细胞HR ,Lovo ,HT 2 9间GJIC明显低于正常上皮细胞。结论 在鼠大肠上皮细胞恶变过程中伴有Cx4 3与E Cad的表达抑制或缺失与大肠癌的发生发展有关。

吴茱萸碱对大鼠肝癌细胞缝隙连接细胞通讯功能及连接蛋白表达的影响

目的探讨吴茱萸碱抗肿瘤的作用机制。方法用终浓度为0.1,0.2,0.3μmol/L的吴茱萸碱作用于CBRH7919细胞,同时设不加吴茱萸碱的空白对照组。采用划痕标记染料示踪技术检测各组细胞缝隙连接细胞通讯(gap junctional intercellular communication,GJIC)功能;异硫氰酸荧光素间接免疫荧光法检测连接蛋白(connexin,Cx)26、Cx32表达的变化。结果与空白对照组相比,吴茱萸碱各浓度组CBRH7919细胞Cx26、Cx32表达显著增加,GJIC功能增强,并呈一定的剂量效应依赖关系。结论吴茱萸碱上调CBRH7919细胞Cx26和Cx32的表达及促进CBRH7919细胞的GJIC功能,可能是其抗肿瘤的机制之一。

连接蛋白/缝隙连接细胞间通讯对大鼠肝卵圆细胞增殖调控作用

背景:缝隙连接蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯(gap junction intercellular communication,GJIC)是细胞间最重要的信息交流形式。目的:验证CX/GJIC对卵圆细胞的增殖调控作用。方法:Wistar大鼠分为4组。对照组正常饮食;2-AAF/PH组按改良Solt-Farber法建立卵圆细胞增殖动物模型;苯巴比妥组予以苯巴比妥饮水7d,第8天按2-AAF/PH组建模,苯巴比妥饮水持续至实验结束;三七总皂苷组按2-AAF/PH组建模时予以三七总皂苷25mg/(kg?d)腹腔内注射,并持续实验结束。结果与结论:造模后肝脏连接蛋白呈时空特异性表达,先下调后逐渐恢复,连接蛋白43表达于卵圆细胞,先升高后逐渐恢复;采用苯巴比妥改变大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32、连接蛋白43时空表达模式后,可下调肝脏的GJIC,减少卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,解除卵圆细胞生长抑制,促进卵圆细胞的增殖;三七总皂苷可以增加大鼠2-AAF/PH模型肝脏的连接蛋白32表达、滞后连接蛋白43的表达,增加卵圆细胞与偶联细胞间GJIC,使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长;通过下调大鼠2-AAF/PH模型肝脏的GJIC,可使卵圆细胞增殖早、增殖水平高;上调GJIC使卵圆细胞增殖峰低、滞后、持续时间长,CX/GJIC可以调节体内卵圆细胞的增殖、分化过程。

三七皂甙对急性肝功能衰竭大鼠肝细胞缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯的影响

目的从细胞间缝隙连接通讯的角度,探讨三七皂甙(panaxnotoginsengsaponins,PNS)在急性肝功能衰竭(AHF)修复中的作用及机制。方法雄性Wistar大鼠200只(SPF级,江西省实验动物质量检测中心提供),体重180～200g,适应性喂养1周,随机分成3组:对照组(n=30),模型组(n=100),三七皂甙组(PNS组,n=70)。模型组和PNS组采用四氯化碳腹腔注射法建立AHF模型,分别在造模后1、3、7、10和14d5个时间点开腹,采取肝组织行免疫组化检查Cx32、切开标记荧光染料传输(IL/DT)查GJIC功能。结果动物在造模后立即出现精神萎靡、活动及摄食减少、嗜睡,严重者有全身多脏器出血、昏迷甚至死亡。PNS组与模型组的病死率差异有显著性P(<0.05)。Cx32的免疫组化显示,造模初期PNS组的Cx32分布及数量与模型组相似,随着时间的推移,数量呈进行性增加的趋势。荧光染料传输发现,模型组的染料传输能力在造模后比对照组明显减低(P<0.01),并在第3天达到最低程度,此后虽逐渐恢复,但到第14天与对照组间差异仍有极显著性(P<0.01);PNS组的染料传输在造模后第1天比对照组明显减低(P<0.01),程度与模型组相仿(P>0.05),但与模型组不同的是PNS组在第3天由荧光染料传输所反映的GJIC功能已经开始恢复,与模型组相比差异有极显著性(P<0.01),到第14天恢复正常,与对照组间差异无显著性(P>0.05)。结论PNS可以上调AHF大鼠肝细胞间的CX/GJIC,从而加快损伤中后期肝细胞间的信息交流,促进肝脏细胞的增生及肝组织结构的重建。

大鼠肝脏缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯在急性肝功能衰竭不同阶段的表达

目的研究缝隙连接蛋白/细胞间缝隙连接通讯(CX/GJIC)在急性肝功能衰竭(AHF)大鼠肝脏不同阶段的变化规律。方法雄性Wistar大鼠30只为对照组,选择造模后成活的同种大鼠30只为模型组,分别在造模后1、3、7、10、14d5个时间点开腹,采取肝组织行免疫组化、切开标记荧光染料传输(IL/DT)和RT-PCR检查。结果(1)模型组肝组织Cx32较对照组明显减少,并随时间延长呈进行性增加的趋势。(2)模型组的荧光染料传输能力比对照组显著减低,差异有高度统计学意义(P<0.01),此后虽逐渐恢复,但第14天与对照组间的差异仍有高度统计学意义(P<0.01)。(3)模型组Cx32mRNA转录在前3d明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05)。结论大鼠肝细胞间的CX/GJIC在急性肝功能衰竭早期呈现下调现象,此后逐步恢复。

全反式维甲酸对脑胶质瘤细胞缝隙连接细胞间通讯功能的影响

目的 观察大鼠脑胶质瘤C6细胞缝隙连接细胞间通讯(GJIC)功能,并研究全反式维甲酸(ATRA)对C6 细胞GJIC功能的影响。方法 (1)全反式维甲酸(ATRA)上调C6胶质瘤细胞GJIC功能;(2)划痕荷载染料传输 实验(SLDT)检测C6细胞ATRA处理前、后的细胞GJIC功能强弱;(3)光学显微镜观察ATRA处理前、后的细胞 形态学变化。结果 (1)C6细胞GJIC功能低下;(2)ATRA上调C6胶质瘤细胞GJIC功能;(3)上调C6胶质瘤细 胞GJIC功能后细胞增殖受到抑制。结论 (1)ATRA是C6细胞GJIC功能上调剂之一;(2)GJIC功能强弱可影响 肿瘤细胞增殖。

缝隙连接细胞间通讯在炎症、损伤修复和疾病中的作用

缝隙连接是相邻细胞间的通道结构,其主要功能是细胞通讯,又称缝隙连接细胞间通讯。缝隙连接细胞间通讯是细胞间最重要的信息交流形式,可调节组织细胞的生长、分化,在组织保持内稳态中处于核心地位。本文就缝隙连接细胞间通讯在炎症、损伤修复和疾病中的作用等方面作一综述。