SR9009联合吲哚丙酸通过核因子κB信号通路减轻C2C12成肌细胞的炎症反应

背景:钟基因Rev-erbα参与调节炎症,但激活Rev-erbα会增加心脑血管疾病风险。为降低相关风险,探索Rev-erbα激动剂SR9009联合其他药物来减轻骨骼肌成肌细胞炎症,奠定治疗炎症相关性骨骼肌萎缩的理论基础。目的:探讨脂多糖刺激C2C12成肌细胞时吲哚丙酸、SR9009与核因子κB信号通路的关系。方法:①1μg/mL脂多糖刺激C2C12成肌细胞,RNA转录组测序结合KEGG通路富集分析信号通路。②CCK-8法检测C2C12成肌细胞活性,筛选吲哚丙酸的最佳给药浓度;然后将细胞分为空白对照组、脂多糖(1μg/mL)组、SR9009(10μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸(80μmol/L)+脂多糖组、吲哚丙酸+SR9009+脂多糖组,ELISA检测细胞上清液中白细胞介素6水平,RT-qPCR检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达,Western blot检测NF-κB p65、p-NF-κB p65蛋白表达。③siRNA敲减Rev-erbα,RT-qPCR评估敲减效率,检测白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达。结果与结论:①与空白对照组比较,脂多糖时间依赖性抑制成肌细胞融合形成肌管,白细胞介素6、肿瘤坏死因子αmRNA表达水平升高,细胞上清液中白细胞介素6水平显著升高;KEGG通路分析支持脂多糖刺激激活核因子κB信号通路。②吲哚丙酸浓度>80μmol/L时抑制C2C12成肌细胞活性;吲哚丙酸和SR9009通过抑制核因子κB信号通路发挥抗炎作用,降低白细胞介素6、肿瘤坏死因子α、Toll样受体4、CD14 mRNA表达水平,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值低于脂多糖组。SR9009联合吲哚丙酸显著降低脂多糖诱导的炎症,Toll样受体4、CD14、白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达水平进一步下调,p-NF-κB p65/NF-κB p65蛋白表达比值显著低于吲哚丙酸+脂多糖组和SR9009+脂多糖组。③Rev-erbα随脂多糖刺激时间依赖性升高;siRNA敲减Rev-erbα效率达58%以上,成功敲减Rev-erbα后添加脂多糖,白细胞介素6和肿瘤坏死因子αmRNA表达较脂多糖组显著上调。④结果说明,Rev-erbα可以作为调节炎症反应的靶点,SR9009靶向激活Rev-erbα联合吲哚丙酸能抑制核因子κB信号通路显著减轻C2C12成肌细胞的炎症反应,联合抗炎效果优于单独干预。

桑色素抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺泡上皮细胞焦亡的影响

目的:探讨桑色素(MH)抑制核苷酸结合寡聚化结构域样受体蛋白3(NLRP3)/半胱氨酸天冬氨酸酶-1(Caspase-1)/IL-1β信号通路对慢性阻塞性肺疾病(COPD)大鼠肺泡上皮细胞焦亡的作用机制。方法:采用烟熏法建立COPD模型大鼠,将其随机分模型组(COPD组)、MH低、中、高剂量组(MH-L、MH-M、MH-H组)(50、100、200 mg/kg)、阳性对照组(地塞米松组,DXMS,0.09 mg/kg),另取10只健康大鼠作为正常对照组(NC组)。检测大鼠肺功能指标[潮气量(TV)、肺活量(FVC)和呼气峰流速(PEF)];HE染色观察肺组织病理学变化;免疫荧光双染观察肺泡上皮细胞焦亡情况;ELISA检测肺泡灌洗液(BALF)中炎症因子水平;RT-qPCR检测NLRP3、Caspase-1、消皮素D(GSDMD)、IL-1βmRNA水平;Western blot检测肺组织SP-C、NLRP3、C-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β蛋白表达。结果:与COPD组比较,DXMS组、MH各组肺组织管腔狭窄、黏液分泌和支气管黏膜上皮细胞坏死等病理学变化明显改善,肺功能指标(TV、FVC、PEF)显著上升(P<0.05),且MH-L、MH-M、MH-H组依次上升(P<0.05);TNF-α、IL-6、IL-8水平、NLRP3及C-Caspase-1免疫荧光表达、NLRP3、Caspase-1、GSDMD、IL-1βmRNA水平、NLRP3、C-Caspase-1、GSDMD、GSDMD-N、IL-1β蛋白水平显著下降,SP-C蛋白表达逐渐上升(P<0.05)。结论:MH可抑制NLRP3/Caspase-1/IL-1β信号通路及其介导的炎症因子释放和细胞焦亡,减轻COPD大鼠的肺组织病变。

叶酸通过JNK/p38 MAPK信号通路调节小鼠C2C12成肌细胞分化

目的:观察叶酸(folic acid,FA)对小鼠C2C12成肌细胞增殖和分化的影响并探讨其作用机制。方法:(1)在小鼠C2C12成肌细胞增殖阶段,采用不同浓度(0、2.5、5、10和20μmol/L)的FA处理C2C12细胞,显微镜下观察各组细胞的状态,MTT法检测细胞活力,EdU法检测细胞增殖情况。(2)在小鼠C2C12成肌细胞分化阶段,将细胞分为对照(control,Ctrl)组(0μmol/L FA)和FA组(10μmol/L FA),于分化的第2天和第4天,采用免疫荧光染色和Western blot检测成肌细胞分化相关蛋白成肌细胞决定蛋白1(myoblast determination protein 1,MyoD)、成肌蛋白(myogenin,MyoG)和肌球蛋白重链(myosin heavy chain,MyHC)的表达水平,并统计各组细胞肌管形成情况。(3)在小鼠C2C12成肌细胞分化第4天时,加入FA处理0、1、3和6 h,采用Western blot检测各时点c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)、磷酸化JNK(phosphorylated JNK,p-JNK)、p38丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)和磷酸化p38 MAPK(phosphorylated p38 MAPK,p-p38 MAPK)蛋白水平。(4)将分化4 d的小鼠C2C12成肌细胞分为Ctrl组、FA组、SP600125(JNK特异性抑制剂)组、SB2035805(p38 MAPK特异性抑制剂)组、FA+SP600125组和FA+SB203580组。C2C12成肌细胞先接受10μmol/L的SP600125或SB203580处理1 h,再经10μmol/L的FA处理24 h,FA组经10μmol/L FA处理24 h,Ctrl组不作处理。采用Western blot检测p-JNK、JNK、p-p38 MAPK、p38 MAPK和MyHC蛋白水平。结果:(1)与0μmol/L FA组相比,其余各浓度组的细胞数量明显增多,细胞活力显著提高(P<0.05),EdU阳性细胞率均显著增加(P<0.05)。(2)与Ctrl组相比,FA组MyoD、MyoG和MyHC的表达水平均显著提高(P<0.05),肌管融合指数显著增加(P<0.05或P<0.01)。(3)与0 h组相比,FA处理1、3和6 h后p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值均显著升高(P<0.05或P<0.01),且随着处理时间的延长,p-JNK/JNK和p-p38 MAPK/p38 MAPK的比值呈现逐渐升高的趋势。(4)与Ctrl组相比,FA组p-JNK、p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著升高(P<0.01);与FA组相比,FA+SP600125组p-JNK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05),FA+SB203580组p-p38 MAPK和MyHC蛋白水平显著降低(P<0.05或P<0.01)。结论:FA可以通过激活JNK/p38 MAPK信号通路促进小鼠C2C12成肌细胞分化。

CHMP4C通过调控PI3K/AKT信号通路影响NSCLC细胞增殖与凋亡

目的:探究染色质修饰蛋白4C(CHMP4C)对非小细胞肺癌(NSCLC)进展及顺铂敏感性的影响及其机制。方法:通过免疫组化检测CHMP4C在NSCLC癌组织和癌旁组织中的表达情况。利用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)和蛋白免疫印迹法(Western blot)检测CHMP4C在NSCLC细胞系中的表达水平。细胞计数试剂盒(CCK-8)和细胞克隆实验检测细胞活力及半数抑制浓度IC50;流式细胞术检测细胞周期和凋亡。Western blot分析细胞凋亡相关蛋白(caspase 3、Bad)及PI3K/AKT信号通路中关键蛋白的表达水平。另外,我们采用动物模型进一步验证CHMP4C对体内肿瘤生长的影响。结果:CHMP4C在NSCLC癌组织和细胞系中高表达,与肿瘤T分期显著相关(P<0.05)。敲低CHMP4C抑制细胞增殖,促进细胞凋亡,并将细胞阻滞在S期(P<0.05)。敲低CHMP4C可抑制PI3K/AKT信号通路活化,然而激活PI3K/AKT信号通路逆转了CHMP4C敲低对NSCLC细胞的影响(P<0.05)。利用顺铂处理细胞后发现NSCLC细胞生长受抑制,且CHMP4C表达降低;敲低CHMP4C联合顺铂治疗明显诱导肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤细胞增殖(P<0.05)。在动物实验中,CHMP4C敲低的肿瘤体积小于对照组,其ki67表达显著降低,而caspase 3表达升高(P<0.05)。结论:CHMP4C在NSCLC癌组织及细胞系中高表达,在体内及体外实验中敲低CHMP4C可抑制NSCLC细胞增殖,促进细胞凋亡,增强顺铂治疗的敏感性;CHMP4C可能通过PI3K/AKT信号通路参与NSCLC进展与顺铂耐药。

PKC信号传导通路对缺氧人视网膜色素上皮细胞表达VEGF的作用

目的 :探讨蛋白激酶C(PKC)信号传导通路对缺氧状态下培养的视网膜色素上皮 (retinalpigmentepithelium ,RPE)细胞表达VEGF的作用 .方法 :在缺氧状态下分别培养人RPE细胞 6 ,1 2和 2 4h ;将不同浓度的PKC激动剂佛波醇 1 2 豆蔻酰 1 3乙酸 (phorbol 1 2 myristate 1 3 acetate,PMA)及PKC抑制剂Chelerythrine分别加入人RPE细胞培养液 ,在缺氧状态下培养 2 4h .用免疫组化方法检测各组RPE细胞中VEGF的表达 ,经计算机图像处理 ,定量分析 .结果 :在缺氧状态下 ,RPE细胞对VEGF的表达较非缺氧组RPE细胞显著增加 (P <0 .0 1 ) ;较对照组 ,PMA可增强缺氧状态下RPE细胞VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) ,Chelerythrine则减弱VEGF的表达 (P <0 .0 1 ) .结论 :缺氧诱导VEGF在RPE细胞中的表达 。

细胞色素C氧化酶-2/前列腺素E2信号通路对老年慢性阻塞性肺疾病患者肺血管内皮细胞凋亡的作用

目的探讨细胞色素C氧化酶(Cox)-2/前列腺素E2(PG)E2信号通路对老年慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者肺血管内皮细胞凋亡的作用。方法该行肺叶切除术的老年患者20例,根据吸烟情况和COPD诊断标准分为非吸烟非COPD组(对照组)6例,吸烟非COPD组(非COPD组)7例,吸烟且COPD组(COPD组)7例,取癌旁正常肺组织为研究标本。TUNEL法检测肺血管内皮细胞凋亡情况;免疫组化染色观察细胞中Cox-2、PGE2蛋白分布情况;RT-PCR检测Cox-2、PGE-2 mRNA表达;Western印迹检测Cox-2、PGE2蛋白的表达。结果肺血管内皮细胞凋亡指数由高到低依次为COPD组、非COPD组、对照组;Cox-2、PGE2蛋白呈棕色或棕黄色表达于肺血管内皮细胞质并在对照组中表达丰富。非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2、PGE2 mRNA表达量明显低于对照组,COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。非COPD组、COPD组肺组织中Cox-2、PGE2 mRNA蛋白表达量明显低于对照组,COPD组明显低于非COPD组(P<0.05)。结论 COPD患者Cox-2、PGE2表达下调,肺血管内皮细胞凋亡增加且与吸烟相关;Cox-2/PGE-2信号通路参与介导COPD患者肺血管内皮细胞凋亡,呈负向调节。

沉默MCM7基因介导AKT信号通路参与黑色素瘤细胞增殖及凋亡的实验

目的探讨MCM7基因沉默介导AKT信号通路参与人皮肤黑色素瘤细胞的增殖及凋亡。方法构建MCM7基因和沉默MCM7基因表达的慢病毒RNA(LV-shRNA-MCM7)的表达载体;将A375细胞分为Control组、Emptyvector转染组(空载质粒转染组)、siRNA(LV-shRNA-MCM7)转染组、siRNA NC(LV-shRNA-MCM7 negative control)转染组;MTT法检测每组细胞增殖;流式细胞术检测细胞周期、细胞凋亡情况;划痕实验法检测细胞迁移能力;qRT-PCR法测定细胞中MCM7基因、AKT信号通路相关基因、Cyclin D1及凋亡相关基因Bcl-2、Bax、caspase-3的相对表达量;Westernblot法测定蛋白相对表达量。结果沉默MCM7后,黑色素瘤细胞中的MCM7基因、Cyclin D1、Bcl-2、AKT信号通路相关基因AKT3的mRNA和蛋白相对表达量显著下调(P<0.05);凋亡相关基因Bax、caspase-3的mRNA和蛋白表达量显著上调(P<0.05);siRNA转染组凋亡率显著上升,G_0/G_1期细胞数目明显增多,S期细胞数目明显减少;细胞增殖、迁移能力显著下降(P<0.05)。结论沉默MCM7基因抑制AKT信号通路的激活,从而抑制A375黑色素瘤细胞增殖、迁移,促进A375黑色素瘤细胞凋亡。

芪丹颗粒通过促进CTRP3激活PI3K/AKT信号通路改善脂肪细胞胰岛素抵抗

【目的】探究芪丹颗粒抗脂肪细胞胰岛素抵抗(IR)机制。【方法】采用棕榈酸培养法诱导3T3-L1脂肪细胞IR模型,设空白对照组,模型组,芪丹颗粒低、中、高剂量组,芪丹颗粒+C1q/TNF相关蛋白3(CTRP3)siRNA组。测定细胞上清中葡萄糖消耗量;采用酶联免疫吸附分析(ELISA)法测定细胞上清中肿瘤坏死因子α(TNF-α)和白细胞介素6(IL-6)含量;实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法检测细胞CTRP3、TNF-α、IL-6、葡萄糖转运蛋白4(GLUT4)基因表达;Western Blot法检测细胞中CTRP3、磷脂酰肌醇-3激酶(PI3K)、蛋白激酶B(AKT)的蛋白表达及其磷酸化水平。【结果】与模型组比较,芪丹颗粒中、高剂量组的葡萄糖消耗量升高并趋于空白对照组的70%~82%,TNF-α含量降低了25%~45%,IL-6含量下降了40%~55%,GLUT4 mRNA表达水平增加了50%,CTRP3 mRNA及蛋白表达水平增加了25%~40%(均P<0.05);与芪丹颗粒组比较,芪丹颗粒+CTRP3 siRNA组的葡萄糖消耗量和GLUT4 mRNA表达水平分别降低了33%和27%,IL-6和TNF-α的含量分别增加了42%和41%,p-PI3K和p-AKT的蛋白表达水平增加了190%和180%(均P<0.05)。【结论】芪丹颗粒可能通过促进CTRP3表达降低炎症反应和激活PI3K/AKT信号通路来提高IR 3T3-L1脂肪细胞的胰岛素敏感性,改善脂肪细胞IR。

白芍总苷基于Jak/stat3信号通路对高糖诱导的视网膜色素上皮细胞增殖、凋亡的影响

目的探讨白芍总苷(TGP)基于Janus激酶/信号转导子及转录激活子(Jak/stat3)信号通路对高糖诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞增殖、凋亡的影响。方法ARPE-19细胞暴露于高糖环境,建立细胞损伤模型。ARPE-19细胞分为正常组(5.5 mmol/L葡萄糖)、高糖组(50 mmol/L葡萄糖)、TGP低、中、高浓度组(50 mmol/L葡萄糖+2.5、5.0、10.0μg/ml TGP)和TGP高浓度+IGF-1组(10μg/ml TGP+20μmol/L Jak/stat3通路激活剂IGF-1)。细胞计数试剂盒(CCK-8)检测各组ARPE-19细胞的生存能力;流式细胞术检测各组ARPE-19细胞的凋亡能力;酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各组ARPE-19细胞中促炎因子[白细胞介素(IL)-1β、IL-6和IL-8]水平;2,7-二氯二醋酸荧光素(DCFH-DA)流式细胞术检测各组ARPE-19细胞内活性氧(ROS)水平;Western印迹检测ARPE-19细胞内增殖蛋白[细胞周期蛋白(Cyclin)D1、p21]、凋亡蛋白[B细胞淋巴瘤(Bcl)-2、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、Pro-半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(caspase)-3、活化型(Cleaved)-caspase-3]及Jak/stat3信号通路相关蛋白表达。结果与正常组相比,高糖组细胞活性及CyclinD1表达明显减小,p21表达明显增加,凋亡率及Bax表达、Cleaved/Pro-Caspase-3比值明显增加,Bcl-2表达明显减小,IL-1β、IL-6、IL-8含量及ROS荧光强度明显增加(均P<0.05)。与高糖组比较,TGP低、中、高浓度组细胞活性及CyclinD1表达升高,p21表达降低,凋亡率及Bax表达、Cleaved/Pro-Caspase-3比值下降,Bcl-2表达升高,IL-1β、IL-6、IL-8含量及ROS荧光强度减小,有统计学差异(均P<0.05)。ARPE-19细胞内添加IGF-1上调Jak、stat3磷酸化水平后,细胞活性及CyclinD1表达显著降低,p21表达显著增加,凋亡率及Bax表达、Cleaved/Pro-Caspase-3比值显著增加,Bcl-2表达明显下降,IL-1β、IL-6、IL-8含量及ROS荧光强度显著上升(均P<0.05)。结论TPG通过阻断Jak/stat3信号通路,抑制高糖诱导的RPE细胞凋亡和炎症损伤并促进增殖。

槲皮素调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路抑制C2C12细胞凋亡

目的:基于AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路探讨槲皮素对C2C12细胞增殖、成肌分化和凋亡的影响。方法:体外培养C2C12细胞进行成肌诱导,分别采用CCK8法(Cell Counting Kit-8)、ATP染色法及TUNEL法检测槲皮素对C2C12细胞增殖活力、成肌能力和凋亡的影响;实时荧光定量PCR(qRT-PCR)和蛋白免疫印迹(Western blot)分别检测MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,筛选合适浓度。再采用合适浓度的槲皮素或AKT1通路抑制剂(LY294002)干预成肌诱导后的C2C12细胞,ATP法和TUNEL法分别检测C2C12细胞成肌能力和凋亡水平,Western blot检测p-AKT1、p-AMPK和p-Foxo3a蛋白表达水平。结果:①在一定范围内,槲皮素呈浓度依赖性促进C2C12增殖,12.5μmol/L的槲皮素显著促进C2C12细胞成肌分化,能显著提高成肌标志物MyoD1和Myogenin基因和蛋白表达,因此本研究选择12.5μmol/L的槲皮素用于后续研究。②10μmol/L LY294002显著抑制C2C12细胞成肌分化,促进细胞凋亡,抑制p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,促进p-Foxo3a蛋白表达;12.5μmol/L槲皮素联合10μmol/L LY294002显著促进C2C12细胞成肌分化,抑制细胞凋亡,促进p-AKT1和p-AMPK蛋白表达,抑制p-Foxo3a蛋白表达。结论:槲皮素通过调控AKT1/AMPK/Foxo3a信号通路的磷酸化促进C2C12细胞增殖和分化,抑制细胞凋亡。

白花蛇舌草注射剂调节Bcl-2/CytC信号通路诱导线粒体凋亡抑制肝癌细胞增殖的研究

目的:评估白花蛇舌草注射剂抑制肝癌细胞增殖及相关机制。方法:选取120例肝癌患者临床资料进行分析,将其按照治疗方案不同分成参照组30例,研究组90例,其中研究组根据白花蛇舌草注射剂的不同浓度分为低(25μg/ml)、中(50μg/ml)、高(100μg/ml)三个浓度各30例,参照组不做任何处理,研究组注射白花蛇舌草注射剂,进行肝癌细胞HepG_2细胞体外培养,注射后24 h和48 h观察细胞生长情况,逆向显微镜和透射电镜观察细胞形态,Western Blot检测Bax,Bcl-2,Caspase-3,Cyt C蛋白表达情况。结果:在24 h和48 h后,白花蛇舌草注射剂浓度为50μg/ml和100μg/ml时,HepG_2细胞的存活率明显下降。抑制率随药物浓度的增加和作用时间的延长而增加,呈剂量依赖性和时间依赖性关系,在50μg/ml和100μg/ml浓度下,白花蛇舌草注射剂对HepG_2细胞有明显的抑制作用(P<0.05),发现研究组1促进肿瘤扩散的趋势在25μg/ml浓度,表明细胞定量24 h后,低温提取蛋白质可能影响中药的使用,白花蛇舌草注射液能够改变Hep G_2细胞超微结构,参照组细胞核较大,细胞核清晰,丰富的细胞器,线粒体呈圆形或椭圆形,基础丰富,细胞核染色质均匀分布,当白花蛇舌草注射液浓度为100μg/ml时,微绒毛,胞质变性,空泡,细胞染色质固缩,边缘,有细胞凋亡的早期迹象。Western blot检测Bcl-2/CytC信号通路相关蛋白在HepG_2细胞中的表达,当用浓度为100、50、25μg/ml的白花蛇舌草注射液预处理24h后,与对照组相比,Bax、CytC、Caspase-3蛋白表达逐渐升高,Bcl-2蛋白表达逐渐降低,Bcl-2/Bax比值降低。其中,100μg/ml和50μg/ml浓度最为明显,表明白花蛇舌草注射液能够作用于Hep G_2使其释放Cyt C,激活Caspase-3蛋白质的表达,诱导肝癌细胞的凋亡。结论:白花蛇舌草注射液可以抑制人肝癌HepG_2细胞的增殖并诱导其凋亡,这可能与Bcl-2/CytC信号通路的调控有关,可以提高整体疗效,减少不良反应少,安全性高。

基于mTOR信号通路探究附子提取物联合葛根素对心肌细胞的影响

氧化应激与心肌损伤密切相关[1]。附子提取物具有心肌保护作用[2]。葛根素是中药葛根的主要活性成分,可减轻心肌细胞损伤[3]。目前,附子提取物和葛根素对心肌细胞保护作用的机制尚未明确,因此本文探讨附子提取物联合葛根素对过氧化氢诱导的H9C2心肌细胞的影响及相关机制。

IGF-1介导MAPKs通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的作用

目的探究胰岛素样生长因子1(IGF-1)介导丝裂原活化蛋白激酶(MAPKs)信号通路在C3H10T1/2细胞成骨分化中的调控作用及机制。方法不同浓度IGF-1(0、5、10、20 ng/mL)培养C3H10T1/2细胞,碱性磷酸酶(ALP)与茜素红(ARS)染色检测ALP活性、钙盐沉积情况,qRT-PCR法检测成骨特性因子核心结合因子α-1(RUNX2)、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平,Western Blot法检测MAPK通路蛋白磷酸化表达水平。对数期细胞分为空白组、IGF-1组、ERK通路抑制剂(PD98059)组、PD+IGF-1组、p38通路抑制剂(SB202192)组、SB+IGF-1组,qRT-PCR法检测成骨特性因子RUNX2、成骨分化特异性因子骨桥蛋白(OPN)、骨钙蛋白(OCN)mRNA表达水平。结果不同浓度IGF-1组ALP显色加深,ALP活性升高,钙盐结节形成增多,RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平升高,磷酸化ERK、p38、JNK蛋白表达增加,具有剂量效应(P<0.05)。与空白组比较,PD组、SB组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05),PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显升高(P<0.05);但与IGF-1组比较,PD+IGF-1组、SB+IGF-1组C3H10T1/2细胞RUNX2、OPN、OCN mRNA表达水平明显降低(P<0.05)。结论IGF-1促进C3H10T1/2细胞成骨分化,其作用机制可能与激活ERK信号通路和p38 MAPK信号通路有关。

PLA2G4C通过p38/MAPK信号通路介导线粒体自噬促进DLBCL进展的实验研究

目的研究磷脂酶A2ⅣC组(phospholipase A2 groupⅣC,PLA2G4C)在弥漫性大B细胞淋巴瘤(diffuse large B-cell lymphoma,DLBCL)中的作用及其可能调节机制。方法通过免疫印迹法(Western blot)检测PLA2G4C在DLBCL组织和细胞中的表达。构建PLA2G4C过表达或敲低表达的DLBCL细胞系,后用自噬抑制剂氯喹(Chloroquine,CQ)或p38抑制剂SB203580处理细胞24h。实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测PLA2G4C转染效率;Western blot检测PLA2G4C蛋白、线粒体自噬相关蛋白[微管相关蛋白1轻链3-Ⅱ/Ⅰ(microtubule-associated protein 1 light chain 3-Ⅱ/Ⅰ,MAP1 LC3Ⅱ/Ⅰ),Beclin1,p62,PTEN诱导激酶1(PTEN induced putative kinase 1,PINK1)和Parkin],p38/丝裂原激活蛋白激酶(mitogen activated protein kinases,MAPK)通路相关蛋白[磷酸化p38/MAPK(phosphorylated-p38/MAPK,p-p38/MAPK)]表达水平;CCK-8法、Transwell实验和流式细胞术分别检测细胞增殖、侵袭和凋亡能力。进一步构建异种移植瘤裸鼠模型,观察PLA2G4C对裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬的影响。结果DLBCL患者淋巴瘤组织中PLA2G4C蛋白表达显著高于反应性增生淋巴结组织(3.47±0.42 vs 1.01±0.02),差异具有统计学意义(t=-37.002,P<0.001);DLBCL细胞中PLA2G4C蛋白水平显著高于人淋巴母细胞样细胞系和B细胞淋巴瘤细胞系,差异具有统计学意义(F=73.771,P<0.001)。沉默PLA2G4C显著降低DLBCL细胞活力和侵袭能力,诱导细胞凋亡(t=6.909~11.390);过表达PLA2G4C后结果与之相反(t=2.392~19.778),差异具有统计学意义(均P<0.001)。且过表达PLA2G4C显著促进线粒体自噬的发生,而CQ或SB203580处理则可显著逆转PLA2G4C过表达对DLBCL细胞生物学行为及线粒体自噬的作用。体内裸鼠实验显示,敲低PLA2G4C显著抑制移植瘤裸鼠体内肿瘤生长及线粒体自噬相关蛋白表达,差异具有统计学意义(t=13.816~25.926,均P<0.001)。结论PLA2G4C在DLBCL中表达显著上调,可能通过促进p38/MAPK信号通路介导的线粒体自噬,促进肿瘤细胞增殖和侵袭,抑制细胞凋亡,参与DLBCL的发生发展。

基于AMPK/mTOR通路探讨注射用益气复脉对TBHP诱导H9c2细胞损伤的保护作用

目的:探讨注射用益气复脉(YQFM)通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬减轻叔丁基过氧化氢(TBHP)所致H9c2心肌细胞损伤的机制。方法:体外培养H9c2心肌细胞,分为正常对照组、TBHP组、TBHP+YQFM组。CCK-8法检测各组H9c2心肌细胞存活率;免疫荧光检测细胞自噬情况;免疫印迹法检测各组细胞自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及AMPK/mTOR通路相关蛋白表达。结果:用2、4、8、16 g/L的YQFM预处理后,可显著恢复TBHP诱导的H9c2细胞损伤;免疫荧光染色结果显示,与正常对照组相比,TBHP组细胞LC3荧光强度显著升高(P<0.01);与TBHP组相比,TBHP+YQFM组LC3荧光强度降低,其中2 g/L YQFM组具有显著性(P<0.05)。Western blot检测结果显示:TBHP组p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达显著增加,p-mTOR/mTOR比率显著降低;YQFM预处理使自噬相关蛋白p-AMPK/AMPK、LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比率明显降低,4 g/L YQFM组p-mTOR/mTOR比率明显升高。结论:注射用益气复脉能有效拮抗TBHP引起的H9c2细胞损伤,其机制与通过AMPK/mTOR信号通路调控自噬途径有关。

miR-92a对H9C2心肌细胞增殖、凋亡及Wnt信号通路的影响

目的探讨miR-92a对过氧化氢(H2O2)诱导的H9C2心肌细胞增殖、凋亡及Wnt信号通路的影响。方法通过Lipofectamine^(TM)2000将miR-92a抑制物(inhibitor)及阴性对照组转染大鼠心肌细胞H9C2,RT-PCR检测转染后细胞中miR-92a的表达;将后续实验分为空白对照组、H2O2组和miR-92a inhibitor+H2O2组,利用CCK8法、流式细胞仪及Western印迹分别检测3组细胞的增殖、凋亡、凋亡相关蛋白B细胞淋巴瘤/白血病(Bcl)-2和Bcl-2相关X蛋白(Bax)及Wnt信号通路β-连环蛋白(β-catenin)和c-Myc的蛋白表达。结果 miR-92a inhibitor组miR-92a mRNA表达显著低于空白对照组(P<0.05),阴性对照组与空白对照组差异无统计学意义(P>0.05);与空白对照组比较,H2O2组细胞增殖显著降低,凋亡率显著增加,Bax、β-catenin、c-Myc蛋白显著上调表达,Bcl-2蛋白显著下调表达(均P<0.05),与H_2O_2组比较,miR-92a inhibitor+H_2O_2组细胞增殖显著升高,凋亡率显著降低,Bax、β-catenin、c-Myc蛋白显著下调表达,Bcl-2蛋白显著上调表达(均P<0.05)。结论抑制miR-92a的表达可促进H2O2诱导的H9C2心肌细胞增殖,抑制细胞的凋亡,其机制与调节Bax、Bcl-2蛋白及Wnt信号通路表达有关。

乌骨藤提取物通过调控PI3K/AKT/mTOR信号通路抑制黑色素瘤细胞的活力并诱导细胞凋亡

目的:探究乌骨藤提取物(Marsdenia tenacissima extract,MTE)对黑色素瘤细胞活力及凋亡的作用及机制。方法:用不同浓度(0、50、100和200 mg/L) MTE处理小鼠皮肤黑色素瘤B16-F10细胞24 h或不同浓度MTE处理不同时间(0、24、48、72和96 h),MTT法检测细胞活力。流式细胞术检测细胞凋亡情况,Western blot法检测细胞增殖、凋亡和PI3K/AKT/mTOR通路相关蛋白的表达,同时检测通路激动剂胰岛素样生长因子1(IGF-1)处理细胞后p-PI3K及细胞增殖和凋亡相关蛋白的表达。结果:根据预实验结果,选择MTE作用时间为72 h。MTE浓度为100 mg/L和200 mg/L时能明显抑制B16-F10细胞活力及增殖相关蛋白Ki67和PCNA的表达,并且还可诱导B16-F10细胞凋亡,提高凋亡相关蛋白cleaved caspase-3和cleaved caspase-9的蛋白水平;同时,MTE还可显著降低p-PI3K、p-AKT和mTOR的蛋白水平;此外,激动剂IGF-1可明显减弱MTE抑制细胞活力及诱导细胞凋亡的作用。结论:MTE可通过下调PI3K/AKT/mTOR通路活性抑制黑色素瘤细胞活力,诱导细胞凋亡。

激活Shh信号通路促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化

近年来骨组织工程技术迅猛发展,小鼠成肌细胞C2C12因其来源广泛等优点可望成为有效的种子细胞应用于组织工程.然而,对于C2C12细胞的成骨分化机制仍需深入研究.为了观察Sonic hedgehog(Shh)信号通路对骨形态发生蛋白9(bone morphogenetic proteins 9,BMP9)诱导的C2C12细胞成骨分化的影响,构建过表达腺病毒Ad-Shh,并作用于BMP9处理的C2C12细胞,检测碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)的变化,茜素红S染色检测钙盐沉积,RT-PCR检测Shh、骨桥蛋白(osteopontin,OPN)、骨钙素(osteocalcin,OCN)、Runx2、Dlx5、Id1和Id2基因表达,Western印迹检测Shh、OPN、OCN、Runx2和Dlx5的蛋白质表达,Micro-CT和H&E染色检测裸鼠皮下异位成骨包块情况.结果表明,活化Shh信号通路可促进BMP9诱导的C2C12细胞早晚期成骨分化,以及裸鼠皮下异位成骨.体内外实验证明,Shh信号通路能促进BMP9诱导小鼠成肌细胞C2C12向成骨分化.

左西孟旦对缺氧复氧诱导的H9c2细胞凋亡、PTEN和PI3K/Akt信号通路的影响

[目的]研究左西孟旦对缺氧复氧(H/R)条件下H9c2细胞凋亡的影响及相关机制。[方法]体外培养H9c2细胞,将细胞分为空白对照组、H/R组、左西孟旦低剂量组、左西孟旦中剂量组、左西孟旦高剂量组。采用四甲基偶氮噻唑蓝法检测H9c2细胞增殖;流式细胞仪检测H9c2细胞凋亡;超氧化物歧化酶(SOD)试剂盒、丙二醛(MDA)试剂盒分别检测SOD活性及MDA含量;荧光探针法检测活性氧(ROS)水平;Western blot检测增殖细胞核抗原(PCNA)、B淋巴细胞瘤2蛋白(Bcl-2)、Bcl-2相关X蛋白(Bax)、磷酸酶及张力蛋白同源物(PTEN)及磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/丝氨酸苏氨酸蛋白激酶(Akt)信号通路蛋白表达。[结果]与空白对照组比较,H/R组H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA含量、ROS水平、PTEN蛋白表达均显著升高(P<0.05),PCNA、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著降低,Bax显著升高(P<0.05)。与H/R组比较,左西孟旦低剂量组、左西孟旦中剂量组、左西孟旦高剂量组H9c2细胞增殖抑制率、凋亡率、MDA含量、ROS水平、PTEN蛋白表达均显著降低(P<0.05),PCNA、Bcl-2、p-PI3K/PI3K、p-Akt/Akt均显著升高,Bax显著降低(P<0.05);且左西孟旦剂量越高,上述指标的相应变化越明显。[结论]左西孟旦可能通过抑制PTEN并激活PI3K/Akt信号通路,促进H/R条件下H9c2细胞增殖,抑制细胞氧化应激和凋亡。

M3受体通过激活MEK1/2-ERK1/2信号通路促进H9c2心肌细胞生存

目的研究毒蕈碱型胆碱受体(M受体)对H9c2心肌细胞MEK1/2-ERK1/2信号通路的调控作用及其对细胞活力的影响。方法 H9c2心肌细胞用非选择性或选择性M受体拮抗药处理30 min之后,以氨甲酰胆碱刺激细胞,然后用Western Blot检测全细胞蛋白质中MEK1/2和ERK1/2磷酸化水平的变化,采用Alamar Blue法检测细胞活力。结果以氨甲酰胆碱刺激H9c2心肌细胞能显著增加MEK1/2和ERK1/2的磷酸化水平,这种活化作用可被非选择性M受体拮抗药阿托品完全阻断;M3受体选择性拮抗药DAU 5884可以阻断氨甲酰胆碱对MEK1/2-ERK1/2的激活,但M1、M2和M4受体的选择性拮抗药则没有这种阻断作用;在无血清的培养基中,氨甲酰胆碱能增加H9c2心肌细胞的生存能力,这种细胞保护作用可被阿托品和DAU 5884消除。结论在H9c2心肌细胞中,氨甲酰胆碱通过M3受体调控MEK1/2-ERK1/2信号通路,并由此促进细胞的生存。