催化吲哚生成靛蓝的细胞色素P450BM-3定向进化研究

以催化吲哚产生的靛蓝在630nm处具有特殊的吸收峰为高通量筛选指标,将来源于Bacillusmegaterium的细胞色素P450BM-3单加氧酶的基因序列用易错聚合酶链式反应进行定向进化,通过多轮突变,在原有的能产靛蓝的高活力突变酶的基础上成功获得了三个高于亲本酶的突变酶,突变酶的酶活分别是亲本酶的6.6倍(hml001),9.6倍(hml002)和5.3倍(hml003),并对突变酶的动力学参数进行了分析.突变酶DNA测序的结果表明,hml001含有一个有义氨基酸置换I39V,hml002含有三个有义氨基酸置换D168N,A225V,K440N,hml003含有一个有义氨基酸置换E435D,这些突变位点有些远离底物结合部位,有些位于底物结合部位.

定向进化细胞色素P450BM-3的研究

以来自于巨大芽孢杆菌的细胞色素P450BM-3为研究对象,采用随机突变和饱和定点突变定向进化技术对P450BM-3进行改造,通过突变体催化靛蓝显色的特性采用活性琼脂平板分析和96微孔板相结合的高通量筛选成功获得了几个具有更高催化性能的突变体。

一个有利于细胞色素P450BM-3催化吲哚合成靛蓝的三位点突变酶:D168L/E435T/V445A

为进一步提高P450 BM-3催化吲哚合成靛蓝的能力,在前期获得的突变酶D168L/E435T基础上引入V445A突变,获得突变酶D168L/E435T/V445A,该突变酶与D168L/E435T及V445A相比,对吲哚的亲和力分别降低41.5%及35.8%,转化数(kcat)分别提高1.61倍及1.31倍,催化效率(kcatKm-1)分别提高1.53倍及1.47倍;该突变酶对电子的耦合率也提高至24.7%,较D168L/E435T提高39.5%,较V445A提高64.7%,说明该突变酶在电子的利用率上有明显改善;此外,该突变酶催化副产物靛玉红的比例大幅降低,降低为D168L/E435T的41.7%及V445A的30.6%,说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更加有利于靛蓝形成。

细胞色素P450BM-3热稳定性的半理性改造

为了提高细胞色素单加氧酶P450 BM-3的热稳定性,采用半理性设计策略对该酶进行了分子改造。首先采用B-FITTER软件分析了P450 BM-3晶体结构中各氨基酸残基位点的温度因子(B-factor),识别出了一个对酶的热稳定性有不利影响的关键氨基酸残基位点G46,然后以P450 BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G)为亲本酶在该位点进行定点饱和突变构建了突变文库,并从饱和突变文库中筛选获得了一个热稳定性得到显著提高的突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/D422G/G46S)。该突变酶(G46S)的半失活温度(T5010)比亲本酶提高了5℃(达到48℃;在50℃的半衰期t1/2比亲本酶延长了一倍。同时,突变酶的酶学性质也得到明显改善,与亲本相比,突变酶Km降低了22%,kcat提高了90%,催化效率kcat/Km(67.42 L?(mmol?min)-1)比亲本提高了1.48倍。这说明G46位点不仅影响酶的热稳定性,还影响酶对底物的结合与催化性能。G46S突变酶的获得表明,只要采用适当的半理性设计策略对正确的位点进行分子改造,可以在提高酶的热稳定性的同时,保持或甚至提高酶的催化活性。

人类白细胞抗原-DQA1、细胞色素P4503A5*3基因多态性与特发性膜性肾病遗传易感性关联性研究

目的:探讨分析人类白细胞抗原(HLA)-DQA1、细胞色素P450(CYP)3A5*3基因多态性与特发性膜性肾病(IMN)遗传易感性的关联性。方法:将IMN患者62例作为研究组,另将健康者62例作为对照组。采用聚合酶链反应(PCR)技术和基因测序技术检测入组患者的HLA-DQA1(rs2187668)、CYP3A5*3(rs776746)基因型,判断各基因型与IMN患者的关系。结果:研究组中HLA-DQA1 rs2187668基因型AA占比高于对照组(P<0.05),基因型GG、AG占比低于对照组(均P<0.05);研究组等位基因A占比高于对照组(P<0.05)。研究组与对照组CYP3A5*3 rs776746不同基因型占比及等位基因占比比较无统计学差异(均P>0.05)。HLA-DQA1 rs2187668AA基因型IMN患者24 h尿蛋白量和血肌酐水平显著高于AG和GG型,肾小球滤过率显著低于AG和GG型(均P<0.05)。结论:HLA-DQA1 rs2187668位点的基因多态性与IMN的发生有关,AA基因型和等位基因A可增加IMN易感性。

细胞色素P450介导的杂草抗药性研究进展

细胞色素P450(cytochrome P450)是一类重要的亚铁血红素-硫醇盐蛋白超家族,属于单加氧酶,广泛分布于生物界中。研究发现P450主要具有“生物合成”和“生物解毒”两大功能,被誉为“万能的生物催化剂”。大多数除草剂在植物体内代谢的初始阶段即涉及植物细胞色素P450的作用。近些年,由P450介导的抗药性杂草呈多发态势,其复杂的抗性谱,给杂草化学防除带来了新的挑战。本文对P450分类命名、P450与除草剂代谢的关系、P450抗性鉴定手段、P450介导抗性杂草发生情况、与除草剂代谢有关的植物细胞色素P450基因克隆等内容进行了综述,旨在为该领域的相关研究提供参考。

长链非编码RNA LINC00987通过细胞色素P450途径促进AML细胞凋亡的机制研究

目的:探讨长链非编码RNA LINC00987在抗肿瘤药物诱导的急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)细胞凋亡中的作用及分子机制。方法:通过RT-qPCR检测AML中的LINC00987表达水平。构建稳定敲减LINC00987基因的Molm13细胞(shLINC00987),通过Annexin V/PI检测LINC00987低表达对阿糖胞苷诱导AML细胞凋亡的影响。对LINC00987共表达基因进行信号通路富集,分析LINC00987的表达对细胞色素家族基因的影响。结果:与健康对照组相比,lncRNA LINC00987在AML细胞系和AML病人标本中均显著降低,而在抗AML治疗后缓解组中高表达;此外,低表达LINC00987与AML患者预后不良有关。抗肿瘤药物阿糖胞苷、阿霉素、三氧化二砷和维奈托克可显著诱导AML细胞系Molm13和MV411的LINC00987表达。下调LINC00987的表达可抑制阿糖胞苷诱导的Molm13细胞凋亡。进一步研究发现,LINC00987共表达基因可富集于细胞色素P450(cytochrome,P450,CYP450)介导的氧化应激通路/网络,且LINC00987的表达与CYP450家族基因CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的表达水平呈正相关。下调LINC00987的表达则可抑制阿糖胞苷诱导的CYP11B1、CYP2U1和CYP2C9的mRNA表达。结论:LINC00987可以作为AML的预后标志物,其可能通过CYP450介导的氧化应激途径促进阿糖胞苷诱导的AML细胞凋亡。

烟粉虱细胞色素P450基因CYP6JM1的克隆及其在噻虫嗪抗性中的作用

烟粉虱Bemisia tabaci是全球性农业害虫之一,目前采用的防治手段多为化学防治。噻虫嗪作为一种新烟碱类杀虫剂,现被广泛应用于田间烟粉虱的防治,但烟粉虱已对其产生了抗性。本文通过RT-qPCR对烟粉虱噻虫嗪抗性与敏感种群的细胞色素P450基因CYP6JM1表达水平进行了比较,结果显示,烟粉虱噻虫嗪抗性种群CYP6JM1基因表达水平明显升高。基因克隆和序列分析表明,CYP6JM1基因具备昆虫P450基因的典型特征。RT-qPCR检测结果表明,该基因在烟粉虱1~2龄时期及腹部高水平表达。RNAi结果表明,降低烟粉虱体内CYP6JM1基因的表达量能够显著提高其对噻虫嗪的敏感性,表明CYP6JM1基因可能与烟粉虱对噻虫嗪的抗性有关。

细胞色素P450-RhFRED人工融合酶的研究进展与应用

来自于红球菌Rhodococcus sp.NCIMB 9784的P450RhF是一个自给自足型的细胞色素P450酶,它的血红素结构域主要负责控制酶的底物特异性,P450还原酶伴侣蛋白RhFRED与细胞色素P450血红素结构域天然融合在一起,电子主要从蛋白分子内转移到P450血红素结构域。依据融合型P450RhF自给自足的特性,有学者利用P450RhF的还原伴侣蛋白RhFRED,与其它P450构建人工融合酶P450-RhFRED,来实现多种细胞色素P450基因的功能表达。基于此建立的P450-Rh-FRED融合文库对未知功能P450的催化功能探索有很大意义,P450-RhFRED融合酶技术也可用于开发已知细胞色素P450酶的工业应用。

响应面法优化工程菌产细胞色素P450 BM-3的发酵条件

采用快速有效的数学统计方法对工程菌产细胞色素P450BM3的发酵条件进行了优化.首先利用Plackett-Burman设计从众多影响产P450BM3的因素中筛选出影响较大的4个因素:FeCl3含量、诱导时机、诱导时间和接种量.在此基础上再利用响应面法中的杂合设计进行优化,通过拟合得到响应曲面函数,获得了最佳的实验条件.在该实验条件下,P450BM3酶活从37.6×10-3U·ml-1提高到57.9×10-3U·ml-1.

定点突变提高细胞色素P450 BM-3吲哚羟基化能力

为进一步提高细胞色素P450BM-3(A74G/F87V/L188Q)对吲哚的羟基化能力,根据酶结构与功能的关系,以突变酶E435T为基础,在168位点引入D168L突变,获得了吲哚羟基化能力得到显著提高的突变酶D168L/E435T。突变酶对吲哚的Km为1.72 mol·L-1(父本2.09 mol·L-1),转化数(kcat)为28.15min-1(父本4.04min-1),表明D168L定点突变可以略微提高酶对底物的亲和力,但主要的效应是促进了底物的转化速率,这两个效应的综合表现是使酶的催化效率(kcatKm-1)比父本酶提高了8.48倍。此外,产物中副产物靛玉红的比例也降低为1.2%(父本7.3%),这说明该突变酶催化吲哚的区域选择性上也更有利于靛蓝的生成。

细胞色素P450 BM-3羟基化吲哚能力的半理性改造

为进一步改造细胞色素P450BM-3酶对吲哚的羟基化能力,以P450BM-3结构与功能关系的推测为指导,选择突变酶P450BM-3(A74G/F87V/L188Q/E435T)为父本,在可能影响P450BM-3催化吲哚羟基化区域选择性的D168位点进行定点饱和突变,根据全细胞催化产物颜色及组成进行筛选,得到了产物组成、酶动力学性质与父本不同的两个突变酶。突变酶D168W的吲哚羟基化产物中90%是靛玉红,而另一个突变酶D168R的产物中87%是靛蓝,产物组成均不同于亲本。在催化吲哚羟基化时,D168W的kcat与父本相当,但Km却是父本的4.8倍,催化活力只有父本的20%;而D168R的kcat是父本的1.9倍,Km是父本的82%,催化活力比父本提高了1.37倍。结果表明,在E435T突变上叠加D168位氨基酸残基突变对酶的催化性质产生了单一位点突变所不具有的协同效应,对酶催化的区域选择性和催化活力都有显著影响,以致改变了催化产物组成。这种基于知识的半理性定向进化方法由于是在关键位点进行突变,因此突变目的性强、突变效果显著。

重组细胞色素P450 BM-3酶的表达条件及初步纯化研究

对重组细胞色素P450 BM-3基因工程菌的培养条件进行了单因素优化,确定了较佳的P450BM-3培养和表达条件:接种量1%,装液量100 mL/500 mL,发酵培养基加入0.1 mg?L-1FeCl3,OD578达到1.0左右时升温至42℃诱导,诱导时间为5 h.考察了DEAE-Sepharose FF与Resource Q 2种阴离子介质对分离纯化P450 BM-3的影响.结果表明,Resource Q纯化效果优于DEAE-Sepharose FF,通过KTA explorer100对Resource Q分离条件进行了优化,0.3 mol?L-1、0.5 mol?L-1的两步NaCl阶跃洗脱,P450 BM-3纯度较高,活性收率为30.1%,纯化倍数为2.12.

miR-574-3p在三阴性乳腺癌细胞紫杉醇药物敏感性中的作用

目的研究miR-574-3p在三阴性乳腺癌细胞紫杉醇(PTX)药物敏感性中的作用。方法构建稳定转染细胞株,根据细胞转染情况分为未转染组、miR-阴性对照(miR-NC)组和miR-574-3p过表达组,细胞计数试剂盒8(CCK-8)法检测不同浓度紫杉醇作用下细胞增殖情况(未转染组设置亚组:空白组和对照组),实时荧光定量聚合酶链式反应(PCR)法检测色素框同源物2(CBX2)mRNA的表达水平,Western blot法检测CBX2蛋白的表达水平,Transwell检测细胞侵袭迁移力,划痕实验检测细胞迁移能力。结果CCK-8法检测结果显示,紫杉醇对各组三阴性乳腺癌MDA-MB-231细胞的生长抑制呈一定的浓度依赖性,但不同浓度紫杉醇(0.05、0.15、0.45、1.35、4.05、8.10μmol/L)作用下,miR-574-3p过表达组生长抑制作用均高于对照组与miR-NC组(P<0.05);实时荧光定量PCR结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞中CBX2 mRNA表达水平低于未转染组和miR-NC组(P<0.05);Western blot结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞中CBX2蛋白表达水平低于未转染组和miRNC组(P<0.05);Transwell检测及划痕实验检测结果显示,2.10μmol/L紫杉醇作用下,miR-574-3p过表达组细胞侵袭迁移能力低于未转染组和miR-NC组(P均<0.05)。结论miR-574-3p可能通过下调CBX2增强三阴性乳腺癌细胞对紫杉醇的敏感性,抑制三阴性乳腺癌细胞的侵袭迁移能力。

重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌中催化吲哚合成靛蓝

重组细胞色素P450 BM-3突变酶在大肠杆菌(E.coli)BL21得到表达,利用重组菌株细胞催化吲哚合成靛蓝．考察了底物、产物、葡萄糖浓度以及pH值和温度对反应的影响．结果表明: pH 7．0-7．5,温度35℃,底物浓度0．5mmol／L为较好的反应条件．在此条件下,反应进行8h后,靛蓝产率可以达到29．43％．产物靛蓝对合成反应具有一定的抑制作用,在反应体系中加入5g／L葡萄糖,可以将产率提高到44．08％．

饱和突变定向进化细胞色素P450 BM-3

为了进一步获得具有更高活力的细胞色素P450 BM-3(F87V/A74G/L188Q)突变酶,利用饱和突变技术对该突变酶的4个氨基酸位点D168、A225、K434、E435分别进行单一的随机突变,通过对其羟基化吲哚生成靛蓝的催化性能表征,发现P450 BM-3氨基酸残基的168、434和435位均位于蛋白功能区域,而225位则位于非功能区域,同时发现突变酶D168H具有更高的结合辅酶NADPH的能力,其消耗NADPH的能力几乎是亲本酶的8倍,但生成靛蓝的能力却只是亲本酶的3倍,说明该位点极有可能承担了将电子从黄素单核苷酸(FMN)氧化还原酶区域传递到亚铁血红素区域的任务,在P450 BM-3结构与功能的关系中扮演着重要的角色.

稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系的建立

目的建立稳定表达人细胞色素P450氧化还原酶(POR)的Flp-In^(TM) CHO细胞系,为进一步建立稳定双表达人POR与人细胞色素P450(CYP)的细胞系奠定基础。方法构建POR重组慢病毒并感染Flp-In^(TM) CHO细胞,荧光显微镜观察绿色荧光蛋白表达,挑选转染细胞进行嘌呤霉素筛选和单克隆培养,以获得稳定转染细胞株。利用丝裂霉素C(MMC)细胞毒实验、实时荧光定量PCR和Western blot法检测细胞POR的表达,获得稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞株。构建稳定双表达POR和CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞(Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19)和单表达CYP2C19的Flp-In^(TM) CHO细胞(Flp-In^(TM) CHO-2C19),并用环磷酰胺(CPA)测定CYP2C19酶活性。结果与感染阴性对照病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞相比,感染POR重组慢病毒的Flp-In^(TM) CHO细胞MMC代谢活性升高,POR mRNA和蛋白的表达水平增加,说明获得了可稳定表达POR的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞。与Flp-In^(TM) CHO细胞相比,Flp-In^(TM) CHO-2C19的CPA代谢活性无显著差异,而Flp-In^(TM) CHO-POR-2C19的CPA代谢活性增加且明显高于Flp-In^(TM) CHO-2C19细胞。结论成功建立了稳定表达POR且可进一步用于CYP转基因细胞构建的Flp-In^(TM) CHO-POR细胞系。

尿道癌相关基因1通过微小RNA-513a-3p/细胞色素P_(450)1B1生物学轴促进人胃癌细胞增殖和迁移的机制研究

目的研究长链非编码RNA(lncRNA)尿路上皮癌胚抗原1(UCA1)在人胃癌细胞中的表达,并探讨UCA1通过微小RNA-513a-3p(miR-513a-3p)/细胞色素P_(450)1B1(CYP1B1)生物学轴对胃癌细胞增殖和迁移的影响及机制。方法分别向人胃癌细胞中转入UCA1小干扰RNA(siRNA)、miR-513a-3p模拟物和miR-513a-3p抑制剂以抑制UCA1、上调miR-513a-3p和抑制miR-513a-3p表达。通过定量PCR检测不同细胞UCA1、miR-513a-3p和CYP1B1 mRNA的表达,CCK8试剂盒检测细胞增殖,Transwell小室检测细胞迁移。结果与GES-1细胞相比,UCA1在人胃癌细胞HGC-27、SNU-5、AGS、SGC-7901中表达均升高(t=11.106,P<0.001;t=10.872,P<0.001;t=12.134,P<0.001;t=16.178,P<0.001),细胞增殖活性(t=7.252,P<0.001;t=8.964,P<0.001;t=8.666,P=0.003;t=8.697,P<0.001)和细胞迁移能力(t=4.040,P=0.010;t=7.079,P<0.001;t=6.833,P=0.003;t=7.527,P<0.001)均升高。双荧素酶基因报告实验显示miR-513a-3p与UCA1和CYP1B1靶向结合。与NC siRNA组相比,UCA1 siRNA显著下调UCA1和上调miR-513a-3p在SGC-7901细胞中的表达(t=7.895,P<0.001;t=12.911,P<0.001);miR-513a-3p表达上调显著抑制SGC-7901细胞中UCA1和CYP1B1 mRNA表达(t=7.224,P<0.001;t=5.645,P=0.002),而抑制miR-513a-3p则显著上调SGC-7901细胞中UCA1和CYP1B1 mRNA表达(t=9.628,P<0.001;t=11.665,P<0.001)。与单独UCA1敲低的SGC-7901细胞相比,UCA1和miR-513a-3p共同敲低的SGC-7901细胞CYP1B1 mRNA表达、细胞增殖活性和细胞迁移能力均升高(t=3.695,P=0.014;t=4.198,P=0.009;t=3.602,P=0.016)。结论UCA1通过miR-513a-3p/CYP1B1生物学轴促进人胃癌细胞的增殖和迁移。

母体用药及母体细胞色素P450遗传多态性与新生儿罹患先天性心脏病的相关性分析

目的研究母亲怀孕早期用药及细胞色素P450(CYP450)遗传多态性与后代先天性心脏病(CHD)的关联性。方法选取127名CHD胎儿产妇为观察组,132名非CHD胎儿产妇为对照组。调查双方特征及用药史,检测CYP450多态性。用Logistic回归分析产妇药物使用与CYP450基因变异与后代CHD风险关联。结果观察组产妇使用促排卵药、降压药、抗生素、抗抑郁药、预防流产药、中药等后代CHD风险高于对照组(P<0.05)。rs1065852基因型中A/T和T/T及rs16947基因型中C/G和G/G相较各自基因型均增加后代CHD风险。母体CYP450基因rs1065852风险基因型(A/T或T/T)及怀孕早期用药可增加后代CHDs风险(P<0.05);CYP450基因rs16947风险基因型(C/G或G/G)同样会增加后代CHDs风险(P<0.05)。结论母体怀孕早期使用药物可能与后代患CHD有关,CYP450的rs1065852和rs16947位点与子代先天性心脏病风险显著相关。

细胞色素P450氧化还原酶缺乏症试管助孕1例

细胞色素P450氧化还原酶缺乏症(cytochrome P450 oxidoreductase deficiency,PORD)是先天性肾上腺皮质增生症(congenital adrenal hyperplasia,CAH)中罕见的类型,为细胞色素P450氧化还原酶(cytochrome P450 oxidoreductase,POR)基因纯合或杂合变异引起的常染色体隐性遗传病。