细胞色素氧化酶3A4启动子报告基因的构建及其活性检测

目的建立细胞色素氧化酶(cytochrome P-450,CYP)3A4启动子报告基因并在孕烷X受体(pregnane X receptor,PXR)表达阳性的肿瘤细胞中检测其转录活性。方法利用PCR扩增CYP 3A4的启动子区远端调控序列(-7836/-7208)和近端调控序列(-362/+52)序列;将上述序列克隆至p GL3-Promoter载体上;利用萤光素酶报告基因系统检测CYP 3A4报告基因的活性。结果在肝癌细胞系中,PXR的激动剂利福平能够剂量依赖性地诱导远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和近端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.95;P=0.011)的活性,EC50为(5.65±0.58)μmol/L和(8.91±1.12)μmol/L;PXR的拮抗剂酮康唑能够剂量依赖性地抑制利福平诱导的远端调控序列荧光素酶报告基因(R2=0.92;P=0.003 4)和PXRELuc(R2=0.92;P=0.003 4)活性,IC50为(0.55±0.08)μmol/L和(0.94±0.14)μmol/L。此外,多种化疗药物(PXR的潜在配体)能够在PXR阳性的肿瘤细胞系中诱导远端调控序列荧光素酶报告基因和近端调控序列荧光素酶报告基因的活性。结论成功构建了CYP 3A4启动子报告基因,在此基础上建立了在不同肿瘤细胞中检测PXR转录活性的方法。

缺血后处理对在体大鼠缺血-再灌注心肌细胞色素P450表氧化酶2J3/环氧二十碳三烯酸系统的影响

目的观察缺血后处理拮抗心肌缺血-再灌注损伤时内源性细胞色素P450表氧化酶2J3/环氧二十碳三烯酸(CYP2J3/EET)系统的变化。方法复制在体大鼠心肌缺血-再灌注损伤及缺血后处理模型。雄性Wistar大鼠(250～300)g随机分为三组:假手术组(Sham)、缺血-再灌注组(I-R)、缺血后处理组(IPo)。动脉插管测定心功能指标,采用TTC染色法测定心肌梗死范围,采用RT-PCR法检测心脏细胞色素P450表氧化酶亚型2J3(CYP2J3)mRNA表达,采用Western blot方法测定心肌组织CYP2J3蛋白水平的变化,高效液相色谱法测定11,12-EET含量。结果与I-R组相比IPo组左室收缩末压(LVESP)、左室内压最大上升/下降速率(±LVdp/dtmax)均显著升高;心肌梗死面积减少20.76%(P<0.01);与Sham组及I-R组相比IPo组CYP2J3 mRNA、CYP2J3蛋白及11,12-EET含量明显升高(P<0.05)。结论IPo可减轻在体心肌I-R损伤同时上调心脏CYP2J3/EET系统;提示CYP2J3/EET系统可能与IPo拮抗心脏I-R损伤作用相关。

缺氧后处置心肌细胞CYP2J3/EETs变化及PPOH对其的影响

目的探讨缺氧后处置心肌细胞内源性细胞色素P450表氧化酶2J3/环二十碳三烯酸系统(CYP2J3/EETs)变化及细胞色素氧化酶抑制剂PPOH对其的影响。方法取Wistar乳鼠(12～24 h)心脏做原代心肌细胞培养并分为对照组、缺氧/复氧组、缺氧后处置组、二甲基亚砜组、PPOH抑制剂组,分别行相应处理后。MTT法检测心肌细胞活力,Western Blotting法检测CYP2J3蛋白表达,HPLC法检测心肌细胞培养液中11,12-EETs浓度。结果心肌细胞活力、CYP2J3蛋白表达、11,12-EETs浓度,缺氧/复氧组明显低于对照组,缺氧后处置组明显高于缺氧/复氧组,PPOH组心肌细胞活力、CYP2J3蛋白表达、11,12-EETs浓度比缺氧后处置组明显下降。结论缺氧后处置可通过升高CYP2J3/EETs缓解心肌缺氧/复氧损伤。PPOH可抑制缺氧后处置中CYP2J3升高,从而减弱缺氧后处置的心肌保护作用。

细胞色素P450氧化酶3A4＊1G基因多态性对新疆维吾尔族与汉族患者芬太尼术后镇痛效应的影响

目的研究细胞色素P450氧化酶（cytochrome P450 enzyme，CYP）3A4＊IG在新疆维吾尔族及汉族人群的分布特征及其与芬太尼术后镇痛的用量及效果的关系。方法选择美国麻醉医师协会（ASA）分级Ⅰ或Ⅱ级，在全身麻醉下行择期妇科手术的患者71例，按民族分为2组：维吾尔族组（U组）37例和汉族组（H组）34例。采用聚合酶链反应-限制性片段长度多态性（polymerase chain reaction-restriction hagment length polymorphism，PCR-RFlJP）技术进行CYP3A4＊IG基因多态性检测，统计其等位基因和基因型频率。术后采用芬太尼患者静脉自控镇痛（patientcontrolled intravenous analgesia，PCIA），记录并比较两组间术后6、24、48h的视觉模拟评分（visual analogue scale，VAS）、Ramasay镇静评分、生命体征、48h内患者PCIA芬太尼总用量。结果①U组患者中GG、GA、AA基因型分布频率分别为86．5％、10．8％和2．7％，H组患者中GG、GA、AA基因型分布频率分别为50．0％、44．1％和5．9％；U组患者G等位基因和A等位基因分布频率分别为91．9％和8．1％，H组患者分别为72．1％和27．9％；两组间基因型分布频率和等位基因分布频率差异均有统计学意义（P〈O．05）。②两组患者各时点（术后6、24、48h）脉搏血氧饱和度（pluseoxygensaturation，SpO2）、Ramasay镇静评分和VAS评分比较差异均无统计学意义。③U组PCIA48h内芬太尼总用量明显多于H组（R0．05）；U组和H组CYP3A4＊1G突变型（GA型＋AA型）PCIA48h内芬太尼总用量明显低于野生型（GG型）（P〈0．05）。结论CYP3A4＊1G基因多态性分布在新疆维吾尔族和汉族患者之间存在差异，此差异可能是两民族患者之间芬太尼术后镇痛效应出现差异的主要因素。

CYP3A的分子机制研究进展

CYP3A在许多内源性及外源性化合物的氧化及还原代谢中起关键作用 ,对CYP3A基因表达调控的研究具有重要意义。对有关CYP3A基因表达调控的分子机制及CYP3A基因突变的研究进展加以总结 ,阐明CYP3A基因突变与某些疾病的相关性。

缺氧后处理中CYP2J3/EETs系统对心肌凋亡的影响

目的:观察缺血后处理中心肌细胞内源性细胞色素P450表氧化酶2J3/环氧二十碳三烯酸系统(CYP2J3/EETs)对心肌细胞凋亡的调节作用机制。方法:取Wistar乳鼠(12-24 h)心脏做原代心肌细胞培养。实验分为7组:对照组、缺氧/复氧组、缺氧后处理组、CYP2J3转染组、空质粒组、6-(2-炔丙基氧苯基)己酸(PPOH,一种CYP2J3抑制剂)组、二甲基亚砜(DMSO)溶剂组。除对照组外,其它各组均进行缺氧/复氧处理。用MTT法检测心肌细胞活力,高压液相色谱法检测心肌细胞培养液中11,12-EET浓度,Western blotting检测心肌细胞中caspase-3蛋白的表达,caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3蛋白的活性。结果:缺氧后处理组心肌细胞活力和11,12-EET浓度明显高于缺氧/复氧组(P<0.01),CYP2J3转染组比后处理组明显增高(P<0.01),PPOH组比后处理组明显下降(P<0.01)。后处理组caspase-3蛋白的表达及活性低于缺氧/复氧组(P<0.01),CYP2J3转染组caspase-3蛋白表达及活性低于后处理(P<0.01),而PPOH组caspase-3蛋白表达及活性高于缺氧后处理组(P<0.01)。结论:在缺氧后处理中CYP2J3/EETs可能通过抑制caspase-3蛋白的表达及活性来影响细胞凋亡,从而对心肌起保护作用。

苯扎贝特改善实验性糖尿病小鼠心肌肥厚作用及可能机制

目的观察苯扎贝特(BEZ)对糖尿病小鼠心肌肥厚的治疗作用及其对环氧廿碳三烯酸(EET)的影响。方法小鼠高糖高脂饮食喂养4周后,连续5 d ip给予STZ 40 mg·kg^(-1),7 d后测量小鼠空腹血糖(FBG)值。随机选取FBG≥11.1 mmol·L^(-1)的小鼠,继续给予高糖高脂饮食4周后,分为模型组、BEZ 25 mg·kg^(-1)(约为临床常用剂量1/3)组和BEZ 75 mg·kg^(-1)(与临床常用剂量相当)组,ig给药,1次/d,持续4周。每周监测小鼠体质量(BM)及FBG。实验结束时,取血检测甘油三酯(TG)、总胆固醇(TCH)和14,15-EET含量。以心肌肥厚指数(LVHI)、左心室/体质量比(LV/BM)和心房肽(ANF)表达为心肌肥厚检测指标,HE和Masson染色观察左心室组织病理学改变。逆转录定量PCR和Western印迹法分别检测左心室心肌组织中ANF mRNA和细胞色素P450表氧化酶2J3(CYP2J3)蛋白表达。结果小鼠FBG持续≥11.1 mmol·L^(-1),提示糖尿病形成。4周后,糖尿病小鼠的LVHI,LV/BM和ANF mRNA表达增加(P<0.01),心肌结构损伤,出现心肌肥厚。实验结束时,TG和TCH含量增加(P<0.01);同时,左心室心肌组织CYP2J3表达下调,血清14,15-EET含量减少(P<0.01)。给予BEZ 25和75 mg·kg^(-1)治疗后,FBG均降低,TG和TCH亦减少(P<0.05);但只有BEZ 75 mg·kg^(-1)组小鼠心肌肥厚改善,CYP2J3表达和14,15-EET水平升高(P<0.05)。结论临床相当剂量的BEZ对糖尿病小鼠心肌肥厚有保护作用,该作用可能与CYP2J3-EET激活有关。