细胞致死膨胀毒素研究进展

细胞致死膨胀毒素(CDT)是细菌毒素家族的一种蛋白毒素,是多种革兰氏阴性菌的重要毒力因子,如空肠弯曲菌、幽门螺杆菌、伴放线杆菌等。该毒素的致病机理是通过破坏靶细胞DNA造成细胞损伤,最终导致细胞的分裂周期停滞甚至死亡。论文主要总结了近几年来细胞致死膨胀毒素的相关研究,对其结构、生物学功能、转运机制及应用前景等研究进展进行总结及讨论,旨在为该毒素的相关研究提供一定参考。

伴放线放线杆菌产生的细胞致死膨胀毒素及其与牙周病的关系

伴放线放线杆菌能产生一种热不稳定蛋白——细胞致死膨胀毒素。该毒素主要由三个相邻的基因编码,分别为cdtA,cdtB,cdtC,对应的蛋白产物分别是CDTA,CDTB,CDTC,它们构成三聚体的全毒素。它能引起细胞体积膨胀,使细胞停滞在G2/M周期而不能进入分裂期,通过线粒体途径导致淋巴细胞凋亡,诱导细胞因子的合成和分泌。由于该毒素具有多种细胞毒性,在牙周炎的发生发展中可能具有重要的致病作用。

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素的细胞毒性研究

本研究旨在原核表达副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素(Cytolethal distending toxin,CDT),并作用于猪髋动脉内皮细胞(Pig iliac endothelial cells,PIEC),以研究其细胞毒性。根据本实验室完成的副猪嗜血杆菌SH 0165株(血清5型)全基因组序列,针对cdtA、cdtB和cdtC基因序列设计引物,扩增的基因片段大小分别约为681、834和531bp。将靶基因克隆到原核表达载体pET28a中,再转化到E.coli BL21(DE3),IPTG诱导表达3h,SDS-PAGE和Western blot检测证实表达产物以包涵体形式存在,大小分别约36、34和28ku。通过体外重构毒素与PIEC细胞作用3h,继续培养72h观察细胞形态学变化。结果表明,CdtABC全毒素致PIEC细胞膨胀、空泡形成、细胞凋亡等,而其他试验组变化不显著。结果提示,CDT毒素可能在细菌感染与致病中发挥着重要作用。

副猪嗜血杆菌细胞致死膨胀毒素各亚基处理PK-15细胞的基因表达谱分析

为研究副猪嗜血杆菌(H.parasuis)细胞致死膨胀毒素(CDT)各亚基(Cdt A、Cdt B和Cdt C)的相关生物学功能,本研究采用基因芯片技术对以CDT各亚基处理的PK-15细胞基因表达谱进行检测和分析。通过比较各亚基处理细胞与空白对照细胞基因表达谱的检测结果显示,Cdt A、Cdt B和Cdt C作用PK-15细胞后,处理细胞中分别有91个基因、126个基因及135个基因出现差异表达变化。根据芯片结果选取变化较显著的基因进行荧光定量RT-PCR验证,结果与基因芯片检测结果基本一致。基因注释(GO)分析表明,这些蛋白分别参与免疫系统调节、生物调控、代谢过程和定位等过程。本研究结果为进一步研究CDT的致病作用机制奠定了基础。

副猪格拉瑟菌5型细胞致死性膨胀毒素CdtB破坏猪呼吸道上皮屏障的机制

旨在探究副猪格拉瑟菌(Glaesserella parasuis,GPS)突破猪呼吸道上皮屏障引起系统性感染的机制。通过超速离心和密度梯度离心提取副猪格拉瑟菌外膜囊泡(outer membrane vesicles, OMVs),OMVs经SDS-PAGE显示,蛋白质条带分布在55~100 ku,经透射电子显微镜(TEM)观察,OMVs的粒径在100~200 nm,纳米粒子直径分析(NTA)结果显示,样品在100~200 nm处的粒子数目最多。进而用制备的HbpA及OmpP2多克隆抗体对OMVs及不含OMVs的细菌上清进行Western blot验证,证实所提取的样品为外膜囊泡,且进一步结果证明细胞致死性膨胀毒素(CDT)在GPS培养物中主要以OMVs的形式存在。用OMVs或CdtB处理猪气管上皮细胞(swine tracheal epithelial cells, STEC)36 h,检测STEC中cleaved-caspase3、ZO-1和Occludin的蛋白表达水平,并用FITC-葡聚糖(FD-4)检测STEC单层细胞的细胞旁通透性。结果发现,OMVs与CdtB处理后凋亡相关蛋白cleaved-caspase3表达水平升高,ZO-1和Occludin的表达水平降低,FD-4渗透率升高,同时,乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试验发现,当CdtB与STEC单层细胞共孵育24 h、OMVs与STEC单层细胞共孵育36 h后,STEC存活率显著降低。而Pifithrin-α预处理STEC可抑制OMVs和CdtB引起的细胞凋亡和屏障通透性的增加。另外,用免疫磁珠捕获的方法去除OMVs中的CdtB(OMVs-ΔCdtB),OMVs-ΔCdtB处理STEC 36 h后cleaved-caspase3、ZO-1、Occludin表达水平与对照组相比无显著差异。综上,成功提取并纯化GPS OMVs,且试验证明GPS可通过OMVs转运CdtB诱导STEC凋亡和屏障损伤,为副猪格拉瑟菌突破呼吸道上皮屏障的机制提供新思路。

伴放线聚集杆菌细胞致死性膨胀毒素介导人T淋巴细胞凋亡的实验研究

目的通过研究伴放线聚集杆菌(aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.actinomycetemcomitans)的一种毒力因子细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)诱导人T淋巴细胞发生凋亡过程中表达改变的相关基因,探索其凋亡过程中可能存在的相关信号调节通路,寻找侵袭性牙周炎诊断、治疗潜在的生物标记分子。方法通过透射电镜和流式细胞仪检测细胞凋亡的情况,荧光定量PCR检测CDT蛋白作用于人T淋巴细胞后凋亡相关基因表达的改变。结果 CDT蛋白作用于人T淋巴细胞24 h后,处理组细胞凋亡比例约为29.1%,对照组约为6.3%,透射电镜观察到典型的凋亡细胞的形态,如细胞体积缩小、染色质浓缩及边集等现象。荧光定量PCR结果显示促凋亡基因GADD45A、TNFSF8、TRADD、TNFRSF10B和TP53表达升高。结论伴放线聚集杆菌CDT可以促进人T淋巴细胞的凋亡,在这一过程中相关的促凋亡基因表达增加。

伴放线放线杆菌细胞致死性膨胀毒素研究进展

伴放线放线杆菌产生一种毒性蛋白成分——细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)。该毒素由3个相邻基因cdtA(669 bp)、cdtB(852 bp)、cdtC(561 bp)编码的蛋白亚基CdtA(28 000 Da)、CdtB(32 000 Da)、CdtC(20 000 Da)组成异源三聚体全毒素。CDT引起细胞膨胀,导致细胞周期阻滞,抑制细胞增殖,还能诱导淋巴细胞凋亡,影响宿主免疫功能,诱导细胞因子分泌等,在牙周病的发生发展过程中发挥至关重要的作用。本文就伴放线放线杆菌CDT各亚基及其致病机制作一综述。

细胞致死性扩张毒素和外膜蛋白的结构功能和致病机制

伴放线放线杆菌是青少年牙周病的主要致病菌,与侵袭性牙周炎密切相关。伴放线放线杆菌细胞致死性扩张毒素(CDT)和外膜蛋白(OMP)等毒力因子使其更易定植到宿主体内,破坏宿主的免疫调节,从而进一步引起牙周组织破坏和加速牙周病的进展。本文主要就CDT和OMP毒力因子目前的结构功能及致病机制作一综述,以期对其深入研究有所帮助。

基于iTRAQ技术的伴放线聚集杆菌细胞致死性扩张毒素诱导Jurkat细胞的凋亡研究

目的探索伴放线聚集杆菌(Aggregatibacter actinomycetemcomitans,A.a)的一种毒力因子(cytolethal distending toxin,CDT)诱导人T淋巴细胞发生凋亡过程中表达改变的信号分子。方法培养Jurkat细胞,并进行分组:不做处理的正常细胞对照组、野生型A.a CDT刺激Jurkat细胞的野生组、突变型A.a CDT刺激Jurkat细胞的突变组,应用i TRAQ技术检测A.a CDT作用Jurkat细胞24 h过程中表达差异蛋白。结果通过筛选,我们得到20个凋亡相关的蛋白(变化倍数>1.3),其中表达上调的有8个(CASP8/CD3E/YY1/SH3BGRL3/P53/CASP3/UBE2I/TNFRSF10B),表达下调的有12个(F5/RPL18A/DAD1/MTCH2/HIST1H1E/CNBP/RBM25/SLC16A1/KDM2A/CD99/RAC2/TMX1)。结论本研究检测出了伴放线聚集杆菌细胞致死性膨胀毒素诱导人T淋巴细胞凋亡过程中表达差异的蛋白,并筛选了一条可能的信号通路UBE2I/P53/TNFRSF10B/CASP8/CASP3,为下一步研究及临床治疗局限型侵袭性牙周炎提供思路。

细胞致死性膨胀毒素损伤宿主防御机制研究进展

细胞致死性膨胀毒素(cytolethal distending toxin,CDT)属于AB_(2)毒素,由多种革兰氏阴性菌产生。CDT是第一种被描述的细菌基因毒素,编码3种多肽:CDTA、CDTB和CDTC。CdtB是活性部分,有损伤多种细胞类型的能力。CDT具有一种新的分子作用模式,会干扰真核细胞周期的进展,从而导致G2/M停滞和细胞凋亡,该作用机制针对细胞,而且现阶段对于CDT的研究更多也是细胞层面,但是CDT作为毒力因子最终作用是损伤宿主造成疾病。但目前对CDT与宿主相互作用的分子机制了解尚不清晰。本文对细胞致死性膨胀毒素作为毒力因子从损伤上皮屏障、适应性免疫以及促进炎症反应三方面来综合阐述其对宿主防御机制途径的损伤,以期了解其致病机制以及为其临床治疗提供理论依据和新思路。

伴放线放线杆菌细胞膨胀致死毒素重组蛋白的表达

目的通过分子克隆技术构建细胞膨胀致死毒素（cytolethaldistendingtoxin，CDT）的重组表达载体，并诱导重组CDT蛋白的表达，以期为重组CDT蛋白的生物学功能研究奠定基础。方法采用聚合酶链反应（PCR）扩增获得CDT的编码基因cdtABC，通过TA克隆和限制性酶切将cdtABC与目的载体pQE60连接，转化感受态大肠杆菌后诱导重组CDT蛋白的表达，收集细菌总蛋白进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳和蛋白质印迹法鉴定。结果pQE60-cdtABC转染的感受态大肠杆菌中均携带cdtABC基因，该片段与GenBank中的DNA一致性高达99％。细菌总蛋白中21000、25000、32000左右的蛋白增多，蛋白质印迹法检测发现带有6-His标记的目的蛋白。结论本研究成功构建了CDT的重组表达载体，并诱导重组CDT蛋白的表达。

正畸过程中伴放线菌聚集杆菌的检测及其毒力因子细胞致死性膨胀毒素的研究

目的建立PCR方法对正畸治疗患者口腔中的伴放线菌聚集杆菌(Aa)及毒力因子细胞致死性膨胀毒素进行检测,并与牙龈指数进行相关性分析。方法 选择55例戴入矫治器后产生牙龈炎性反应患者为矫治组,34例未带矫治器的牙周健康者为对照组,49例口腔内科就诊的成人牙周炎患者为成人牙周炎组。记录牙龈炎症指数,用无菌纸尖法分别采集牙周袋最深处及龈沟内液标本进行细菌DNA提取及PCR反应。结果以16S rDNA引物PCR扩增138例患者临床标本,共扩增出Aa 44株;其中正畸治疗组29株;对照组5株;成人牙周炎组10株。用Spearm an等级相关分析矫治组Aa检出率与牙龈指数G I之间存在明显的正相关关系(P<0.01)。矫治组Aa的检出率明显高于牙周炎组和对照组(P<0.01);而牙周炎组与对照组之间的Aa检出率无明显差异(P>0.05)。44例PCR扩增阳性的患者平均年龄为16.23岁,而Aa阴性的患者年龄平均为38.73岁,二者具有明显差异(t=3.598,P<0.01)。以CDT引物直接扩增44例Aa16S rDNA阳性的临床标本中的CDT基因片段,13例为阳性,其阳性率为29.54%,其中扩增出667bp的CDT1型3例,扩增出1893bp的CDT2型10例。结论 Aa在青少年患者尤其在带矫治器的青少年患者发病中起到重要的作用,但对成人牙周炎的致病不起主要作用。CDT扩增产物有两种,但检出数量较少,还有待于进一步研究。

新肠道菌毒素CLDT的初步研究

本文报道对一种新的细胞膨胀致死毒素(CytolethalDistending Toxin)实验研究结果。实验证明,CLOT 能使敏感细胞 CHO,Vero,HeLa 产生扩展、膨胀为形态学特征的病变,对 Y—1细胞不产生病变,因而能与巳知大肠杆菌肠毒素 LT、VT 等相鉴别。应用组织培养细胞检测肠杆菌的 CLOT 毒素,在大肠杆菌属、志贺氏菌属及弯曲菌属均可检出。大肠杆菌检出5株(5/257),血清型为 O_(50):NM 和 O_(86):H_(34);志贺氏菌属14株(14/14),血清型为痢疾志贺氏 A_2型和鲍氏7型;弯曲菌属13株(13/20),包括空肠弯曲菌、胎儿弯曲菌及 CNW 三个种。

副猪嗜血杆菌CDT三顺反子的表达、组装及生物学活性

副猪嗜血杆菌是猪的常见病原菌,以异源三聚体形式分泌到胞外环境的细胞致死性膨胀毒素(CDT)是该菌重要的毒力因子,制备完整的重组CDT对于其功能研究至关重要。本研究构建了可用于同时表达CDT 3个亚基的三顺反子重组质粒,优化了完整毒素三聚体的体外组装及纯化方法,并验证了重组三聚体毒素的生物学活性。结果显示,CDT 3个亚基以CdtA/CdtB/CdtC-his方式组合时,按0.1 g/L等体积混合,在PBS中以尿素浓度梯度透析时组装效果最好。构建的重组三顺反子质粒在大肠杆菌中可以同时表达出比例相当的3个CDT亚基,并且均以包涵体形式存在,经包涵体离心粗纯化后,即可用于重组三聚体CDT的组装。组装的三聚体CDT经亲和层析及分子筛层析纯化,得到高纯度的完整毒素。完整毒素可以引起Marc145细胞体积明显膨胀,且分裂周期停滞于G2/M期的细胞比例显著增加。结果表明,本研究建立了一种简单有效的副猪嗜血杆菌重组CDT完整毒素制备方法,所制备的CDT具有良好的生物学活性。

临床分离胥伐成格隆沙门菌的抗菌药物敏感性和毒力基因研究

目的：研究临床分离胥伐成格隆沙门菌的抗菌药物敏感性和毒力基因特征,为防治感染和了解其流行趋势提供依据。方法收集2014年5月至10月我院肠道门诊急性腹泻患者的临床资料,采集患者粪便标本进行沙门菌分离培养、生化鉴定、血清型分型,对鉴定得到的胥伐成格隆沙门菌进行抗菌药物敏感性检测、脉冲场凝胶电泳（PFGE）分型和多位点序列分型（MLST）,PCR扩增沙门菌毒力岛SPI1-5代表性基因和调节基因、毒力质粒基因和细胞致死膨胀毒素（ CDT ）基因,对cdtB、pltA和pltB的扩增产物进行序列分析。结果共检测到108株非重复非伤寒沙门菌,其中16株（14.8%）为胥伐成格隆沙门菌。16株胥伐成格隆沙门菌对氟喹诺酮、氨苄西林、头孢曲松、复方新诺明等11种常用抗菌药物敏感率为100%,PFGE分型结果为A克隆14株、B克隆1株和C克隆1株, A克隆中有8例患者有明确的共同饮食来源,提示为感染暴发；16株胥伐成格隆沙门菌MLST分型均为ST241型,SPI1-5代表性基因invA、sitC、hilA、sseL、sifA、mgtC、siiE、sopB和调节基因phoP以及CDT基因cdtB、pltA和pltB均阳性,毒力质粒基因pefA、prot6E、spvB均为阴性；本研究中的胥伐成格隆沙门菌CDT基因与伤寒沙门菌相应基因的DNA和氨基酸序列相似均大于97%。结论本研究分离到多克隆ST241型胥伐成格隆沙门菌临床株,虽对常用抗菌药物尚保持敏感,但携带SPI1-5毒力基因和伤寒毒素CDT基因,应关注胥伐成格隆沙门菌临床感染在我国的变化趋势和危害,开展持续监测和研究。