细胞色素氧化酶P4502C19基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ对下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄的预测价值

目的探讨细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)对下肢动脉硬化闭塞症(ASO)介入术后再狭窄的预测价值。方法收集2017年1月至2021年5月于绵阳市第三人民医院行介入治疗的146例ASO患者的临床资料,根据随访期间再狭窄发生情况将其分为再狭窄组(n=27)和无再狭窄组(n=119)。收集患者性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、心脑血管病史、高同型半胱氨酸病史、病变血管支数、术前狭窄情况、支架植入情况、纤维蛋白原水平、总胆固醇水平、红细胞计数、CYP2C19基因多态性、HCⅡ活性,分析ASO介入术后再狭窄的影响因素。结果有吸烟史、支架植入、CYP2C19慢代谢型及HCⅡ活性均为ASO支架植入术后发生再狭窄的独立危险因素(P﹤0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线结果显示,HCⅡ活性预测ASO支架植入术后再狭窄的截断值为95.80%,曲线下面积(AUC)为0.809(95%CI:0.719~0.900),灵敏度为74.80%,特异度为88.24%,Kappa=0.566。CYP2C19基因多态检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为66.67%,特异度为89.07%,Kappa=0.537。联合检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为96.30%,特异度为86.55%,Kappa=0.682。结论ASO介入术后再狭窄与吸烟史、支架植入情况、CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性有关,CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性检测均可用于预测ASO介入术后再狭窄,但联合检测可提高其诊断效能。

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查 2 5例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况 ,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病 (AD)性老年痴呆发生发展的关系。 方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板 ,进行巢式PCR扩增 ,最后采用DNA序列分析鉴定突变。 结果 在正常老人组 ,只扩增了 2 80bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因 (COX2 )扩增片段 ,而在老年痴呆患者中出现了 4 6 4bp和 2 80bp的多态性扩增片段 ,并且发现了 1个 32 0bp的新的线粒体DNA缺失片段 ,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象 ,COX2基因的 1条单链在np75 0 3处断裂 ,另 1条单链在np7785处断裂 ,这两个断裂的游离片段通过插入 1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。 结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。

核因子κB亚基65及细胞色素C氧化酶-Ⅱ在大鼠急性肝衰竭模型中的变化及意义

目的观察核因子κB亚基65(nuclear factor-κB,NF-κB p65)及细胞色素C氧化酶-Ⅱ(cytochrom eCoxidase-Ⅱ,COX-Ⅱ)在大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)模型中的变化。方法 Sprague-Dawley雄性大鼠40只随机分为5组:对照组、ALF4h组、ALF8h组、ALF12h组和ALF24h组。ALF组采用D-氨基半乳糖(800mg/kg)和脂多糖(100g/kg)联合腹腔注射构建ALF模型,对照组注射同等体积的0.9%氯化钠溶液。分别检测各组的ALT、AST、TBIL、ALB、PT、PTA及观察各时间点肝脏病理变化;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏内NF-κBp65的mRNA水平,分光光度法检测各组大鼠肝脏线粒体中的COX-Ⅱ活性。结果光镜结果显示,ALF8h组可见明显肝细胞凋亡,而12h组和24h组可见明显肝细胞坏死。ALF组中8h、12h及24h肝脏NF-κBp65的mRNA水平明显低于对照组(P均<0.001),24h最低。COX-Ⅱ的活性在ALF4h开始升高,8h达到高峰(与对照组比较,P=0.008),12h开始下降,24h下降更为明显。结论 ALF大鼠肝脏NF-κBp65的mRNA水平降低,肝脏线粒体COX-Ⅱ活性在凋亡阶段升高,后期降低。二者均参与了ALF中肝细胞凋亡的发生,同时NF-κBp65还可能抑制了ALF过程中肝细胞的再生。

益气活血中药复方对CVB_3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ表达的影响

目的:研究益气活血中药复方调控CVB3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochromeC oxidase subunitⅠ)及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ)表达的作用机制。方法:本实验用Wistar大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3(CVB3)感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆受CVB3攻击的宿主细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因。结果:细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ在中药组中呈高表达,病毒组中表达减弱或被抑制。结论:益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ的表达,有效保护心肌,阻断病程进度,实现治疗病毒性心肌炎的目的。

西方蜜蜂的线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基-Ⅰ~细胞色素氧化酶亚基-Ⅱ富含A+T非编码区单倍型类群

西方蜜蜂（Apis砌ZZ澹ra）的线粒体DNA（mitochondrial DNA，mtDNA）细胞色素氧化酶亚基-I（cytochrome C oxidase subunit I,COI）～细胞色素氧化酶亚基-II（COII）富含A＋T非编码区（AT-rich noncoding region，NC）属于高变异DNA序列，既呈现mtDNA长度变异又呈现mtDNA序列变异，它作为mtDNA多态性标记广泛地应用于A．m．地理亚种的DraI酶限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymorphism, DraI RFLP）分析和单核苷酸多态性（ single nucleotide polymorphism, SNP）分析。在本文中，A．m．非洲世系mtDNA的28种DraI RFLP谱图被归纳为3种COI—COIINC单倍型类群，即P0、Q元件组成类群，P1、Q元件组成类群以及P2、Q元件组成类群；A．m.西部欧洲世系mtDNA的90种DraI RFLP谱图被归纳为1种COI—COIINC单倍型类群，即P、Q元件组成类群；A．砚东部欧洲世系mtDNA的25种SNP谱图被归纳为1种COI—COIINC单倍型类群，即Q元件组成类群；A．m．亚洲世系mtDNA的29种DraIRFLP谱图被归纳为3种COI—COIINC单倍型类群，即P0、Q元件组成类群，P0’、Q元件组成类群以及P1＇,Q元件组成类群。本文综述了这个研究进展。

西方蜜蜂的线粒体DNA细胞色素氧化酶亚基-Ⅰ～细胞色素氧化酶亚基-Ⅱ富含A+T非编码区单倍型类群(续)

因此，根据A．m．的COI—COIINC单倍型类群分析的原始数据，A．m.非洲世系为DraI RFLP谱图表征的3个COI—COII NC单倍型类群（表1）。在A．耽进化过程中，阿尔卑斯山以北直至乌拉尔山的宽阔地域及其比邻的突尼斯、摩洛哥、撒哈拉沙漠近地中海地带等地是A．m.的一个自然分布区。

酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ的融合表达及纯化

目的:利用大肠杆菌融合表达酮古龙酸菌细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ(CcoⅡ)与谷胱甘肽S-转移酶(GST)并纯化。方法:根据酮古龙酸菌Y25基因组序列设计引物,通过PCR扩增CcoⅡ基因,酶切后连接pGEX-KG表达载体,转化至大肠杆菌获得重组菌,经IPTG诱导表达融合蛋白GST-CcoⅡ,用谷胱甘肽-Sepharose 4B树脂亲和纯化融合蛋白,并利用Western印迹及质谱对表达蛋白进行鉴定。结果:扩增得到867 bp的CcoⅡ基因,构建了pGEX-KG-CcoⅡ融合表达载体,重组菌经0.4 mmol/L IPTG于20℃诱导16 h,SDS-PAGE分析显示有可溶性表达条带,相对分子质量约为59×103;Western印迹及质谱分析表明,利用亲和层析方法纯化到了目的蛋白。结论:表达并纯化了GST-CcoⅡ融合蛋白,为酮古龙酸菌电子传递链的研究奠定了基础。

敲低细胞色素C氧化酶亚基4(COX4)通过增加CXCR4表达促进人肝癌细胞侵袭和迁移

目的探讨细胞色素C氧化酶亚基4(COX4)表达下调对肝癌侵袭的影响及其机制.方法免疫组织化学染色法检测肝癌及癌旁组织中COX4的表达,结合临床病理资料分析肝癌组织中COX4表达水平与肝癌临床病理指标的相关性.利用小干涉RNA(siRNA)敲低SNU-739及SNU-368肝癌细胞COX4的水平,Transwell^TM检测细胞的侵袭能力,免疫荧光细胞化学染色检测肝癌细胞CXC趋化因子受体4(CXCR4)表达,Western blot法检测癌细胞CXCR4蛋白水平,Mitosox染色检测线粒体活性氧(ROS)水平.利用还原剂N-乙酰半肮氨酸(NAC)降低细胞内ROS水平,Western blot法检测肝癌细胞CXCR4蛋白水平的改变.利用AMD3100抑制CXCR4作用,Transwell^TM法检测敲低COX4后肝癌细胞的侵袭能力.结果与癌旁组织相比,肝癌组织中COX4表达水平显著降低,COX4低表达与肝癌TNM分期晚,分化程度差显著正相关,COX4表达水平越低的患者预后越差,复发率越高.敲低肝癌细胞COX4水平后,肝癌SNU-739细胞及SNU-368细胞的侵袭能力显著增强,同时细胞内线粒体ROS水平及细胞CXCR4水平均显著升高.还原剂NAC可显著降低COX4干涉所诱导的CXCR4表达上调.抑制剂AMD3100可显著抑制COX4干涉所介导的侵袭能力增强.结论敲低COX4水平上调线粒体ROS水平增强CXCR4表达促进肝癌细胞的侵袭.

细胞色素C氧化酶亚基Cox4的克隆及高效表达

Cox4是电子传递链上复合体Ⅳ的1个关键亚基,实现Cox4的高效表达以及制备其抗体,对于线粒体功能研究至关重要。根据裂殖酵母序列信息数据库(S.pombe_Gene DB)中cox4的基因序列(登录号:SPAC1296.02)设计引物,以粟酒裂殖酵母的c DNA序列为模板,通过PCR扩增技术得到目标蛋白的基因,然后通过克隆构建到含有T7强启动子的表达载体p ET-28a(+)上,并将其转入大肠杆菌BL21(Escherichia coli BL21)中实现重组工程菌株的构建。结果表明,通过一系列条件优化实现了对重组工程菌株中Cox4的高效表达,并纯化得到大量相应蛋白,最后以纯化的蛋白为抗原成功制备了Cox4抗体。Cox4抗体的成功制备为粟酒裂殖酵母中线粒体功能研究奠定了基础。

蓖麻蚕线粒体基因组细胞色素氧化酶亚基Ⅲ的序列及其分子进化分析

测定了蓖麻蚕Samiacynthiaricini线粒体基因组 (mtDNA)含完整的细胞色素氧化酶亚基Ⅲ (COX3)、tRNA Gly和部分的NADH亚基Ⅲ (ND3)基因的DNA片段序列。COX3基因编码框包含 789个核苷酸 ,编码 2 6 2个氨基酸的蛋白质。通过同源性比较 ,发现COX3基因的 3′端比 5′端要保守 ,其编码的蛋白在C端有两个保守序列存在。COX3的下游为 6 6bp的tRNA Gly基因。蓖麻蚕的COX3与家蚕COX3同源性最高 ,核苷酸和氨基酸序列同源性分别是 80 2 %和 85 6 %。根据COX3氨基酸序列进行了 12种无脊椎动物的分子进化树分析 ,认为在采用线粒体基因序列进行分子进化分析时 ,应该综合考虑物种的繁殖模式及生态特点。

缺氧对大鼠大脑皮质细胞色素氧化酶亚基Ⅰ、Ⅳ表达协同性的影响

本文探讨缺氧对细胞色素氧化酶 (cytochromeoxidase ,COX ,即complexⅣ )的mtDNA和nDNA编码亚基Ⅰ、Ⅳ表达及其协同性的影响。实验用成年雄性Wistar大鼠随机分为对照组、缺氧 2、5、15和 3 0d组。缺氧大鼠于低压舱内模拟海拔 5 0 0 0m连续减压。对照组大鼠于舱外同时喂养 (舱外海拔高度为 3 0 0m)。用半定量逆转录 PCR法测定大脑皮质COXⅠ、ⅣmRNA量 ,用Westernblot分析大脑皮质线粒体COXⅠ、Ⅳ蛋白量 ,以两个亚基的蛋白量、mRNA量的比值反映亚基表达的协同性。结果显示 ,缺氧 2、5d ,COXⅠmRNA增加 ,缺氧 15、3 0d时下降至对照水平。缺氧 2、5和 15d时 ,COXⅣmRNA显著增加 ,缺氧 3 0d时降低 ,与对照组差异非常显著。COXⅣ、ⅠmRNA比值在缺氧 15d时最高 ,其它各缺氧组与对照组的差异无显著意义。各组COXⅠ、Ⅳ蛋白量及其比值均无显著差异。上述结果表明 ,缺氧可影响COXⅠ、ⅣmRNA的表达及其协同性 ,但对蛋白的表达及其协同性没有显著影响 ,提示转录后调节是缺氧过程中线粒体内COXⅠ。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

大豆蚜细胞色素氧化酶Ⅱ基因的克隆及其在捕食性天敌昆虫鉴定中的应用

利用通用引物,对大豆蚜Aphis glycinesMatsumura的细胞色素氧化酶Ⅱ(COⅡ)基因序列进行克隆和测序。测得的序列长度为810 bp,并与已在GenBank上登录的其他蚜虫COⅡ基因序列进行比较分析,验证其同源性,同时将该序列在GenBank进行了登记(登录号为DQ265743)。根据此片段的碱基序列设计了1对大豆蚜特异引物,其扩增片段约为270 bp;种特异性检验结果表明,该引物只对大豆蚜具有扩增能力,对其他相关蚜虫种类不具有扩增效果;并用此引物对大豆蚜捕食性天敌进行定性检测,结果表明,在取食过大豆蚜的异色瓢虫Harmonia axyridis、龟纹瓢虫Propylaeajaponica、大草蛉Chrysopa septempunctata幼虫以及小花蝽Orius similes成虫和幼虫等捕食性昆虫的中肠中均能检测到大豆蚜的DNA片段;而在未取食蚜虫的上述天敌中却未能扩增出来。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

我国不同地区二尾蛱蝶线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ的DNA序列差异

通过对我国不同地区二尾蛱蝶线粒体细胞色素氧化酶Ⅱ (COⅡ )DNA部分序列的比较分析 ,研究了二尾蛱蝶的遗传分化以及台湾海峡对其分化的影响。台湾和大陆二尾蛱蝶的COⅡ基因有0 75 %～ 1%的差异 ,估算其分化时间大约在 37 5～ 5 0万年前 ,台湾海峡可能有效地阻隔了两岸二尾蛱蝶的基因交流 ;台湾和大陆二尾蛱蝶间明显的基因差异可能与它们分属不同亚种有关 ,而大陆上不同地区的二尾蛱蝶也有较大的基因差异 ,推测大陆二尾蛱蝶可能存在 2个亚种。

6种鼠类细胞色素氧化酶亚基Ⅰ基因的分子进化分析

目的了解无锡市鼠类细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因的特征和鼠类分子系统进化关系。方法对褐家鼠、黄胸鼠、小家鼠、黑线姬鼠、社鼠、白腹巨鼠的COI基因进行了扩增测序,分析了基因特征、颠换率、遗传距离,在Gen Bank中对序列进行相似性比对,利用MEGA4.1构建分子系统树。结果 6种鼠类的COI基因序列扩增长度为706~724 bp,GC含量为40.3%~42.0%;种内颠换率为0.00%~2.17%,遗传距离为0.000~0.023;种间颠换率为8.82%~15.02%,遗传距离为0.099~0.193;每种鼠类为单系群的支持值都为100。结论鼠类的COI基因具有种属特异性,可以用于鼠类的分类鉴别。

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列的DNA微条形码技术鉴别11种生鲜肉制品掺假的研究

建立并优化了基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)序列的DNA微条形码(DNA mini-barcoding)技术,以检测生鲜肉制品中11种常见肉类的掺假情况。样品经真空冷冻干燥处理、提取DNA后,采用通用引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,目标条带扩增产物经切胶、回收、纯化后,进行克隆测序,并将测序结果提交到GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行Blast比对,筛选出适合猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鸽子肉、马肉、驴肉、鹅肉、兔肉、鼠肉等11种肉类扩增的通用引物COⅠ-A,并对PCR扩增条件进行优化,建立18个掺假模型,以对低经济价值肉类的最低掺入比例进行考察验证。结果表明:11种肉类的PCR扩增效率均为100%。在这18个掺假模型中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类(猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、驴肉、鼠肉)的最低检出比例均为5%,而在鹅肉、鸽子肉和兔肉中其最低检出比例为10%。本方法前处理简单,灵敏度高,重现性好,可作为高经济价值生鲜肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。

高氧对早产大鼠肺组织细胞色素氧化酶亚基Ⅰ表达的影响

目的探讨85%高体积浓度氧暴露对早产新生大鼠肺组织中线粒体DNA编码细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)动态表达的影响。方法早产SD大鼠生后d2随机分为空气组、高氧组。高氧组持续暴露于85%氧气中,空气组置于同一室内常压空气中。两组分别于暴露满1、4、7、10和14 d时,提取肺组织RNA,采用半定量逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)测定COXⅠmRNA表达;采用免疫组织化学、免疫印迹(Western-blot)法检测COXⅠ蛋白表达。结果1.与空气组相比,高氧d1和d4 COXⅠmRNA的表达显著增强(P<0.05,0.01),其后开始下降,d7时两者无显著性差异(P>0.05),d10时较空气组显著降低(P<0.01),d14时又增高(P<0.01)。2.COXⅠ蛋白水平表达,与空气组相比,高氧d1和d4时,COXⅠ表达显著增强(P<0.01,0.05),d7时两者无显著性差异(P>0.05),其后开始下降,d10和d14时较空气组显著降低(P<0.01,0.05)。结论85%高体积浓度氧暴露诱导早产新生大鼠线粒体DNA编码COXⅠ异常表达,这种变化可能参与高氧肺损伤的发生。

血吸虫细胞色素C氧化酶亚基I基因的克隆与近缘种属关系分析

从生物化学的角度比较血吸虫不同虫株的遗传进化差异.以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物扩增获取血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶基因片段,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序,对克隆得到的coⅠ基因作进化分析.结果表明:无论是在核苷酸序列还是在氨基酸序列上,日本血吸虫湖北株与其近地域株(云南、江苏、湖南)均具有较高的同源性,coⅠ基因的相似性分别为98%、98%和97%,但与不同种属血吸虫(曼氏、湄公、埃及、马来)的一致性则较低,分别为76%、84%、76%、85%,由此证实日本血吸虫湖北株与其它近地域株具有较近的亲缘关系.