细胞色素氧化酶P4502C19基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ对下肢动脉硬化闭塞症介入术后再狭窄的预测价值

目的探讨细胞色素氧化酶P4502C19(CYP2C19)基因多态检测联合血清肝素辅助因子Ⅱ(HCⅡ)对下肢动脉硬化闭塞症(ASO)介入术后再狭窄的预测价值。方法收集2017年1月至2021年5月于绵阳市第三人民医院行介入治疗的146例ASO患者的临床资料,根据随访期间再狭窄发生情况将其分为再狭窄组(n=27)和无再狭窄组(n=119)。收集患者性别、年龄、体重指数(BMI)、吸烟史、心脑血管病史、高同型半胱氨酸病史、病变血管支数、术前狭窄情况、支架植入情况、纤维蛋白原水平、总胆固醇水平、红细胞计数、CYP2C19基因多态性、HCⅡ活性,分析ASO介入术后再狭窄的影响因素。结果有吸烟史、支架植入、CYP2C19慢代谢型及HCⅡ活性均为ASO支架植入术后发生再狭窄的独立危险因素(P﹤0.05)。受试者工作特征(ROC)曲线结果显示,HCⅡ活性预测ASO支架植入术后再狭窄的截断值为95.80%,曲线下面积(AUC)为0.809(95%CI:0.719~0.900),灵敏度为74.80%,特异度为88.24%,Kappa=0.566。CYP2C19基因多态检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为66.67%,特异度为89.07%,Kappa=0.537。联合检测对ASO支架植入术后再狭窄的预测灵敏度为96.30%,特异度为86.55%,Kappa=0.682。结论ASO介入术后再狭窄与吸烟史、支架植入情况、CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性有关,CYP2C19基因多态性及HCⅡ活性检测均可用于预测ASO介入术后再狭窄,但联合检测可提高其诊断效能。

单只轮虫DNA提取及其细胞色素C氧化酶Ⅰ亚基部分序列测定

通过调整试剂剂量及实验条件与步骤 ,利用WizardTM基因组DNA纯化试剂盒可以稳定、快捷地提取单只轮虫的DNA。以提取的DNA为模板 ,利用COⅠ通用引物 ,扩增并测定了萼花臂尾轮虫 (Brachionuscalyci florus)COⅠ部分基因的序列。与褶皱臂尾轮虫 (B plicatilis)COⅠ基因序列比较结果表明 ,此片断确为轮虫COⅠ基因片断 。

基于线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ基因序列的帘蛤科贝类分子系统发育研究

对21种帘蛤科贝类线粒体细胞色素c氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome c oxidase subunit I,COI)基因核苷酸序列进行了分析,以探讨这一序列在种质鉴定、分子系统发生研究中的应用价值。测序结果表明,所有物种扩增片段长度均为707 bp(含引物),序列A+T含量(62.4%—67.8%)明显高于G+C含量。物种间共有变异位点379个,其中简约信息位点334个;此区段共编码235个氨基酸,种间共有氨基酸变异位点100个。以COI基因片段序列为标记,用中国蛤蜊(Mactra chinensis)作外群,构建了35种帘蛤科贝类(其中14种贝类COI序列从GenBank下载)的系统发生树,结合拓扑结构分析和序列比对分析,结果表明:支持将短文蛤(Meretrix petechinalis)和丽文蛤(M.lusoria)订为文蛤(M.meretrix)的同物异名的观点,建议将丽文蛤和短文蛤订为文蛤的地理亚种;支持将薄片镜蛤(Dosinia corrugata)和D.angulosa订为2个独立种的观点;认为将波纹巴非蛤(Paphia undulata)和织锦巴非蛤(P.textile)订为2个独立种是合适的。COI基因序列含有丰富的遗传信息,适合作为帘蛤科贝类种群遗传结构和系统发生研究的分子标记。

微波对大鼠脑线粒体细胞色素C氧化酶亚基转录水平的影响

目的 观察微波辐照对大鼠大脑皮层和海马组织线粒体编码基因COXⅠ和核编码基因COXⅣmRNA表达水平的影响 ,探讨微波辐照是否影响线粒体能量代谢。方法 平均功率密度为 3mW /cm2 和 3 0mW /cm2 微波急性辐照大鼠 1h后 ,应用RT PCR检测大鼠大脑皮层和海马组织COXⅠ和COXⅣ基因转录水平的变化。结果 3mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠ、COXⅣmRNA表达无显著变化。 3 0mW /cm2 微波辐照后 0、3、2 4h ,大鼠脑海马和大脑皮层COXⅠmRNA表达均明显降低 ,而COXⅣmRNA表达无显著变化。结论 微波辐照下调大鼠大脑皮层和海马线粒体编码基因COXⅠmRNA表达 ,并存在剂量依赖关系 。

亚洲黑熊四川亚种Ursus thibetanus mupinensis线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因的克隆与初步分析

根据已报道的部分哺乳动物线粒体细胞色素C氧化酶(Cytochrome C Oxidase)亚基Ⅲ基因(mtCOXⅢ)的相关信息设计引物,运用PCR技术,首次从亚洲黑熊四川亚种(以下简称四川黑熊,Ursus thibetanus mupinensis)的肌肉组织总DNA中成功克隆了mtCOXⅢ基因的编码序列,并对其进行了初步分析.结果表明:四川黑熊mtCOXⅢ基因序列全长784 bp,ORF是783 bp,编码261个氨基酸的蛋白质,该蛋白的等电点为6.47,分子量为29840.6 Da.四川黑熊的mtCOXⅢ与已报道的部分哺乳动物的mtCOXⅢ基因具有很高的同源性.进一步分析发现,四川黑熊线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ功能位点的位置、种类和数量均与已报道的部分哺乳动物具有很高的相似性.

青石斑鱼细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COXⅠ)基因的克隆鉴定及表达分析

细胞色素氧化酶(Cytochrome oxidase,COX)是线粒体内呼吸链电子传递的终末复合物,是线粒体氧化能力的关键调节物质。细胞色素C氧化酶亚基I(COXⅠ)是细胞色素C氧化酶具有酶催化活性的3个亚基之一。本研究以本实验室构建的青石斑鱼消减杂交cDNA文库中长587bp的EST序列为基础,采用RACE-PCR方法克隆鉴定出青石斑鱼(Epinephelus awoara)细胞色素C氧化酶亚基I基因。研究结果表明:青石斑鱼COXⅠ全长1659bp,5'端非编码区3bp,3'端非编码区105bp,开放阅读框1551bp,编码516个氨基酸。序列分析表明,青石斑鱼COXⅠ与线纹刺尾鲷COXⅠ同源性最高,达96.9%。采用半定量RT-PCR方法研究COXⅠ基因在青石斑鱼各组织中的表达特征,结果表明COXⅠ基因在正常的青石斑鱼和注射了副溶血弧菌灭活疫苗的青石斑鱼的脾、肝、心、头肾、肾、肌肉和鳃中都有转录表达。注射副溶血弧菌灭活疫苗后,除了鳃组织,其他组织中COXⅠ基因表达量较对照组都有显著提高(P<0.05),而鳃组织中的COXⅠ基因表达量没有显著变化。

冠心病患者线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因片段的重排

采用玻璃粉微量吸附法获取DNA直接作为PCR反应的模板 ,利用巢式PCR技术 ,检测冠心病患者血细胞内编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的线粒体DNA扩增片段多态性 ,探讨线粒体DNA的片段缺失与动脉粥样硬化发生发展的关系。研究发现在全部冠心病患者编码细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ的基因中出现了大约 10 0bp的缺失片段 ,其中 1例冠心病患者中还出现了大约 45 0bp核基因组和 6 0 0bp的线粒体DNA扩增片段 ,而在正常对照老人中没有出现片段的重排现象。表明冠心病患者中存在该基因片段的缺失和模板量减少的现象 ,该基因可能参与了冠状动脉粥样硬化的形成与发展 ,编码呼吸链复合物一些亚基线粒体DNA片段的重排可能是动脉粥样硬化进行性发展的恶化因素。

基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ序列的DNA微条形码技术鉴别11种生鲜肉制品掺假的研究

建立并优化了基于细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochrome C oxidase subunitⅠ,COⅠ)序列的DNA微条形码(DNA mini-barcoding)技术,以检测生鲜肉制品中11种常见肉类的掺假情况。样品经真空冷冻干燥处理、提取DNA后,采用通用引物进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)扩增,目标条带扩增产物经切胶、回收、纯化后,进行克隆测序,并将测序结果提交到GenBank数据库(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行Blast比对,筛选出适合猪肉、牛肉、羊肉、鸡肉、鸭肉、鸽子肉、马肉、驴肉、鹅肉、兔肉、鼠肉等11种肉类扩增的通用引物COⅠ-A,并对PCR扩增条件进行优化,建立18个掺假模型,以对低经济价值肉类的最低掺入比例进行考察验证。结果表明:11种肉类的PCR扩增效率均为100%。在这18个掺假模型中,牛肉和羊肉中掺入6种低经济价值肉类(猪肉、鸡肉、鸭肉、马肉、驴肉、鼠肉)的最低检出比例均为5%,而在鹅肉、鸽子肉和兔肉中其最低检出比例为10%。本方法前处理简单,灵敏度高,重现性好,可作为高经济价值生鲜肉制品中掺假低经济价值肉类的有效检测方法。

阿尔茨海默病患者血液细胞线粒体内细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因存在缺失

目的 调查 2 5例老年痴呆患者血细胞线粒体中细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的突变情况 ,探讨线粒体DNA突变与阿尔茨海默病 (AD)性老年痴呆发生发展的关系。 方法 采用微量法提取血细胞总DNA直接作为PCR模板 ,进行巢式PCR扩增 ,最后采用DNA序列分析鉴定突变。 结果 在正常老人组 ,只扩增了 2 80bp的线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因 (COX2 )扩增片段 ,而在老年痴呆患者中出现了 4 6 4bp和 2 80bp的多态性扩增片段 ,并且发现了 1个 32 0bp的新的线粒体DNA缺失片段 ,1位AD患者的COX2基因存在一种新的缺失后重组现象 ,COX2基因的 1条单链在np75 0 3处断裂 ,另 1条单链在np7785处断裂 ,这两个断裂的游离片段通过插入 1个额外的胞嘧啶核苷酸重新连接起来。 结论 老年痴呆患者中的COX2基因存在片段扩增多态性。

血吸虫细胞色素C氧化酶亚基I基因的克隆与近缘种属关系分析

从生物化学的角度比较血吸虫不同虫株的遗传进化差异.以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物扩增获取血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶基因片段,转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆,测序,对克隆得到的coⅠ基因作进化分析.结果表明:无论是在核苷酸序列还是在氨基酸序列上,日本血吸虫湖北株与其近地域株(云南、江苏、湖南)均具有较高的同源性,coⅠ基因的相似性分别为98%、98%和97%,但与不同种属血吸虫(曼氏、湄公、埃及、马来)的一致性则较低,分别为76%、84%、76%、85%,由此证实日本血吸虫湖北株与其它近地域株具有较近的亲缘关系.

核因子κB亚基65及细胞色素C氧化酶-Ⅱ在大鼠急性肝衰竭模型中的变化及意义

目的观察核因子κB亚基65(nuclear factor-κB,NF-κB p65)及细胞色素C氧化酶-Ⅱ(cytochrom eCoxidase-Ⅱ,COX-Ⅱ)在大鼠急性肝衰竭(acute liver failure,ALF)模型中的变化。方法 Sprague-Dawley雄性大鼠40只随机分为5组:对照组、ALF4h组、ALF8h组、ALF12h组和ALF24h组。ALF组采用D-氨基半乳糖(800mg/kg)和脂多糖(100g/kg)联合腹腔注射构建ALF模型,对照组注射同等体积的0.9%氯化钠溶液。分别检测各组的ALT、AST、TBIL、ALB、PT、PTA及观察各时间点肝脏病理变化;实时荧光定量PCR法检测各组大鼠肝脏内NF-κBp65的mRNA水平,分光光度法检测各组大鼠肝脏线粒体中的COX-Ⅱ活性。结果光镜结果显示,ALF8h组可见明显肝细胞凋亡,而12h组和24h组可见明显肝细胞坏死。ALF组中8h、12h及24h肝脏NF-κBp65的mRNA水平明显低于对照组(P均<0.001),24h最低。COX-Ⅱ的活性在ALF4h开始升高,8h达到高峰(与对照组比较,P=0.008),12h开始下降,24h下降更为明显。结论 ALF大鼠肝脏NF-κBp65的mRNA水平降低,肝脏线粒体COX-Ⅱ活性在凋亡阶段升高,后期降低。二者均参与了ALF中肝细胞凋亡的发生,同时NF-κBp65还可能抑制了ALF过程中肝细胞的再生。

亚硒酸钠诱导NB4细胞中细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ的下调机制

目的探讨亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡的过程中,细胞色素c氧化酶亚基Ⅳ(COX Ⅳ)表达的变化情况及其机制和意义。方法用20μmol/L亚硒酸钠作用NB4细胞不同时间,Western blot和RT-PCR分别检测COX Ⅳ蛋白和mRNA表达的变化。活性氧清除剂预处理细胞后Western blot检测COX Ⅳ蛋白表达的变化以及caspase-3的激活。caspase-3抑制剂预处理细胞后Western blot检测COX Ⅳ蛋白表达的变化。瞬时转染干扰NB4细胞中COX Ⅳ表达后,流式细胞术检测细胞凋亡。结果亚硒酸钠诱导NB4细胞COX Ⅳ蛋白表达显著下调,但mRNA表达水平无变化。活性氧清除剂能完全逆转亚硒酸钠引起的COX Ⅳ表达下调与caspase-3激活。caspase-3抑制剂能部分逆转亚硒酸钠引起的COX Ⅳ表达下调。干扰COX Ⅳ表达后,亚硒酸钠诱导的细胞凋亡显著增加。结论在亚硒酸钠诱导NB4细胞凋亡过程中,COX Ⅳ在蛋白水平显著下调。活性氧介导COX Ⅳ下调与caspase-3激活,caspase-3在一定程度上参与COX Ⅳ表达下调,抑制COX Ⅳ能显著提高NB4细胞对亚硒酸钠诱导凋亡的敏感性。

羊驼细胞色素C氧化酶VIc亚基基因序列的测定与分析

本研究通过克隆分析羊驼细胞色素c氧化酶VIc亚基基因的序列，对羊驼细胞色素c氧化酶的VIc亚基基因的结构和功能进行了初步探索。实验利用免疫印迹技术（Southern blotting）对已有羊驼皮肤cDNA文库进行筛选并测序，结果表明该基因大小为424bp，含一个完整的ORF，位于36～266bp，编码77个氨基酸。对该基因序列分析表明：该基因编码的蛋白质含有疏水性区域、一个跨膜区并具有信号肽。同源性分析表明，核苷酸序列同源性为76％～100％。

益气活血中药复方对CVB_3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ表达的影响

目的:研究益气活血中药复方调控CVB3大鼠心肌细胞感染模型细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(cytochromeC oxidase subunitⅠ)及细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ(cytochrome C oxidase subunitⅡ)表达的作用机制。方法:本实验用Wistar大鼠心肌细胞建立柯萨奇病毒B3(CVB3)感染模型,通过改良的抑制性消减杂交技术(SSH),克隆受CVB3攻击的宿主细胞中被中药(益气活血中药复方)调控的基因。结果:细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ在中药组中呈高表达,病毒组中表达减弱或被抑制。结论:益气活血中药复方能够影响受CVB3攻击的宿主细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ、Ⅱ的表达,有效保护心肌,阻断病程进度,实现治疗病毒性心肌炎的目的。

宁夏部分地区不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因序列分析

目的了解宁夏部分地区蚊虫种类组成和不同蚊种细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(COI)基因特征和蚊虫分子系统进化关系。方法对宁夏银川市、石嘴山市、吴忠市和青铜峡市的三带喙库蚊、里海伊蚊、淡色库蚊和八代按蚊4种蚊种COI基因序列进行扩增、测序,在Gen Bank中对所测序列进行相似性比对,分析基因特征、颠换率、遗传距离,利用Mega 7.0软件构建分子系统树。结果本研究中相似性比对结果,其他蚊虫分别与其同种蚊虫的相似性均达到94%~99%,COI基因序列扩增长度为417 bp左右,GC含量为29.4%~31.5%,种间颠换率为5.80%~13.81%,种间遗传距离为0.121~0.160。结论 COI基因具有种间特异性,可作为不同蚊种分类鉴别的参考依据。

灵长类细胞色素C氧化酶亚基Ⅱ基因的进化分析

目的:利用玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段,对灵长类氧化酶亚基Ⅱ基因进行分子系统学分析。方法:实验于2003-03/2004-10在南方医科大学解剖教研室完成。①玻璃粉吸附法扩增人静脉血中的线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段。②通过Genbank数据库,采用“Blast”的方法进行相似性数据搜寻,选择合适的16种灵长类生物氧化酶亚基Ⅱ基因的686碱基序列片段;采用PAUP4.0DNA序列分析软件进行分析。结果:①利用玻璃粉吸附法成功扩增出了人的氧化酶亚基Ⅱ全基因片段,并对扩增片段进行了序列分析。②根据序列测定结果,结合生物信息学技术研究16种灵长类动物之间的分子进化关系,建立了新的分子进化树,其中一致性指数为0.5608,相似性指数为0.4392。结论:线粒体氧化酶亚基Ⅱ基因片段可以作为进化分析的分子指标。

细胞色素c氧化酶亚基IV表达载体的构建及其在NB4细胞中的过表达

目的构建细胞色素c氧化酶亚基IV(COXIV)的表达载体并在NB4细胞进行过表达。方法 RT-PCR扩增COXIV编码序列并克隆到pcDNA6/His A质粒中,对重组质粒进行酶切鉴定和测序;将鉴定正确的pcDNA6-COXIV表达载体转染到NB4细胞中,Western blot鉴定COXIV蛋白在NB4细胞中的过表达。结果所构建的pcDNA6-COXIV表达载体转染NB4细胞后,COXIV蛋白表达水平显著高于对照细胞。结论 COXIV表达载体构建成功,可介导COXIV蛋白在NB4细胞中的过表达,为进一步研究其功能奠定了基础。

玉米象线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ基因克隆与表达分析

【目的】克隆辣根素可能的作用位点——细胞色素C氧化酶亚基Ⅲ(COXⅢ)的全长cDNA,并对其进行序列分析及原核表达。【方法】在NCBI数据库中查找玉米象(Sitophilus zeamais)COXⅢ已知的部分序列,利用RT-PCR,结合RACE技术克隆获得玉米象COXⅢ全长序列;利用DNAMAN8.0、MEGA5.1、GENEDOC、Prot Param和Target P 1.1 Server等软件对该基因全长cDNA序列、系统进化关系、基本理化性质及其三维结构进行分析;将玉米象COXⅢ基因分别与载体p EASY-Blunt E1、pET28a、pET30a、p ET32a、pET42a连接,构建原核表达载体p EASY-Blunt E1-COXⅢ、pET28a-COXⅢ、pET30a-COXⅢ、p ET32a-COXⅢ、pET42a-COXⅢ并分别转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,在不同IPTG诱导浓度、温度以及时间内诱导融合蛋白表达,采用SDS-PAGE和Western blot(WB)对表达结果进行验证。【结果】获得的玉米象COXⅢ基因全长cDNA序列开放阅读框(ORF)为792 bp,编码263个氨基酸,编码的蛋白分子质量约为30 938.1 Da,理论等电点p I 6.51,预测分子式为C1492H2154N338O362S10,不稳定系数为34.49,总平均亲水系数为0.492,为疏水的稳定蛋白。系统发育树显示玉米象与鞘翅目象鼻虫科昆虫米象进化关系最近。原核表达结果表明,该蛋白在18℃、1 mmol·L-1 IPTG诱导24 h的条件下即能实现融合蛋白的表达,可溶性检测表明该蛋白主要以包涵体的形式存在;Western blot印迹检测证实大肠杆菌BL21(DE3)中表达了一个分子量约为62 k D的融合蛋白。【结论】成功从玉米象昆虫克隆得到COXⅢ全长cDNA序列,并实现了其编码蛋白的原核表达,可为后续探究玉米象COXⅢ功能和异硫氰酸酯类化合物对玉米象的作用机理提供理论依据。

基于部分线粒体细胞色素氧化酶亚基Ⅰ(mtCOI)DNA序列的6种蝙蝠(翼手目:蝙蝠科)的分子系统进化关系

对贵州5种蝙蝠科蝙蝠的部分线粒体细胞色素氧化酶亚基ⅠDNA序列进行了测定,并结合从Genbank获得的爪哇伏翼的相应序列,以Pteropus dasymallus,P.scapulatus,Rousettus aegyptiacus为外群,运用贝叶斯法(Bayes-ian),最大似然法(Maximum Likelihood,ML)分析了这6种蝙蝠科蝙蝠的分子系统进化关系。结果表明:在贝叶斯,ML树中,这6种蝙蝠科的蝙蝠可分为3个分支:亚洲长翼蝠是第1个独立出来的分支;白腹管鼻蝠是继亚洲长翼蝠之后第2个分离出来的分支;第3个分支又分为两支,一支由大鼠耳蝠和小鼠耳蝠组成,另一支由南蝠和爪哇伏翼组成,支持将这4种蝙蝠同归于蝙蝠亚科的结论,从一定程度上否定了鼠耳蝠属和管鼻蝠亚科之间的姐妹类群关系,也不支持将鼠耳属提升为亚科。

日本血吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚基Ⅰ(COⅠ)基因的克隆与初步分析

目的:了解日本血吸虫湖北株细胞色素C氧化酶亚基(mt co)基因的生物学特性.方法:以日本血吸虫湖北株成虫基因组总DNA为模板,设计特异性引物应用降落PCR扩增、纯化基因片段后连接、转化大肠杆菌DH5α,筛选阳性克隆、测序并与NCBI数据库中的核酸序列进行同源性比对分析,利用蛋白质分析软件分析该序列编码蛋白的相关生物学特性.结果:克隆序列的结果表明co基因全长1 581 bp,编码526个氨基酸;编码蛋白的等电点为6.28,相对分子量为59 KDα,具有一个细胞色素C氧化酶亚基的核心保守结构域.结论:日本血吸虫湖北株co基因与其他地理株具有较高的同源性.