小鼠粗线期精母细胞钙离子通道膜片箝方法的建立

应用机械分离获得小鼠单个精母细胞 ,采用全细胞膜片箝技术记录 Ca2 +离子通道电流。结果表明 :1阻断 K+电流后 ,当钳制电位 - 90 m V、指令电压 - 6 0～ + 10 m V、步阶电压 10 m V时 ,可记录到内向电流 ;2内向电流在 - 30～ - 40 m V达到最大值 ;3在细胞外液中加入 4 μmol/ L TTX,对记录电流无影响 ,表明此电流不含有 Na+电流成分 ,为 Ca2 +电流。

骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的离子通道:是否有电生理特性?

背景:以往研究证实,骨髓间充质干细胞经体外诱导先分化为神经干细胞,然后分化为神经样细胞,但是对于分化的神经样细胞是否具有电生理特性尚不明确。目的:观察骨髓间充质干细胞诱导分化为神经样细胞的离子通道是否具有电生理特性?设计、时间及地点:观察性实验,于2005-03在华中科技大学同济医学院附属同济医院神经内科实验室完成。材料:4周龄Wistar大鼠37只,雌雄不拘,体质量150g左右。方法:取Wistar大鼠股骨和胫骨,进行骨髓间充质干细胞原代培养,传至第15～20代融合状态的间充质干细胞置于预诱导培养基中培养24h后,换用诱导培养基。在倒置显微镜下连续观察间充质干细胞的形态变化,分别采用免疫组织化学和Western Blot对未经诱导分化的间充质干细胞和诱导后第3天的间充质干细胞进行检测。利用电生理膜片箝技术检测50个骨髓间充质干细胞诱导分化后的神经样细胞。主要观察指标:记录到的钾电流、GABA电流。结果:①诱导分化前呈梭形细胞,在加入预诱导培养基后未出现明显的形态变化,换用诱导培养基1h,胞体开始收缩,出现少数较小的卵圆形或纺锤形细胞,诱导24h后,约60%细胞变成双极形、多极形和锥形,出现类似神经元细胞的形态。②免疫细胞化学检测未经诱导分化的间充质干细胞无NeuN、Nestin、GFAP表达,诱导分化后第3天的间充质干细胞NeuN表达明显增强,有Nestin表达,无GFAP表达。③Western Blot检测在未诱导分化时和预诱导24h,无NeuN、Nestin表达,Nestin表达在诱导分化后6h呈强阳性,在诱导分化24h和48h逐渐减弱。NeuN在诱导分化后6h有表达,在诱导分化后24h和48h表达增强。④在检测的50个细胞中,共有25个细胞检测到ATP电流(50%)、GABA电流13个(26%)、总钾电流46(92%)、复极化钾电流46(92%)。结论:在诱导分化的神经样细胞上存在功能性离子通道,具有电生理特性。

P物质抑制培养大鼠海马大锥体细胞GABA-激活电流

研究主要探讨P物质 (SP)对GABA 激活电流的调制。实验在培养的新生大鼠海马大锥体细胞上进行 ,应用全细胞膜片箝技术记录GABA激活的内向电流。在被检的大锥体细胞中 ,有 72 % (6 6 / 92 )的神经元对GABA和SP同时敏感。预加SP后 ,GABA激活电流明显地被抑制 ,此抑制作用是呈剂量依赖性的 ,在预加 10 -8、10 -7、10 -6、10 -5mol/LSP后 ,GABA的激活电流分别降低 18%、2 4 8%、2 5 9%和 2 8%。用SP的拮抗剂spantide能阻断此种抑制作用 ,在电极中灌注H7(PKC抑制剂 )能取消此抑制作用。上述结果提示 :SP对GABA激活电流的抑制作用是SP作用于SP受体 ,通过胞内第二信使 ,使GABAA

P物质对GABA_A受体介导电流的作用

应用全细胞膜片箝技术,在大鼠新鲜分离的背根神经节细胞上观察到:SP对GABA激活电流有调制作用。实验结果表明:多数受检的大鼠背根神经节神经元对SP(28/41,68.5％)和GABA(36/41,88.2％)敏感,100μmol/LSP和100μmol/L GABA激活内向电流的幅值分别为243.8±82.7pA(x±s,n=9)和1.76±0.48nA(x±s,n=13)。GABA与SP激活的内向电流明显不同,前者具有明显的去敏感现象。实验预加SP(0.001～1μmol/L)30s后再加GABA,则GABA激活电流的幅值明显减小,而且GABA激活电流减小的程度与预加SP的浓度呈量效依赖关系。SP主要抑制GABA激活电流的峰电流,对其稳态电流的抑制不明显。预加0.1μmol/L SP之后约4min左右,SP对GA-BA激活电流的抑制效率最大,为49.8±7.2％(x±s,n=7,P≤0.01),而预加SP 12min之后,SP才失去对GABA激活电流的抑制作用。

缓激肽抑制大鼠DRG分离神经元的GABA激活电流

本文应用全细胞膜片箝技术在新鲜分离的大鼠背根神经节（DRG）神经元上研究缓激肽（BK）对γ-氨基丁酸（GABA）反应的调制作用。结果发现：在34个对GABA反应的细胞中有31个细胞对BK敏感。在对BK敏感并引起内向电流的27个细胞中预加BK，对GABA-激活电流具有明显的抑制作用，如10-6mol／L的BK可抑制GABA（10-4mol／L）激活电流30％。BK可将GABA量效曲线明显下移，并抑制其最大反应达1／3以上，而不改变其Kd值。结果提示：BK能非竞争性地抑制GABA反应。

背根神经节神经元胞体膜可能存在NMDA自身受体(英文)

应用经酶和机械消化分离的大鼠背根神经节（ＤＲＧ）神经元进行实验。首先运用全细胞膜片箝技术找到ＮＭＤＡ可引起一内向电流的神经元，此内向电流可被甘氨酸明显增强，并被ＮＭＤＡ受体的特异性拮抗剂ＡＰＶ完全阻断。随后，把经电生理技术证实膜上存在ＮＭＤＡ受体的这一ＤＲＧ神经元用微吸管转移到载玻片上，进行谷氨酸神经递质免疫组织化学检测。１０／１８的ＤＲＧ细胞呈免疫反应阳性，结果为ＤＲＧ神经元膜上存在ＮＭＤＡ自身受体提供了新证据。