贵州小型香猪与人五种CYP酶活性的比较

目的对比测定贵州小型香猪与人肝微粒体细胞色素CYP酶的五个主要亚型的活性,并对二者活性相似的亚型以特异性抑制剂进行抑制,观察抑制活性反应的相似性,比较二者的CYP酶特性,评估贵州小型香猪作为人体外药物代谢动力学研究实验动物模型的可行性及其可应用的药物代谢反应类型。方法制备贵州小型香猪和人的肝微粒体,构建肝微粒体和探针底物的反应体系以及抑制剂抑制反应的体系,利用HPLC测定CYP3A,CYP1A,CYP2A,CYP2D和CYP2E酶的探针底物与肝微粒体反应的活性,并对贵州小型香猪和人的相应活性值进行比较,选择活性最为相近的亚型进行特异性抑制。结果贵州小型香猪肝微粒体具有CYP酶的五个主要亚型的反应活性,其中CYP3A酶的两个特异反应即硝苯地平氧化反应,睾酮6β-羟化反应的活性值和人肝的相应活性接近。同时,二者的CYP3A酶的特异性抑制反应相似。结论贵州小型香猪适用于作为人的CYP3A酶及其相关药物代谢研究的良好动物模型。鉴于CYP3A酶是人体内Ⅰ相反应最主要的药物代谢酶,因此贵州小型香猪作为人体药代动物模型具有一定前景。

典型羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)小鼠肝微粒体的体外代谢及关键代谢CYP450酶系的研究

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)是一类具有内分泌干扰效应的酚类化合物,本研究以小鼠肝脏微粒体作为研究对象,考察了4种典型OH-PBDEs(3-OH-BDE-47、5-OH-BDE-47、6-OH-BDE-47和2′-OH-BDE-68)的体外代谢.研究结果表明,4种OH-PBDEs在小鼠肝脏微粒体中均能被代谢;OH-PBDE结构上的醚键(O)、羟基(OH)和溴原子(Br)的相对位置会影响其代谢效率,OH位于苯环上醚键邻位更有利于其代谢,即6-OH-BDE-47表现出相对较高的代谢率;抑制剂实验发现CYP1A2和CYP3A4是4种典型OH-PBDEs主要的CYP450代谢亚型.

UPLC-MS/MS结合多探针底物方法研究刺五加叶中黄酮苷类成分对CYP450活性的影响%

利用超高效液相色谱-串联质谱联用(UPLC-MS/MS)的多反应监测(MRM)技术结合多探针底物方法,研究了刺五加叶中的主要黄酮苷类化合物槲皮苷、金丝桃苷及芦丁对肝细胞色素P450酶(CYP450)亚型CYP1A2,CYP2C,CYP2E1,CYP2D和CYP3A活性的影响.结果表明,3种化合物对各CYP亚型酶均有抑制作用,其中金丝桃苷和槲皮苷对CYP1A2催化的非那西丁的O-脱乙基反应抑制的IC50值分别为46.53和49.75μmol/L,金丝桃苷和芦丁对CYP2E1催化的氯唑沙宗的6-羟基化反应抑制的IC50值分别为99.87和86.36μmol/L.机理性抑制实验结果表明,3种化合物对2种亚型酶的抑制作用是随着预孵时间延长而增强的机理性抑制.

等位基因特异性PCR检测CYP3A5和MDR-1基因多态性方法的建立及临床应用

目的用等位基因特异性PCR(ARMS-PCR)检测细胞色素P450酶CYP3A5(A6986G)和多药耐药基因MDR-1(C3435T)基因多态性,探讨其与肾移植受者他克莫司(Tac)血药浓度和剂量比的相关性。方法根据CYP3A5(A6986G)和MDR-1(C3435T)基因多态性位点分别设计ARMS-PCR引物,分析72例肾移植受者外周血基因组DNA中该2个基因位点的多态性,同时以DNA测序法为金标准进行验证。化学发光微粒子免疫分析法测定肾移植受者血Tac浓度,并比较术后1个月时不同基因型受者之间血Tac浓度、Tac剂量/Tac用量的差异。结果建立的ARMS-PCR法与DNA测序法检测符合率为100%。72例肾移植受者中,CYP3A5*1/*1、*1/*3和*3/*3基因型的发生频率分别为18.1%、31.9%和50.0%,MDR-1 C/C、C/T和T/T基因型的发生频率分别为27.8%、58.3%和13.9%。此外,不同CYP3A5基因型肾移植受者的血Tac浓度(P=0.014)和Tac浓度/Tac用量(P=0.019)均存在明显差异,进一步两两比较发现,CYP3A5*3/*3基因型受者血Tac浓度/Tac用量明显高于*1/*1和*1/*3基因型(P均<0.05)。结论成功建立检测CYP3A5和MDR-1基因多态性的ARMS-PCR法,肾移植受者CYP3A5*3基因多态性与Tac的药代动力学明显相关。

糖尿病和非糖尿病人群的CYP2C9基因多态性分析

目的:探索糖尿病患者和非糖尿病人群肝药酶细胞色素P450(CYP2C9)基因多态性。方法:对入选的研究对象使用CYP2C9基因分型实时荧光PCR试剂盒进行CYP2C9基因多态性检测。结果:本研究糖尿病患者380例,CYP2C9﹡1/﹡3基因型频率为4.21%;非糖尿病人群208例,CYP2C9﹡1/﹡3基因型频率为5.77%。糖尿病患者与非糖尿病人群比较,CYP2C9基因多态性分布差异无统计学意义。结论:糖尿病患者与非糖尿病人群均存在CYP2C9基因多态性,检测患者CYP2C9基因分型可提供用药参考。

苯并(a)芘对罗非鱼肝脏CYP1A1和GST活性的影响

以罗非鱼为试验动物,研究不同浓度(0.1、1、10和50μg·L-1)苯并(a)芘(BaP)暴露下,罗非鱼肝脏细胞色素P450亚酶1A1(CYP1A1)和谷胱甘肽-S-转移酶(GST)活性的变化。结果表明,0.1、1和10μg·L-13个浓度组罗非鱼肝脏CYP1A1活性与空白和丙酮溶剂对照组相比没有显著差异(P>0.05),50μg·L-1浓度组CYP1A1活性在6和168 h时受到显著诱导(P<0.05);0.1和1μg·L-1浓度组肝脏GST活性与空白和丙酮溶剂对照组相比无显著差异(P>0.05),10和50μg·L-1浓度组GST活性在336 h时与空白和丙酮溶剂对照组相比差异显著(P<0.05)。研究CYP1A1活性与GST活性之间的关系发现,两者的变化趋势相近,尤其是1和50μg·L-12个浓度组,表明这两者之间可能存在一定的对应关系。

Online SPE-LC-MS/MS法快速同时分析人血浆中5种CYP450酶探针药及6种代谢物

目的:建立人血浆中主要CYP450酶探针药及其特异代谢物的快速、准确定量分析方法,以开展药物-药物相互作用(DDI)的临床评价。方法:针对5种主要CYP450亚型,选择咖啡因(CYP1A2)、氯沙坦(CYP2C19)、奥美拉唑(CYP2C9)、右美沙芬(CYP2D6,CYP3A4)和咪哒唑仑(CYP3A4)组成鸡尾酒探针药组合。建立一种online SPE-LC-MS/MS方法对给予探针药后的人血浆样本进行分析。血浆样品通过葡萄糖醛酸酶水解进行前处理,采用Spark HySphere-C18 HD(10 mm×2 mm,7μm)为固相萃取柱,Shiseido MGⅢ(2.0 mm×100 mm,5μm)为分析柱,柱温40℃。以含0.01%甲酸的甲醇-乙腈(1∶1)-水溶液为流动相,梯度洗脱,流速为0.35 mL·min^(-1)。在质谱ESI源、正离子扫描方式下检测5种探针药及相应的6种代谢产物的母离子-子离子对。结果:所建立的分析方法可在5 min完成11种待测成分的分析。对方法学的验证表明所建立的方法对血浆样品分析具有专属性,定量范围内线性良好,无基质效应影响。中和高浓度下待测成分的批内和批间样品的RSD为2.1%~14.2%,LLOQ浓度下为2.1%~15.4%,准确度在86.4%~107.2%范围内。样品在室温、长期冻存、反复冻融及样品架放置条件下稳定性良好。采用该方法对服用鸡尾酒探针药后的人血浆样本进行了分析,检测出的5种探针药及6种代谢物浓度均在定量区间内,其中右美沙芬代谢物3-甲氧基吗啡喃浓度最低,均低于2 ng·mL^(-1)。结论:所建立的Online SPE-LCMS/MS分析方法快速、灵敏、准确,可应用于采用鸡尾酒探针的临床DDI研究和代谢酶活性评估。

胆宁片防治非酒精性脂肪肝的实验研究

目的研究胆宁片对大兔脂肪肝的防治作用。方法采用高胆固醇膳食致兔脂肪肝模型,研究胆宁片对大兔非酒精性脂肪肝的防治作用。结果模型组与胆宁片组的TC数值分别为(15.36±9.01)mg/dL、(2.67±5.35)mg/dL,TG分别为(1.11±0.42)mmol/L、(0.56±0.2)mmol/L,LDL-C分别为(13.16±7.39)mmol/L、(1.98+5.00)mmol/L,HDL-C分别为(0.49±0.23)mmol/L、(0.90±0.29)mmol/L,2组数据相比较,差异有显著性统计学意义(P<0.01),模型组新西兰兔的肝脏组织CYP7A1 mRNA表达较胆宁片组低,其中模型组与胆宁片组条带值分别为(0.56±0.14)(1.02±0.09),差异有统计学意义(P<0.001)。而模型组CYP2E1 mRNA表达较胆宁片组高,其中模型组与胆宁片组条带值分别为(1.49±0.31)(1.22±0.20),差异有统计学意义(P<0.05)。结论胆宁片对实验性大兔脂肪肝有一定的治疗作用。

甘遂半夏汤中甘遂甘草反药组合加减应用对腹水大鼠CYP450酶的影响

目的:从细胞色素(CY)P450酶的角度,以甘遂半夏汤复方为载体,探究腹水病理模型下甘遂甘草配伍“反”与“不反”。方法:150只Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、甘遂半夏汤全方组(5.68 g·kg^(-1)·d^(-1))、甘遂半夏汤全方去甘遂组(5.57 g·kg^(-1)·d^(-1))、甘遂半夏汤全方去甘草组(4.01 g·kg^(-1)·d^(-1))、甘遂半夏汤全方去甘草甘遂组(3.90 g·kg^(-1)·d^(-1)),其中甘遂1.1 g、法半夏9 g、白芍15 g、炙甘草16.7 g、蜂蜜15 g,每组25只,除正常组外,其余各组大鼠腹腔注射Walker-256细胞复制大鼠癌性腹水模型,正常组、模型组灌胃蒸馏水,其余给药组灌胃相应药液,连续给药7 d;用高效液相色谱法(HPLC)检测探针药物浓度,通过计算代谢率来测定CYP450酶活性;用实时荧光定量聚合酶链式反应(Real-time PCR)测定CYP450酶基因表达;用蛋白免疫印迹法(Western blot)测定CYP450酶蛋白表达。结果:与正常组比较,模型组CYP1A2、CYP2C9活性升高,CYP2E1、CYP2C19、CYP3A4活性降低,CYP2E1、CYP2C19、CYP2C9、CYP3A4 mRNA表达及CYP2E1、CYP3A4蛋白表达均降低(P<0.05)。与模型组比较,甘遂半夏汤全方组CYP2C9活性降低,CYP3A4 mRNA表达升高(P<0.01);去遂组CYP1A2活性降低、CYP2E1、CYP3A4活性升高,CYP1A2、CYP2E1、CYP2C19、CYP3A4 mRNA表达及CYP2E1、CYP3A4蛋白表达升高(P<0.05);去草组CYP2C9活性降低、CYP3A4活性升高,CYP2E1、CYP2C19 mRNA表达升高(P<0.05);双去组CYP2C9活性降低、CYP3A4活性升高、CYP3A4 mRNA表达升高(P<0.01)。与全方组比较,去遂组CYP2E1、CYP2C9、CYP3A4活性升高,CYP1A2、CYP2C19、CYP3A4 mRNA表达及CYP3A4蛋白表达升高(P<0.05);去草组CYP2C9、CYP3A4活性升高、CYP2C19mRNA表达升高,CYP3A4 mRNA表达降低(P<0.05);双去组CYP2C9、CYP3A4活性升高(P<0.01)。结论:4个给药组在CYP450酶的角度均表现出一定的药效,其中全方去甘遂组效果最佳,优于全方组。甘遂甘草反药组合在甘遂半夏汤全方中未表现出“相反”,但是有一定的减效作用,该实验条件下甘遂甘草配伍更接近于七情配伍中“相恶”的配伍关系。

基于超高效液相色谱-质谱联用技术的人参皂苷体外Ⅰ相代谢研究

口服药物必须经过胃肠道的吸收代谢等过程才能进入体内发挥疗效,但是药物体内代谢的复杂性使其研究相对困难。因此,建立药物的体外代谢模型研究其代谢产物及代谢规律是简单且必要的实验手段。本研究采用离体肠道菌厌氧培养法对人参皂苷提取物进行体外培养,利用超高效液相色谱-质谱联用法(UPLC/MS)检测分析肠内菌代谢产物。通过比较代谢前后的化学指纹图,共检测到25种三醇型、15种二醇型人参皂苷体外肠内菌代谢物和1种齐墩果酸型体外肠内菌代谢物,这些代谢物主要通过去糖基作用产生,同时包括部分氧化还原反应。实验进一步对人参皂苷的主要肠内菌代谢物(包括Rh_1、Rh_2、Compound K、F1)进行体外肝细胞色素P450酶(CYP450)代谢研究,均检测到氧化还原反应代谢产物。结果表明,人参皂苷类成分在肠道菌群作用下主要产生去糖基化产物,而在CYP450作用下主要产生羟基化等氧化还原反应产物。该结果可为人参皂苷类成分的体内代谢研究提供重要参考。

CYP2E1酶活性与正己烷氧化损伤的相关性

将48只小鼠随机分为低、中、高剂量染毒组和对照组,染毒组分别以500、1 000、2 000 mg/kg正己烷灌胃染毒,对照组灌服等容量的溶剂花生油。灌胃容量0.1 ml/10 g,1次/d,3周后脱臼处死,摘取肝脏制备肝匀浆组织液。检测正己烷体内代谢酶CYP2E1的活性、丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的含量。随着染毒剂量的增加,肝脏指数有增大的趋势(F=8.015,P=0.000),肝组织中CYP2E1的活性、髓鞘碱性蛋白(MBP)和MDA含量有增加的趋势,SOD水平明显降低(F=4.771,P=0.010)。Pearson相关分析显示,CYP2E1酶活性与肝组织内SOD和MBP含量呈正相关性。表明正己烷对小鼠的CYP2E1酶具有激活作用,随着正己烷浓度的增加,机体启动抗氧化保护机制,CYP2E1酶活性被抑制,正己烷产生氧化损伤和神经功能损伤叠加作用,加重了正己烷的毒性损伤。

异鼠李素对人肝微粒体CYPs活性及大鼠原代肝细胞毒性作用研究

目的研究异鼠李素对肝脏6种CYPs的体外抑制作用,以及对大鼠原代肝细胞的毒性作用。方法采用人肝微粒体(HLMs)体外温孵法研究异鼠李素对6种细胞色素P450酶(CYPs)——CYP2C19、CYP2D6、CYP3A4、CYP2E1、CYP1A2和CYP2C9的体外抑制作用;使用HPLC-MS/MS法检测异鼠李素和HLMs共同孵育后的代谢产物;利用体外培养的低CYPs活性的大鼠原代肝细胞,考察不同剂量异鼠李素对细胞培养液中乳酸脱氢酶(LDH)、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天门冬氨酸氨基转移酶(AST)的影响。结果 50μmol/L的异鼠李素对CYP2E1和CYP1A2有一定的抑制作用,抑制率分别为59.48%和39.91%;异鼠李素和HLMs共同孵育后,产生去甲基化代谢产物3,3’,4’,5,7-五羟基黄酮,转化为极性和水溶性较高的代谢物;30、100、300μmol/L的异鼠李素会使大鼠原代肝细胞培养液中的ALT和LDH显著上升(P<0.01),100、300μmol/L异鼠李素使AST显著上升(P<0.05、0.01),呈浓度相关性。结论异鼠李素在体外主要经HLMs代谢,同时对CYP2E1和CYP1A2有一定的抑制作用,可能会使CYP2E1和CYP1A2的底物药物在体内的浓度产生变化,导致一系列药物的相互作用;大量使用异鼠李素可能会造成一定程度的肝细胞损伤,且呈现浓度相关性。临床应用应合理设置剂量,并注意潜在的药物之间的相互作用。

醋酸甲羟孕酮暴露致食蚊鱼的雄激素效应

目的 探讨人工合成孕激素（醋酸甲羟孕酮,MPA）暴露对雌性食蚊鱼（Gambusia affinis）的雄激素效应.方法 将成年雌性食蚊鱼随机分为4组,包括对照组和40 ng/L（低密度组）、200 ng/L（中密度组）和1 000 ng/L（高密度组）等3个MPA实验暴露组,并设置平行组.持续暴露28 d后观察与测定食蚊鱼的体长（BL）、体质量（BW）、身体健康指数（CF）、臀鳍第3鳍条分节数（FJ）、第4、5、6鳍条长度（FL）变化和第14、15、16椎体脉棘的形态变化等5项指标,并在7d、14d、21 d、28 d测定了卵黄蛋白原基因（VTGα）、雄激素受体基因（ARα）和细胞色素P450芳香化酶基因（CYP19α）mRNA表达水平的变化.结果 食蚊鱼经MPA暴露28d后,与对照组相比,200 ng/L和1 000 ng/L实验组食蚊鱼的BL、BW和CF均无明显变化（分别P＞0.05）.臀鳍第3鳍条分节数和第6鳍条长度变化不明显（P＞0.05）,但第4、5鳍条的长度显著增加（P＜0.01）.暴露在200 ng/L和1 000 ng/L MPA中、高浓度组食蚊鱼的第14椎体脉棘的总长（L）、尾部尖端到脊的高度（D）值,第15椎体脉棘的投影长（P）、P∶D值和第16椎体脉棘的P、L∶D、P∶D值分别呈现显著性变化（P＜0.05或P＜0.01）,椎体脉棘伸长,且与脊椎骨接近垂直,显示形态雄性化效应.与对照组相比,低浓度组（40 ng/LMPA） VTGα,CYP19α基因的表达量上升（P＜0.01）,而ARα表达被抑制（P＜0.05）;中浓度组VTGα,CYP19α,ARα基因的表达量都显著上升（P＜0.01）;高浓度组CYP19α,ARα基因的表达量显著上升（P＜0.01）,而VTGα的表达量则被抑制（P＜0.01）.结论 MPA暴露致雌性食蚊鱼骨骼出现形态雄性化,目标基因表达水平的变化结果证明MPA对食蚊鱼具雄激素效应,表明MPA是一种具有雄激素效应的孕激素.

酒精性肝病与CYP2E1的变化

目的介绍酒精性肝病患者肝脏细胞色素酶P4502E1(CYP2E1)的变化和CYP2E1改变对药物代谢的影响及影响机制,以期对酒精性肝病患者合理用药有所帮助。方法根据酒精性肝病导致CYP2E1表达增多,综述CYP2E1表达升高对相关小分子化合物和药物代谢产生的影响。结果与CYP2E1代谢相关的很多化合物和药物会在酒精性肝病人群中产生不良反应。结论 CYP2E1表达增多是酒精性肝病患者对一些药物产生不良反应的原因。

主要抗结核药物致肝脏损伤的关联性研究

抗结核药物在杀灭结核菌的同时,因其特殊的药理学活性使其必然对机体产生毒性,包括对代谢器官的毒性、个体差异所致的变态反应及外界各种因素的影响。临床多采用多种药物联合治疗各种结核病,多种药物的代谢均经肝脏的氧化还原结合反应,此期间易产生活化中间产物,造成肝脏损害,排泄过程易造成肝脏损害,但机制不甚明了,造成临床不能预知损害的发生,没有针对性的药物应用,所以迫切需要建立抗结核药物的肝脏损伤模型,研究常用抗结核药物致肝脏损害的机制,探讨与脂质过氧化的相关性,了解不同抗结核药物组合对肝脏损伤程度,分析抗结核药物对肝脏损害的发生、发展过程,以及药物间相互作用的规律。

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)在小鼠肝脏S9中的体外代谢研究

羟基化多溴联苯醚(OH-PBDEs)是一类具有内分泌干扰性质的酚类化合物,且内分泌干扰效应大于其母体多溴联苯醚(PBDEs),研究OH-PBDEs的体外代谢行为对于理解其在生物体内的富集转化具有重要意义.以小鼠肝脏S9部分作为研究对象,考察了3-OH-BDE-47、5-OHBDE-47、6-OH-BDE-47和2'-OH-BDE-68在小鼠肝脏中的体外代谢.结果表明小鼠肝脏S9中的I相酶和II相酶均能代谢4种OH-PBDEs;醚键与OH官能团及Br原子互为邻位时,I相酶对OH-PBDEs的代谢率最高,即6-OH-BDE-47表现出较高的代谢率,此外,4种OH-PBDEs经I相酶代谢后均能生成2,4-二溴苯酚,表明醚键断裂是其主要的I相酶代谢途径;OH-PBDEs的OH官能团与醚键互为间位时,II相酶对其葡萄糖醛酸结合反应最高,也就是5-OH-BDE-47表现出较高的去除率.