人类白细胞抗原-DQA1、细胞色素P4503A5*3基因多态性与特发性膜性肾病遗传易感性关联性研究

目的:探讨分析人类白细胞抗原(HLA)-DQA1、细胞色素P450(CYP)3A5*3基因多态性与特发性膜性肾病(IMN)遗传易感性的关联性。方法:将IMN患者62例作为研究组,另将健康者62例作为对照组。采用聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序技术检测入组患者的HLA-DQA1(rs2187668)、CYP3A5*3(rs776746)基因型,判断各基因型与IMN患者的关系。结果:研究组中HLA-DQA1 rs2187668基因型AA占比高于对照组(P<0.05),基因型GG、AG占比低于对照组(均P<0.05);研究组等位基因A占比高于对照组(P<0.05)。研究组与对照组CYP3A5*3 rs776746不同基因型占比及等位基因占比比较无统计学差异(均P>0.05)。HLA-DQA1 rs2187668AA基因型IMN患者24 h尿蛋白量和血肌酐水平显著高于AG和GG型,肾小球滤过率显著低于AG和GG型(均P<0.05)。结论:HLA-DQA1 rs2187668位点的基因多态性与IMN的发生有关,AA基因型和等位基因A可增加IMN易感性。

lncRNA HCP5靶向miR-409-3p对皮肤鳞状细胞癌细胞增殖、迁移和侵袭的影响

目的:探讨lncRNA HCP5靶向mlR-409-3p对皮肤鳞状细胞癌(CSCC)细胞增殖、迁移和侵袭的影响。方法:采用qRT-PCR法检测CSCC细胞(SCC13、A431、HSC-5)中HCP5和miR-409-3p的表达情况,筛选用于实验的CSCC细胞。将抑制HCP5表达的质粒si-HCP5及其对照(si-NC)、过表达miR-409-3p的miR-409-3p模拟物及其对照(miR-NC)、抑制HCP5和miR-409-3p的si-HCP5+anti-miR-409-3p及其对照(si-HCP5+anti-miR-NC)分别转染SCC13细胞。采用CCK-8法和Transwell实验检测SCC13细胞增殖、迁移、侵袭能力,Western blot法检测细胞周期蛋白D1(CyclinD1)、基质金属蛋白酶(MMP)2、MMP9蛋白表达水平。通过双荧光素酶报告基因实验验证HCP5和miR-409-3p的靶向关系。结果:SCC13细胞中HCP5表达最高,miR-409-3p表达最低(P<0.05)。抑制HCP5表达后SCC13细胞增殖能力降低,细胞迁移数和侵袭数减少,CycIinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低(P<0.05)。过表达miR-409-3p后SCC13细胞增殖能力降低,细胞迁移数和侵袭数减少,CycinD1、MMP2、MMP9蛋白表达水平降低(P<0.05)。双荧光素酶报告基因实验结果显示lncRNA HCP5和miR-409-3p存在靶向关系。抑制miR-409-3p表达可减弱HCP5低表达对SCC13细胞增殖以及迁移、侵袭能力的影响(P<0.05)。结论:抑制HCP5可通过靶向促进miR-409-3p表达来抑制CSCC细胞增殖、迁移和侵袭。

miRNA-432-5p在脂多糖诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制研究

目的探讨miRNA-432-5p在脂多糖(LPS)诱导的肺泡上皮细胞损伤中的作用及可能机制。方法人肺泡上皮细胞A549随机分为对照组、LPS组、miRNA-432-5p mimics组及miRNA-432-5p siRNA组。利用CCK-8实验检测细胞的活性;利用ELISA法检测细胞培养液中炎性因子肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素1β(IL-1β)的含量;利用RT-qPCR检测细胞中miRNA-432-5p mRNA的表达;利用Hoechst染色检测细胞的凋亡情况;利用Western blot检测细胞中NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3(NLRP3)、半胱氨酸蛋白酶1(Caspase1)、白细胞介素1β(IL-1β)蛋白的表达。结果LPS组细胞的活性OD值(6 h:0.809±0.09;12 h:0.601±0.09;24 h:0.485±0.43)明显低于对照组的1.000±0.00,差异均具有统计学意义(P<0.05);LPS组细胞中miRNA-432-5p mRNA表达水平为1.563±0.10,明显高于对照组的1.000±0.00,细胞凋亡率为(41.52±1.83)%,明显高于对照组的(0.000±0.00)%,差异均有统计学意义(P<0.05);LPS组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,明显高于对照组的(5.27±0.84)pg/mL、(5.57±0.65)pg/mL、(3.26±0.85)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05),LPS组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,明显高于对照组的0.163±0.03、0.025±0.01、0.032±0.01,差异均具有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p mimics组细胞凋亡率为(24.23±3.09)%,明显低于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.639±0.09,明显高于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(22.85±4.01)pg/mL、(29.15±5.22)pg/mL、(20.63±3.89)pg/mL,明显低于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均具有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p mimics组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.473±0.04、0.121±0.02、0.279±0.04,明显低于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均有统计学意义(P<0.05)。miRNA-432-5p siRNA组细胞凋亡率为(56.44±3.25)%,明显高于LPS组的(41.52±1.83)%,细胞活性为0.348±0.06,明显低于LPS组的0.468±0.07,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组培养液中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量分别为(51.08±4.12)pg/mL、(53.61±4.83)pg/mL、(59.97±3.62)pg/mL,明显高于LPS组的(36.32±6.07)pg/mL、(45.08±3.75)pg/mL、(40.87±6.65)pg/mL,差异均有统计学意义(P<0.05);miRNA-432-5p siRNA组细胞中的NLRP3、Caspase1和IL-1β蛋白表达水平分别为0.969±0.12、0.430±0.09、0.575±0.07,明显高于LPS组的0.734±0.08、0.305±0.06、0.430±0.05,差异均具有统计学意义(P<0.05)。结论miRNA-432-5p可通过抑制NLRP3炎性小体通路的激活,对受损细胞发挥保护作用。

miR-93-5p通过PI3K/AKT通路调控HepG2细胞自噬

目的:探究miR-93-5p对HepG2细胞增殖、自噬、葡萄糖消耗以及磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinases,PI3K)/蛋白激酶B(protein kinase B,AKT)通路的影响。方法:高浓度葡萄糖诱导构建胰岛素抵抗(insulin resistance,IR)细胞模型,设计合成miR-93-5p inhibitor和NC,结合自噬抑制剂3-MA,将细胞分为Control组、IR组、IR+inhibitor NC组、IR+inhibitor组、IR+3-MA+inhibitor组。CCK8法检测各组细胞增殖活力,试剂盒检测各组细胞葡萄糖消耗量和细胞糖原合成情况,Western-Blot法检测细胞自噬基因微管相关蛋白1轻链3(autophagy genes microtubule-associated protein 1 light chain 3,LC3)-I、LC3-II、肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor,HGF)蛋白、PI3K/AKT通路蛋白(AKT、p-AKT)的表达。结果:与对照组相比,IR组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达下降(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均增加(P<0.01)。与IR组和IR+inhibitor NC组相比,IR+inhibitor组细胞增殖活力、葡萄糖消耗量和细胞糖原合成量、HGF蛋白、LC3-II蛋白表达增加(P<0.01),LC3-I蛋白和p-AKT/AKT值表达均下降(P<0.01)。与IR+inhibitor组相比,3-MA能逆转miR-93-5p inhibitor的作用。结论:miR-93-5p通过PI3K/AKT通路促进HepG2细胞自噬,进而抑制胰岛素抵抗,缓解糖尿病造成的机体损伤。

miR-574-3p在三阴性乳腺癌细胞紫杉醇药物敏感性中的作用

目的研究miR-574-3p在三阴性乳腺癌细胞紫杉醇(PTX)药物敏感性中的作用。方法构建稳定转染细胞株,根据细胞转染情况分为未转染组、miR-阴性对照(miR-NC)组和miR-574-3p过表达组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测不同浓度紫杉醇作用下细胞增殖情况(未转染组设置亚组:空白组和对照组),实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测色素框同源物2(CBX2)mRNA的表达水平,Western blot法检测CBX2蛋白的表达水平,Transwell检测细胞侵袭迁移力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果CCK-8法检测结果显示,紫杉醇对各组三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制呈一定的浓度依赖性,但不同浓度紫杉醇(0.05、0.15、0.45、1.35、4.05、8.10μmol/L)作用下,miR-574-3p过表达组生长抑制作用均高于对照组与miR-NC组(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞中CBX2 mRNA表达水平低于未转染组和miR-NC组(P<0.05);Western blot结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞中CBX2蛋白表达水平低于未转染组和miRNC组(P<0.05);Transwell检测及划痕实验检测结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞侵袭迁移能力低于未转染组和miR-NC组(P均<0.05)。结论miR-574-3p可能通过下调CBX2增强三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。

miR-126-5p通过靶向TRAF3抑制糖氧剥夺再灌注介导的HT22细胞凋亡和炎症

目的探讨miR-126-5p通过靶向肿瘤坏死因子受体相关因子3(tumor necrosis factor receptor-associated factor 3,TRAF3)对糖氧剥夺再灌注(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)介导的小鼠海马神经元细胞HT22细胞凋亡和炎症的影响。方法模拟缺血/再灌注损伤(ischemia/reperfusion,I/R)损伤在体外建立氧糖剥夺/复氧(oxygen-glucose deprivation/reperfusion,OGD/R)细胞模型,分析miR-126-5p与TRAF3靶向关系及对HT22细胞凋亡和炎症反应的影响。结果与对照组比较,OGD/R组中miR-126-5p下调而TRAF3 mRNA及蛋白水平上调,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平降低,乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平升高(P均<0.05)。与OGD/R+mimic-NC组比较,OGD/R+miR-mimic组、OGD+miR-mimic+pcDNA组TRAF3蛋白水平、LDH释放量、细胞凋亡率、Bax及Cleaved caspase-3蛋白水平明显降低,细胞存活率及Bcl-2蛋白水平升高,而OGD+miR-mimic+pcDNA-TRAF3组各指标升高,细胞存活率明显下降(P均<0.05)。结论miR-126-5p通过靶向TRAF3,抑制OGD/R介导的HT22细胞凋亡和炎症反应,从而对神经元细胞发挥保护作用。

METTL3调控miR-126-5p对人肾小球系膜细胞焦亡的影响及机制研究

目的:研究甲基转移酶样蛋白3(METTL3)调控miR-126-5p对人肾小球系膜细胞(HRMC)焦亡的影响并探讨潜在机制。方法:将HRMC分为7组,即对照组、高糖处理组、pcD-null组、pcD-METTL3组、pcD-METTL3+miR-126-5p抑制剂(inhibitor)组、pcD-METTL3+inhibitor-NC组、pcD-METTL3+inhibitor+AKT抑制剂(AZD5363)组。用流式细胞仪检测细胞焦亡,实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测miR-126-5p表达,western blotting检测METTL3、Gasdermin D、NLRP3、磷酸化(p-)AKT、p-NF-κB表达。用RNA甲基化免疫沉淀技术(Me-RIP)测定miR-126-5p前体的m6A修饰水平。结果:与对照组比较较,高糖处理组细胞焦亡增多,miR-126-5p前体N6-甲基腺苷(m6A)修饰增加,p-AKT和p-NF-κB表达水平升高,METTL3和miR-126-5p表达水平降低(均P<0.05)。转染METTL3过表达载体后,高糖处理的细胞上述指标发生了显著逆转(均P<0.05)。而在过表达METTL3的基础上加入miR-126-5p inhibitor后,miR-126-5p表达下调,细胞焦亡增多,p-AKT、p-NF-κB表达上调(均P<0.05),但METTL3表达水平和miR-126-5p前体m6A修饰无显著变化(P>0.05)。在过表达METTL3的基础上加入AZD5363后,细胞焦亡减少(P<0.05),p-AKT、p-NF-κB表达下调,METTL3和miR-126-5p表达及miR-126-5p前体m6A修饰无显著改变(P>0.05)。结论:METTL3促进miR-126-5p的m6A甲基化,并通过抑制AKT/NF-κB信号通路减少高糖诱导的肾小球系膜细胞焦亡。

bta-miR-27a-5p的生物信息学分析及其对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响

为了探究bta-miR-27a-5p的生物学特性及其对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响,试验利用miRBase数据库对不同物种间miR-27a-5p的保守性进行分析,并构建了miR-27a-5p的系统进化树;利用TargetScan和miRWalk在线网站预测bta-miR-27a-5p的靶基因,并对靶基因进行GO功能注释和KEGG信号通路分析;利用实时荧光定量PCR方法检测在不同月龄夏南牛不同器官中bta-miR-27a-5p基因的相对表达量;最后通过实时荧光定量PCR方法、Western-blot检测、三酰甘油浓度测定和油红O染色探究过表达bta-miR-27a-5p后对3T3-L1前脂肪细胞分化的影响。结果表明:不同物种miR-27a-5p的成熟序列保守性较高;牛miR-27a-5p基因与山羊的亲缘关系最近,与非洲爪蟾的亲缘关系最远;bta-miR-27a-5p靶基因主要在细胞过程、生物过程、细胞、细胞部分、结合等GO条目上富集,并富集在胰岛素抵抗、细胞衰老、脂肪细胞因子等信号通路中;bta-miR-27a-5p基因可在夏南牛的多个器官中表达,且12月龄夏南牛脂肪组织中的相对表达量均显著低于0月龄和24月龄(P<0.05);过表达bta-miR-27a-5p基因可显著或极显著抑制C/EBPα、PPARγ和FABP4基因和蛋白质表达(P<0.05或P<0.01),并显著或极显著降低3T3-L1前脂肪细胞内脂滴和三酰甘油浓度(P<0.05或P<0.01)。说明bta-miR-27a-5p在不同物种间高度保守,在不同月龄夏南牛脂肪组织中显著差异表达,并且能抑制3T3-L1前脂肪细胞分化,bta-miR-27a-5p基因可能是调控牛脂肪生成的候选miRNA。

脂肪干细胞对心肌梗死大鼠心肌组织中miR-423-5p及PI3K/AKT通路的影响

目的探讨脂肪干细胞(ADSCs)对心肌梗死模型大鼠心肌组织中miR-423-5p、PI3K、AKT的影响。方法将实验大鼠随机分为对照组、心梗模型组(模型组)、心梗模型+rADSCs组(干预组),每组6只。对照组大鼠麻醉后仅开胸后缝合,模型组、干预组大鼠麻醉后结扎前降支,干预组在缝合前心脏原位注射大鼠脂肪干细胞(10^(6)个细胞/只)。观测并称量各组大鼠心脏质量,用HE染色及Masson染色观察心肌组织病理变化,实时荧光定量PCR检测miR-423-5p、PI3K、AKT的mRNA表达情况,Western blot方法检测AKT、p-AKT、PI3K、p-PI3K的蛋白表达。结果与对照组相比,模型组、干预组大鼠的心脏组织质量显著升高,其中模型组与对照组间差异有统计学意义(P<0.05);病理结果显示模型组大鼠心肌细胞排列紊乱,细胞变性坏死严重,胶原纤维沉淀,可见明显的炎性浸润,干预组的大鼠心肌细胞的坏死情况、炎性浸润、胶原纤维沉淀较模型组明显降低;与对照组相比,模型组大鼠心肌组织中PI3K、AKT、miR-423-5p的mRNA表达水平和p-PI3K、p-AKT的蛋白表达水平显著升高(P<0.05);干预组中以上指标的表达水平较模型组显著降低(P<0.05)。结论大鼠脂肪干细胞可以降低心梗模型大鼠心肌组织损伤和纤维化,改善梗死后的心功能。其内在调控机制可能为分泌miR-423-5p,抑制PI3K、AKT的转录水平和蛋白磷酸化水平,发挥保护和治疗心肌梗死的作用。

过表达miRNA-424-5p靶向AKT3对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡的影响

[目的]本试验通过过表达miRNA-424-5p,明确miRNA-424-5p与其靶基因丝氨酸/苏氨酸激酶3(AKT serine/threonine kinase 3,AKT3)对奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡影响的机制,为阐明miRNA-424-5p在奶牛胎盘分离过程中的作用机制提供试验基础和理论依据。[方法]试验分为3组:空白对照组(Control)、阴性对照组(miRNA-424-5p mimics NC)和过表达组(miRNA-424-5p mimics)。采用茎环法实时荧光定量PCR检测转染miRNA-424-5p mimics后奶牛子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p的表达变化;采用Western blotting及实时荧光定量PCR检测过表达后AKT3和凋亡相关因子的表达变化,采用Annexin V-FITC/PI法检测奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡情况。[结果]与空白对照及阴性对照组相比,转染miRNA-424-5p mimics后子宫内膜上皮细胞miRNA-424-5p mRNA的表达量极显著升高(P<0.01),B淋巴细胞瘤-2(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)相关X蛋白(Bax)、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3(cysteinyl aspartate specific proteinase 3,Caspase3)和Caspase9的mRNA表达量极显著升高(P<0.01),AKT3和Bcl-2的mRNA表达量极显著降低(P<0.01);Bax和Caspase3蛋白表达量极显著升高(P<0.01),Caspase9蛋白表达量显著升高(P<0.05),AKT3和Bcl-2蛋白表达量极显著降低(P<0.01);细胞凋亡率极显著升高(P<0.01)。[结论]过表达miRNA-424-5p可通过靶向调控AKT3使奶牛子宫内膜上皮细胞凋亡因子Bax、Caspase3和Caspase9的表达量增加,使Bcl-2的表达量降低,进而促进细胞凋亡。

miR-141-5p影响黏膜黑色素瘤细胞生物学行为的机制研究

目的探讨miR-141-5p在黏膜黑色素瘤(MM)组织及细胞中的表达及其意义,分析其影响MM细胞生物学行为的机制。方法回顾性收集2015年1月至2020年12月温州医科大学附属第一医院手术切除的MM和色素痣组织标本。qRT-PCR法检测并比较MM和色素痣组织、MM细胞株A375和人角质形成细胞株HaCaT中miR-141-5p、细胞外信号调节激酶(ERK)1/2 mRNA的相对表达量。采用Pearson相关分析miR-141-5p与ERK1/2 mRNA相对表达量的相关性。A375分别用miR-141-5p模拟物(模拟物组)、miR-141-5p模拟物对照(模拟物对照组)、miR-141-5p抑制物(抑制物组)和miR-141-5p抑制物对照(抑制物对照组)处理;采用qRT-PCR检测并比较4组细胞中miR-141-5p相对表达量;采用细胞计数(CCK)-8法、克隆形成实验、流式细胞术、划痕实验和Transwell侵袭实验观察并比较4组细胞存活率、增殖能力、细胞凋亡比例和细胞迁移、侵袭能力;采用Western blot法观察并比较4组细胞ERK1/2、磷酸化的ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白相对表达量。采用HE染色、免疫组化染色观察MM和色素痣组织形态并检测p-ERK1/2、ERK1/2表达水平,比较不同p-ERK1/2、ERK1/2表达情况MM患者临床病理特征差异。结果miR-141-5p和ERK1/2 mRNA在MM组织和A375中表达下调(均P<0.01);Pearson相关分析显示,miR-141-5p与ERK1/2 mRNA相对表达量呈正相关(P<0.05)。相比对照组,模拟物组细胞增殖和迁移、侵袭能力显著降低,细胞凋亡比例升高,抑制物组细胞增殖和迁移、侵袭能力升高,细胞凋亡比例降低(均P<0.05)。相比对照组,模拟物组细胞p-ERK1/2蛋白相对表达量显著升高,抑制物组显著降低(均P<0.05)。MM组织中ERK1/2与p-ERK1/2蛋白表达明显减少(均P<0.05)。p-ERK1/2阴性组和阳性组、ERK1/2阴性组和阳性组不同临床病理特征比较,差异均无统计学意义(均P>0.05)。结论miR-141-5p可能通过ERK1/2通路影响MM细胞生物学行为。

LncRNA HAGLR靶向miR-625-5p对脂多糖诱导的视网膜色素上皮细胞凋亡和炎症因子表达的影响

目的 探讨长链非编码RNA HAGLR(LncRNA HAGLR)是否可通过靶向调控微小RNA-625-5p(miR-625-5p)表达而影响脂多糖(LPS)诱导的视网膜色素上皮(RPE)细胞凋亡、炎症因子表达,为揭示视网膜病变机制奠定实验基础。方法 将LPS诱导人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19)设为LPS组,正常培养的ARPE-19细胞设为Con组。实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)检测LncRNA HAGLR、miR-625-5p表达水平。根据转染物不同分为LPS+sh-NC组、LPS+sh-HAGLR组、LPS+miR-NC组、LPS+miR-625-5p组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组、LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组。采用流式细胞术检测细胞凋亡率;ELISA法检测白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-1β(IL-1β)水平;验证LncRNA HAGLR、miR-625-5p靶向关系;Western blot检测活化的半胱氨酸天冬氨酸特异性蛋白酶3(cleaved-Caspase 3)、cleaved-Caspase 9蛋白水平。结果 与Con组比较,LPS组LncRNA HAGLR表达水平升高,miR-625-5p表达水平降低(均为P<0.05),细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均为P<0.05)。与LPS+sh-NC组比较,LPS+sh-HAGLR组细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均为P<0.05);LncRNA HAGLR可负向调控miR-625-5p表达水平(P<0.05)。与LPS+miR-NC组比较,LPS+miR-625-5p组miR-625-5p表达水平升高,细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均降低(均为P<0.05)。与LPS+sh-HAGLR+anti-miR-NC组比较,LPS+sh-HAGLR+anti-miR-625-5p组miR-625-5p表达水平降低,细胞凋亡率,cleaved-Caspase 3、cleaved-Caspase 9蛋白水平,IL-6、IL-1β水平均升高(均为P<0.05)。结论 干扰LncRNA HAGLR表达可通过靶向调控miR-625-5p表达抑制细胞凋亡、炎症因子表达,以减轻LPS诱导的ARPE-19细胞损伤。

miR-133a-5p调控细胞焦亡抑制宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭

目的:研究miR-133a-5p靶向半胱天冬酶3(caspase-3)调控细胞焦亡对宫颈癌细胞增殖、迁移和侵袭的作用机制。方法:以Hela细胞为研究对象并分为Control组(正常培养宫颈癌Hela细胞)、mimic-NC组(宫颈癌Hela细胞转染mimic-NC)和miR-133a-5p mimic组(宫颈癌Hela细胞转染miR-133a-5p mimic过表达);利用CCK-8检测细胞增殖,染色法检测细胞迁移和细胞侵袭,ELISA检测活性氧(ROS)水平,流式细胞术检测细胞凋亡水平,蛋白质印迹法检测caspase-3、cleaved caspase-3、GSDME和GSDME-NT蛋白的表达水平,实时荧光定量聚合酶链反应检测caspase-3和miR-133a-5p的mRNA表达水平。结果:对照组和mimic-NC组的细胞增殖、迁移和侵袭结果对比没有明显差异,而miR-133a-5p mimic组细胞增殖、迁移和侵袭结果相较于mimic-NC组明显被抑制(均P<0.05);流式细胞术检测结果发现miR-133a-5p mimic组细胞凋亡水平明显高于mimic-NC组(P<0.05);ELISA检测结果发现miR-133a-5p mimic组ROS水平明显高于mimic-NC组(P<0.05);Western Blot和PCR检测结果发现与mimic-NC组相比,过表达miR-133a-5p能够明显提升cleaved caspase-3和GSDME-NT的表达,降低caspase-3和GSDME的表达(P<0.05)。结论:miR-133a-5p对Hela细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用或与靶向调控caspase-3来调节Hela细胞焦亡相关,对caspase-3/GSDME通路的干预有望成为宫颈癌治疗的新方向。

miR-26a-5p调控PTEN/PI3K/Akt信号通路对高糖诱导视网膜Müller细胞活化及凋亡的影响

目的检测微小RNA-26a-5p(microRNA-26a-5p,miR-26a-5p)对PTEN/PI3K/Akt信号通路及高糖刺激的视网膜Müller细胞凋亡的影响,探讨糖尿病视网膜神经损伤的潜在机制。方法采用不同浓度的葡萄糖刺激视网膜Müller细胞构建糖尿病视网膜神经损伤模型,采用CCK-8及流式细胞仪观察细胞增殖及凋亡情况,细胞转染过表达miR-26a-5p模拟物,Real-time PCR检测miR-26a-5p、PTEN、PI3K、Akt的表达情况,ELISA测定细胞上清液中IL-1β及IL-6的水平,采用Graphpad 8.0软件处理数据。结果高糖刺激视网膜Müller细胞生长活跃,与对照组相比,50 mmol/L高糖刺激Müller细胞活力在12 h、24 h时逐渐增加,48 h时活力减弱,细胞凋亡增加,组间差异有统计学意义(P<0.05)。高糖刺激后视网膜Müller细胞中miR-26a-5p水平下降,PTEN的表达显著升高,PI3K及Akt水平下降,IL-1β及IL-6的水平明显升高,过表达miR-26a-5p后,PTEN水平降低,PI3K/Akt及炎性因子降低,细胞凋亡减少(P<0.01)。结论miR-26a-5p通过调控PTEN/PI3K/Akt的表达,影响炎症因子释放,减轻高糖诱导的视网膜Müller细胞凋亡。

miR-92a-1-5p通过调控SOCS3和P53促进急性白血病细胞增殖的机制研究

目的探讨miR-92a-1-5p通过调控细胞因子信号转导抑制因子3(SOCS3)、P53促进急性白血病(AL)细胞增殖的机制。方法收集20例初诊AL患者和15例正常人的骨髓标本,检测miR-92a-1-5p、SOCS3、P53 mRNA、蛋白质的表达水平,剖析其与临床特征和预后的关联性;利用基因工程手段,在急性淋巴细胞白血病细胞系HL-60和急性髓系白血病细胞系K562中分别提高和降低miR-92a-1-5p的表达水平,以评估其对SOCS3和P53蛋白表达水平的调控作用;研究miR-92a-1-5p对细胞周期、增殖和凋亡的影响。结果miR-92a-1-5p的表达水平与白细胞计数、骨髓增生程度、分化程度、髓外浸润和预后均呈负相关,与SOCS3和P53 mRNA表达水平均呈正相关。在HL-60和K562细胞中,上调miR-92a-1-5p表达水平能抑制SOCS3和P53 mRNA的表达,促进细胞周期进入S期,增加细胞增殖能力,抑制细胞凋亡;下调miR-92a-1-5p表达则产生相反的效果。结论miR-92a-1-5p通过调控SOCS3和P53促进AL细胞增殖,可能作为AL的潜在诊断标志物和治疗靶点。

MicroRNA-363-5p靶向血小板反应蛋白-3调控心肌细胞肥大的作用机制研究

目的 探讨microRNA-363-5p(miR-363-5p)靶向血小板反应蛋白-3(THBS3)对心肌肥大的调节作用。方法 体外人心肌细胞(AC16)经血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)处理复制心肌肥大体外模型,随后鬼笔环肽染色观察细胞骨架,Western blotting检测心肌肥大体外模型中胚胎期基因的蛋白表达,以确认模型复制的有效性。实时荧光定量聚合酶链反应检测心肌肥大体外模型中miR-363-5p表达。Western blotting检测肥大心肌细胞中转染miR-363-5p mimics和miR-363-5p inhibitor后,肥大相关表型的变化。双荧光素酶报告基因实验验证miR-363-5p与THBS3的3’-UTR结合作用。设计挽救实验,同时过表达THBS3与miR-363-5p,以评估THBS3是否介导miR-363-5p对心肌肥大的调控。结果 AngⅡ组细胞面积较对照组大(P <0.05),心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)、肌球蛋白β重链(β-MHC)及miR-363-5p较对照组高(P <0.05)。miR-363-5p mimics组miR-363-5p相对表达量较mimics-NC组高(P <0.05),miR-363-5p inhibitor组相对表达量较inhibitor-NC组低(P <0.05);miR-363-5p mimics组ANP、BNP、β-MHC相对表达量较mimics-NC组低(P <0.05),miR-363-5p inhibitor组相对表达量较inhibitor-NC组高(P <0.05)。miR-363-5p mimics组细胞面积较mimics-NC组小(P <0.05),miR-363-5p inhibitor组较inhibitor-NC组大(P <0.05)。miR-363-5p mimics+THBS3-WT组THBS3-WT荧光素酶活性较mimics-NC+THBS3-WT组低。mimics-NC+THBS3-MUT组与miR-363-5p mimics+THBS3-MUT组THBS3-MUT荧光素酶活性比较,差异无统计学意义(P>0.05)。miR-363-5p mimics组THBS3 mRNA和蛋白相对表达量较mimics-NC组低(P <0.05)。THBS3-OE组THBS3 mRNA和蛋白相对表达量较对照组、OE-NC组高(P <0.05)。THBS3-OE+miR-363-5p mimics组细胞面积较OE-NC+miR-363-5p mimics组大(P <0.05)。THBS3-OE+miR-363-5p mimics组ANP、BNP及β-MHC相对表达量较OE-NC+miR-363-5p mimics组高(P <0.05)。结论 过表达miR-363-5p可抑制AngⅡ对AC16细胞的促肥大作用,其机制与减少THBS3表达有关。

MiR-125a-5p靶向FGFR1和FGFR3抑制宫颈癌细胞恶性生物学行为的机制研究

目的:探讨微小RNA-125a-5p(miR-125a-5p)靶向成纤维细胞生长因子受体(FGFR)1和FGFR3抑制宫颈癌(CC)细胞恶性生物学行为的机制。方法:采用qRT-PCR法检测37例2022年6月至2023年6月期间在我院进行手术的CC患者术中切除的CC组织标本及癌旁组织标本中miR-125a-5p、FGFR1、FGFR3的表达。以CC细胞CaSKi细胞为研究对象,随机分为Control组、NC-mimics组、miR-125a-5p-mimics组、miR-125a-5p-mimics+pcDNA-NC组、miR-125a-5p-mimics+pcDNA-FGFR1组、miR-125a-5p-mimics+pcDNA-FGFR3组;测定各组中miR-125a-5p、FGFR1、FGFR3的表达;MTT法和平板克隆法检测CaSKi细胞增殖;Transwell实验检测CaSKi细胞的迁移、侵袭;流式细胞仪检测CaSKi细胞的凋亡;WB检测CaSKi细胞中FGFR1、FGFR3蛋白的表达;双荧光素酶报告基因实验验证miR-125a-5p与FGFR1、miR-125a-5p与FGFR3的关系。结果:CC组织中miR-125a-5p表达低于癌旁组织,FGFR1、FGFR3表达高于癌旁组织(P<0.05)。miR-125a-5p-mimics组CaSKi细胞中凋亡率、miR-125a-5p表达高于Control组、NC-mimics组,EdU阳性细胞率、OD 490、迁移数、侵袭数、FGFR1 mRNA和蛋白、FGFR3 mRNA和蛋白表达低于Control组、NC-mimics组(P<0.05);与miR-125a-5p-mimics组、miR-125a-5p-mimics+pcDNA-NC组相比,miR-125a-5p-mimics+pcDNA-FGFR1组凋亡率降低,EdU阳性细胞率、OD 490、迁移数、侵袭数、FGFR1 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05),miR-125a-5p-mimics+pcDNA-FGFR3组凋亡率降低,EdU阳性细胞率、OD 490、迁移数、侵袭数、FGFR3 mRNA和蛋白表达升高(P<0.05)。miR-125a-5p靶向负调控FGFR1和FGFR3。结论:miR-125a-5p过表达可以抑制CC细胞的恶性生物学行为,其机制可能是靶向FGFR1和FGFR3实现的。

长链非编码RNANEAT1对HaCaT细胞中miR-485-5p和STAT3表达的影响

目的:探讨LncRNA NEAT1对HaCaT细胞中miR-485-5p和STAT3表达的调控及对HaCaT细胞增殖、凋亡的影响。方法:采用PCR、Western印迹法检测HaCat细胞和正常人表皮角质形成细胞(NHEK细胞)中LncRNANEAT1、miR-485-5p及STAT3 mRNA和蛋白表达情况。荧光原位杂交技术(FISH)和双荧光素酶报告基因检测LncRNA NEAT1、miR-485-5p和STAT3之间的靶向调控关系。再通过RNA干扰技术分别沉默HaCat细胞中LncRNANEAT1、STAT3表达,以及转染miR-485-5p模拟剂(mimic)和抑制剂(inhibitor)分别上、下调miR-485-5p,然后应用PCR、Western Blot、流式细胞术、CCK8等实验技术分别检测LncRNANEAT1、miR-485-5p、STAT3表达及细胞增殖、凋亡情况。结果:与NHEK细胞组相比,LncRNA NEAT1和STAT3在HaCaT细胞组中高表达,而miR-485-5p在HaCaT细胞中低表达;miR-485-5p与LncRNA NEAT1共定位于HaCaT细胞质,且miR-485-5p与LncRNA NEAT1 3′-UTR、STAT3 3′-UTR之间存在互补结合序列;共转染转野生型psiCHECK-LncRNA NEAT1-3′UTR-WT、psiCHECK-STAT3-3′UTR-WT重组质粒时,miR-485-5pmimic组相对萤光素酶活性明显低于miR-NC组。而共转染突变型psiCHECK-LncRNANEAT1-3′UTR-MUT、psiCHECK-STAT3-3′UTR-MUT重组载体质粒时,miR-485-5p mimic组和miR-NC组萤光素酶活性无明显差异;沉默LncRNA NEAT1或STAT3均可抑制HaCaT细胞增殖及促进其凋亡;下调miR-485-5p可促进HaCaT细胞增殖及抑制其凋亡,而上调miR-485-5p则与之相反;下调miR-485-5p可减弱沉默LncRNANEAT1对HaCaT细胞功能的影响。结论:LncRNANEAT1可通过充当竞争性内源RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)吸附miR-485-5p增强STAT3表达来促进HaCaT细胞增殖并抑制其凋亡。

肿瘤相关成纤维细胞上调hsa-miR-18b-5p靶向FBXL3促进前列腺癌的增殖及转移

目的探讨受肿瘤相关成纤维细胞(CAFs)调控的hsa-miR-18b-5p在前列腺癌(PCa)中的表达水平及作用,并研究对其在PCa发生发展过程中的分子机制。方法利用生物信息学技术分析在PCa中高表达的miRNA,构建肿瘤相关成纤维细胞并与PCa细胞系共培养,验证CAFs对PCa细胞增殖和迁移的影响及对hsa-miR-18b-5p的调控作用;RT-qPCR验证20例患者癌组织及癌旁正常组织、前列腺正常上皮增生细胞及PCa各细胞系中hsa-miR-18b-5p的表达水平;通过脂质体法将阴性对照及hsamiR-18b-5p抑制物分别转染入PCa细胞C4-2、LNCAP中,分为NC inhibitor组和hsa-miR-18b-5p inhibitor组;采用细胞集落形成、CCK-8实验、划痕愈合、Transwell、IC_(50)实验、流式细胞术分别检测C4-2、LNCAP细胞增殖、迁移、侵袭、耐药能力、凋亡和周期;建立PCa裸鼠移植瘤模型,定期测量移植瘤的质量和体积,Kaplan-Meier生存曲线分析裸鼠生存情况;利用靶基因预测分析网站(Targetscan、Mirtarbase、miRDB、miRDIP)预测has-miR-18b-5p的靶基因,并通过双荧光素酶报告基因分析验证hsa-miR-18b-5p与靶基因的靶向关系,RT-qPCR、Western blotting检测各组细胞靶基因的表达水平。结果生物信息学分析结果显示,在PCa中高表达的miRNA有17个,结合差异表达程度以及相关文献筛选出拟研究的基因:miR-148a、miR-17、miR-18b-5p、miR-770、miR-297-3p。CAFs与PCa细胞系共培养后hsa-miR-18b-5p的表达水平升高(P<0.01),且促进PCa细胞的增殖与迁移(P<0.01),敲除has-miR-18b-5p可抵消CAFs对PCa细胞增殖及迁移的影响,确定has-miR-18b-5p为研究基因。与正常前列腺上皮细胞或肿瘤旁组织相比,PCa细胞或肿瘤组织中hsa-miR-18b-5p的表达升高(P<0.05);敲除hsa-miR-18b-5p可抑制C4-2、LNCAP细胞的增殖、迁移、侵袭以及耐药(P<0.05);敲除hsa-miR-18b-5p可抑制裸鼠移植瘤质量和体积的增长,增加裸鼠的生存时间(P<0.05)。靶基因预测分析网站显示,FBXL3是hsa-miR-18b-5p的一个潜在作用靶点,双荧光素酶报告基因证实has-miR-18b-5p与FBXL3基因间存在结合位点,且敲除hsa-miR-18b-5p可增加C4-2、LNCAP细胞中FBXL3的蛋白表达(P<0.05)。结论CAFs上调前列腺癌细胞hsa-miR-18b-5p的表达水平,后者可能通过靶向调控FBXL3基因的表达促进PCa细胞的增殖和转移。

长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1重叠转录物1靶向抑制miR-628-5p在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤中的作用

目的探究长链非编码RNA(lncRNA)KCNQ1重叠转录物1(KCNQ1OT1)靶向抑制miR-628-5p在高糖诱导的视网膜色素上皮细胞损伤中的作用。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测糖尿病视网膜病变(DR)、2型糖尿病(T2DM)、葡萄膜炎患者血清和房水KCNQ1OT1表达水平。用不同浓度葡萄糖处理人视网膜色素上皮细胞(ARPE-19),并检测KCNQ1OT1表达情况,选择最佳作用浓度。将ARPE-19细胞分为对照组(CON组)、高糖组(HG组)、HG+抑制物对照(si-NC)组、HG+KCNQ1OT1抑制物(si-KCNQ1OT1)组、HG+模拟物对照(miR-NC)组、HG+miR-628-5p组、HG+si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组、HG+si-KCNQ1OT1+anti-miR-628-5p组。RT-qPCR检测各组细胞KCNQ1OT1、miR-628-5p表达水平,流式细胞术检测细胞凋亡,ELISA检测各组细胞丙二醛(MDA)含量、超氧化物歧化酶(SOD)活性,Western blot检测各组细胞活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶-3(cleaved Caspase-3)蛋白表达水平,双荧光素酶报告实验检测KCNQ1OT1、miR-628-5p靶向关系。结果血清和房水中KCNQ1OT1表达水平:DR患者>T2DM患者>葡萄膜炎患者(均为P<0.05)。ARPE-19细胞中KCNQ1OT1表达水平:0 mmol·L^(-1)葡萄糖组<5 mmol·L^(-1)葡萄糖组<15 mmol·L^(-1)葡萄糖组<30 mmol·L^(-1)葡萄糖组(均为P<0.05),故选择30 mmol·L^(-1)葡萄糖进行实验。与CON组比较,HG组细胞KCNQ1OT1表达水平、细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达、MDA含量均显著升高,SOD活性、miR-628-5p显著降低(均为P<0.05)。与HG+si-NC组比较,HG+si-KCNQ1OT1组细胞KCNQ1OT1表达水平、细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达、MDA含量均显著降低,SOD活性显著升高(均为P<0.05)。与HG+miR-NC组比较,HG+miR-628-5P组细胞miR-628-5p、SOD活性均显著升高,细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达、MDA含量均显著降低(均为P<0.05)。与HG+si-KCNQ1OT1+anti-miR-NC组比较,HG+si-KCNQ1OT1+anti-miR-628-5p组细胞miR-628-5p、SOD活性均显著降低,细胞凋亡率、cleaved Caspase-3蛋白表达、MDA含量均显著升高(均为P<0.05)。结论lncRNA KCNQ1OT1通过靶向抑制miR-628-5p可以减轻高糖诱导的ARPE-19细胞凋亡和氧化损伤。