miR-30b-3p通过靶向调控COX6B1抑制肺腺癌细胞的增殖和侵袭

背景与目的肺腺癌(lung adenocarcinoma,LUAD)是当前最常见的肺癌亚型,微小RNA(micro RNAs,mi RNAs)是一类非编码小RNA,在细胞活动中发挥核心作用。mi R-30b-3p在许多类型的癌症中均起到了关键作用,但关于其在肺腺癌中如何发挥作用的研究仍然很少。本研究通过探索mi R-30b-3p在肺腺癌增殖和侵袭中的作用和机制,以期为临床上抑制肺腺癌的增殖和侵袭拓展新的方向。方法利用NCBI生物数据库查找肺腺癌中差异表达明显的mi RNA,并查询其差异表达及生存曲线;采用实时荧光定量聚合酶链反应(real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction,q RT-PCR)检测mi R-30b-3p在各肺腺癌细胞系中的表达;5-乙炔基-2’脱氧尿嘧啶核苷(5-ethynyl-2’-deoxyuridine,Ed U)细胞增殖实验和Transwell实验检测各组A549细胞增殖和侵袭能力的变化;使用在线预测数据网站确定mi R-30b-3p的靶蛋白;Western blot验证COX6B1在不同组肺腺癌细胞中的表达情况;双荧光素酶实验证实mi R-30b-3p与COX6B1是否存在结合位点。结果mi R-30b-3p在肺腺癌组织和细胞中表达下调(P<0.05),低表达水平的mi R-30b-3p与肺腺癌患者的不良预后有关(P=0.005,8);过表达mi R-30b-3p能够抑制肺腺癌细胞的增殖与侵袭能力(P<0.05);双荧光素酶实验证明mi R-30b-3p和COX6B1存在结合位点(P<0.05);Western blot实验表明在肺腺癌细胞A549中,过表达mi R-30b-3p能够下调COX6B1的表达(P<0.05);Ed U细胞增殖实验和Transwell侵袭实验表明,mi R-30b-3p的过表达能够逆转上调COX6B1对肺腺癌细胞增殖和侵袭能力的促进作用(P<0.05)。结论mi R-30b-3p在肺腺癌中起到了抑癌基因的作用,并能够通过调控COX6B1的表达来抑制肺腺癌的增殖和侵袭。

基于COI和16SrRNA基因的地龙药材及其混淆品的DNA条形码鉴定

目的利用线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(COI)和16S核糖体RNA(16SrRNA)对地龙药材及常见混伪品进行分子鉴定,探讨快速、准确鉴定地龙药材及其混伪品基原物种的方法。方法收集地龙药材的药典收载品种及其易混品种10种,提取DNA,得到其COI和16SrRNA序列。所得序列经DNAStar校正后,用MEGA6.0自带的Clustal W多重比对,除去冗余位点,比对结果经MEGA6.0分析,构建地龙药材及其混淆品的邻接(N-J)树。结果地龙药材的正品来源参环毛蚓(Pheretima aspergillum)、通俗环毛蚓(P.vulgaris)、威廉环毛蚓(P.guillelmi)及栉盲环毛蚓(P.pectinifera)与其混淆品种间COI和16SrRNA基因序列均存在较多变异位点。由所构建的N-J系统聚类树图显示所测物种的单系性,即16SrRNA、COI可以很好的将地龙药材区别于其他混伪品。结论所获得的COI和16SrRNA序列可作为不同状态的地龙类药材物种鉴定的分子依据,并为进一步建立地龙等动物类中药物种真实性鉴定体系奠定了重要的实验基础。

山羊脑多头蚴形态学与cox1基因鉴定

为鉴定山羊脑多头蚴,通过对虫体进行形态学观察并采用PCR扩增虫体线粒体细胞色素C氧化酶亚基1(cox1)基因,将有效序列进行NCBI-Blast在线比对,利用MEGA6.0构建遗传系统进化树。结果显示,山羊脑多头蚴cox1序列长度为446 bp,与多头带绦虫同源性达100%,系统进化分析显示分离株与多头带绦虫位于同一分支。结合形态学观察结果表明,山羊所感染的多头蚴属于多头带绦虫幼虫——脑多头蚴,cox1基因可作为鉴定多头带绦虫的有效分子标记,研究结果为山羊脑多头蚴的分子诊断提供参考依据。

基于线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1基因鉴别华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的双重PCR法的建立

分别提取华支睾吸虫和扇棘单睾吸虫的基因组DNA,针对两种吸虫线粒体细胞色素C氧化酶亚单位1(COX1)基因设计引物,进行单重和双重PCR扩增。用针对华支睾吸虫的3对引物进行单重PCR扩增,FC1/RC1和FC3/RC3引物分别扩增出328 bp和356 bp的特异性目的条带,而FC2/RC2引物未扩增出任何条带;用针对扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物进行单重PCR扩增,分别扩增出200 bp和190 bp的特异性目的条带。用华支睾吸虫FC1/RC1引物,结合扇棘单睾吸虫的FH1/RH1和FH2/RH2引物,分别进行双重PCR扩增,均能扩增出特异性条带,彼此间无干扰。

4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1和nad1基因的序列分析

收集黑龙江省大庆地区牛源、绵羊源、绒山羊源和山羊源土耳其斯坦东毕吸虫，以SDS-蛋白酶K法抽提其基因组DNA，用特异性引物通过PCR扩增土耳其斯坦东毕吸虫成虫细胞色素C氧化酶亚基1基因（coxl）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸脱氢酶亚基1基因（nad1）并进行测序，应用Chromas和DNAStar软件分析扩增产物的变异情况。结果表明，大庆地区4种终末宿主土耳其斯坦东毕吸虫cox1基因均为1125bp，nad1基因均为518bp；且其线粒体基因存在差异，coxl的同源性为99．0％～99．7％，nad1的同源性为98．3％～99．4％。

小鼠隐藏管状线虫线粒体cox1基因的扩增及序列分析

对从试验小鼠体内分离的蛲虫样品PMZ1-5的线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基（cox1）的部分基因（pcox1）进行PCR扩增、测序及序列分析,并与网上相关序列进行比对分析,研究其线粒体pcox1基因遗传变异情况。结果表明,获得pcox1有效序列373 bp,经序列比对分析,发现5个蛲虫样品之间的变异很小,只有1个碱基的差异,序列相似性为99.73%～100%,BLAST分析结果表明为隐藏管状线虫,与同属的Syphacia montana序列差异性为5.24%～5.68%。结果表明,隐藏管状线虫的pcox1序列种内变异很小,种间差异明显,本结果为进一步研究蛲虫的群体遗传学奠定了基础。

伯恩山犬的眼线虫形态学鉴定与cox1基因分析

为鉴定伯恩山犬感染的眼线虫种属关系,采用PCR扩增虫体线粒体细胞色素C氧化酶第1亚基(cox1)基因。将有效序列进行NCBI-BLAST在线比对,利用MEGA6.0构建遗传系统进化树。结果显示,伯恩山犬眼线虫cox1序列长度为446 bp,与结膜吸吮线虫同源性达99%,系统进化分析显示二者位于同一分支,由此确定,伯恩山犬感染的线虫为结膜吸吮线虫。

猥迭宫绦虫的线粒体cox1序列测定及种系发育关系分析

本研究应用聚合酶链反应(PCR)方法扩增出分离自广州的猬迭宫绦虫的线粒体细胞色素c氧化酶第Ⅰ亚基(cox1)基因部分序列(pcox1),并进行序列分析。应用CLUSTALW2软件进行多重比对分析序列差异,应用MEGA4.0软件构建种系发育树,并与GenBank中收录的猬迭宫绦虫相应基因序列进行比对分析。结果表明所获得的pcox1序列长度一致,均为396bp,且与GenBank中收录的猥迭宫绦虫均构成同一亚群,为猬迭宫绦虫进一步的分类、鉴定和遗传变异研究奠定了基础。

COI序列:影响动物分类学与生态学的DNA barcode

DNA barcode是一段特殊的、可用于物种鉴定的DNA序列。目前在动物中最常用的DNA barcode是细胞色素C氧化酶1号基因(COI)的部分序列。随着标准数据库的建立,基于COI基因的DNA barcode在动物分类学和生态学中得到了广泛应用。但是,采用COI基因作为DNA barcode所隐含的涉及线粒体的进化历史、遗传特性和物种成种时间的默认前提,并非完全成立,由此引发了许多问题。本文阐述了基于COI基因的DNA barcode对分类学和生态学的影响,目前存在的问题,以及可能的研究方向。

PCR-SSCP研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异

目的 研究中国日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异。方法 试剂盒抽提我国11个地域株日本血吸虫基因组总DNA,以特异性引物对其线粒体NADH(还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸)脱氢酶1(ND1)和细胞色素C氧化酶1(CO1)片段进行PCR扩增,PCR产物纯化后作SSCP分析。结果 SSCP结果共出现15种条带类型,其中NDl片段中出现7种条带类型,分别是湖北省5地2种;中国台湾、湖南、安徽与江西各为1种;四川、云南同为1种。CO1片段中出现8种条带类型,其中湖北境内5个地域株中有2种;中国台湾株、湖南、安徽与江西各为1种,四川、云南株各为1种。结论 我国各地域株日本血吸虫存在不同程度的遗传变异。

基于Cytb和COⅠ基因的猎隼分子鉴定

通过与从GenBank中下载的8种隼属鸟类的Cytb和COⅠ部分序列进行同源比对,并以最大简约法(MP)和贝叶斯推断法(BI)构建系统树,对1只涉案的隼科鸟类进行了分子鉴定。结果表明:样品与猎隼Cytb和COⅠ的序列同源性最高,分别为98.91%～99.41%和99.67%～100%,样品与猎隼Cytb和COⅠ序列的遗传距离最小,分别为0.003～0.007和0.000～0.003;同时,样品和猎隼在两种系统树上都始终聚在一起。由此可推断该样品为猎隼,为2010年5月四川省丹巴县森林公安局受理的非法盗猎和贩运隼形目鸟类一案的审理提供了有力的证据。

中国日本血吸虫地域株基因差异的研究

目的 研究中国日本血吸虫各地域株基因差异。 方法 收集湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的阳性钉螺 ,将逸出的日本血吸虫尾蚴感染昆明小鼠 ,42d后 ,用灌注法获取成虫 ,用PCR扩增成虫线粒体NADH (还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸 )脱氢酶 1(ND1)和细胞色素C氧化酶 1(CO1)基因片段 ,克隆于质粒载体后测序并用MEGA软件分析。 结果 各地域株日本血吸虫成虫的ND1和CO1基因长度分别为 476bp和 10 33bp ,ND1和CO1基因序列分别存在 2个单倍体 (Ⅰ型 ,Ⅱ型 ) ,其差异分别为 4.0 %和 3.4%。从分子发生树看 ,各地域株日本血吸虫ND1和CO1基因分别存在 2个不同基因型。在ND1基因中呈现Ⅰ型的 ,CO1基因中也为Ⅰ型 ,反之 ,均为Ⅱ型。 结论 研究区域湖南、安徽、湖北、四川及江苏 5省的日本血吸虫株ND1和CO1基因存在 2个不同基因型。

日本血吸虫线粒体DNA的遗传变异

目的对中国不同自然隔离群的日本血吸虫线粒体DNA进行遗传变异的研究,为中国日本血吸虫地域株的划分提供依据。方法采用聚合酶链反应(PCR)技术对中国7省11地日本血吸虫的线粒体NADH脱氢酶1(ND1)和细胞色素C氧化酶1(CO1)基因片段进行扩增,将扩增产物测序,计算序列遗传距离(D)。用SAS统计分析软件绘制聚类图。结果两片段PCR扩增产物分子量分别为450与470左右;其中中国大陆与中国台湾日本血吸虫之间的D为0.1710～0.5003;中国大陆各地域株之间D为0～0.4179;中国大陆山区型日本血吸虫之间D为0;中国大陆湖沼洲滩型日本血吸虫株之间D为0.0451～0.1481;湖北省境内5个不同地域株之间D为0～0.0112。结论中国日本血吸虫在线粒体DNA水平上至少可分为不同层次的5类:①中国台湾;②云南洱源、四川天全;③湖北5地;④安徽贵池、湖南岳阳、江西新建。其中①与其它余几类在总体上可分为两大类。

人类精子线粒体C01基因变异与完全受精失败的相关性

目的研究精子线粒体细胞色素C氧化酶1(CO1)基因变异与完全受精失败的相关性。方法收集2011年7月至2017年5月于郑州大学第二附属医院生殖中心进行新鲜体外常规受精(IVF)周期及部分卵胞浆内单精子注射(Half-ICSI)周期中汉族人精子236例进行回顾性对照研究。实验组57例精子来源于IVF完全受精失败夫妇,对照组179例精子来源于正常受精夫妇(受精率>50%)。通过巢式聚合酶链式反应(PCR)和脱氧核糖核酸(DNA)测序确定精子线粒体DNA(mtDNA)的基因变异。结果共发现18个纯合变异,15个杂合变异,两组间比较差异未见统计学意义(P>0.05)。新发现2个纯合变异位点m.6534A>G和m.7443A>G;3个杂合变异位点m.5963A>G、m.5967T>C和m.7403A>C;1个m.6366dupG重复突变。结论人类精子线粒体CO1基因变异与完全受精失败无相关性。

雉科四族鸟类的分子系统发生研究

为了研究雉科4个族(鹑族Perdicini、雉族Phasianini、眼斑雉族Argusianin和孔雀族Pavocini)的系统发生,本研究分析了雉科4属7种鸟类线粒体DNACOI基因694bp序列,共发现210个变异位点,其中简约信息位点180个。4个族之间,眼斑雉族和孔雀族的遗传距离最小为0.145;眼斑雉族和雉族间的最大为0.192。4个族在系统发生树上聚成两个明显的分支,其中鹑族和雉族聚成一支,眼斑雉族和孔雀族聚成另一支。形态和分子的证据均表明眼斑雉族和孔雀族关系较近。

额尔齐斯河鱼类宽头鲤蠢绦虫的种类鉴定及流行特点分析

为了研究额尔齐斯河鱼类肠道寄生的宽头鲤蠢绦虫(Caryophyllaeus laticeps)种类及流行特点,试验采用形态学和分子生物学相结合的方法鉴定虫种,并对额尔齐斯河鱼类8次采样获得的数据进行统计分析。结果表明:依靠形态学观察可知虫体不分节,头节宽大,体末端有"H"状卵巢,初步鉴定为鲤蠢绦虫属种类;通过扩增线粒体细胞色素c氧化酶第1亚基(cox1)序列,发现该虫与Gen Bank上公布的宽头鲤蠢绦虫的线粒体cox1序列的相似性为97.56%(639/655),为同一种。被宽头鲤蠢绦虫感染的5种鱼中,散鳞镜鲤的感染率最高(为16.67%),感染强度最低(为1);东方欧鳊的感染率、感染强度均高,分别为15.27%和14;银鲫的感染率最低,为3.28%。说明本试验采用的方法能够准确鉴定虫种;东方欧鳊感染宽头鲤蠢绦虫的情况最严重,且体长段适中的东方欧鳊更易感染宽头鲤蠢绦虫。

贵州省苗族及布依族人群CYP1A1*2C基因多态性研究

[目的]检测贵州省苗族及布依族正常人群细胞色素氧化酶1A1*2C(CYP1A1*2C)基因多态性。[方法]采用Taqman-MGB探针,通过实时定量PCR(real-time PCR)对贵州省三都县125名苗族及122名布依族人群的血液样本进行CYP1A1*2C基因多态性分析,并采用χ2检验比较两民族该基因分布的差异。[结果]CYP1A1*2C野生纯合子(基因型AA)、突变杂合子(基因型AG)、突变纯合子(基因型GG)在苗族及布依族中基因型频率分别为65.6%、28.0%、6.4%及68.9%、25.4%、5.7%;A和G在苗族及布依族中基因频率分别为79.6%、20.4%及81.6%、18.4%,两民族人群的基因多态性分布差异无统计学意义。[结论]中国贵州省苗族及布依族人群中CYP1A1*2C基因型频率分布没有明显不同。

山羊腔阔盘吸虫的形态学观察和分子鉴定

为了从形态学和分子水平对山羊腔阔盘吸虫(Eurytrema coelomaticum)的种类鉴定提供依据,对采集自广东佛山发病山羊胰脏的阔盘吸虫在形态学观察的基础上,抽提虫体基因组DNA,通过PCR方法对虫体核糖体18SrRNA基因和线粒体cox1基因进行扩增,将产物与pMD18-T载体连接,转化到大肠埃希菌DH5α感受态细胞进行克隆、测序和序列分析。结果获得虫体18SrRNA基因的大小为1 922bp,线粒体cox 1基因大小为444bp。序列分析显示,获得的18SrRNA基因与GenBank收录的腔阔盘吸虫(E.coelomaticum,登录号为DQ401035)同源性高达99%;线粒体cox1基因与GenBank收录的胰阔盘吸虫(E.pancreaticum,登录号为KC535544)的同源性仅为90%。研究结果从分子水平证明采集自广东佛山山羊体的阔盘吸虫为腔阔盘吸虫(E.coelomaticum),对山羊阔盘吸虫病的防控有指导意义。

人粪便中华支睾吸虫虫卵PCR快速检测方法的建立及评价

目的建立一种快速、特异、灵敏的人粪便中华支睾吸虫虫卵检测方法,并对方法进行评价,为快速、准确、有效诊断人是否患有华支睾吸虫病提供依据。方法以华支睾吸虫细胞色素c氧化酶亚基1基因为靶位点,用Primer Express3.0软件设计引物,经Blast软件对相似序列搜索后,筛选出一套最优与常见寄生虫无交叉反应的引物;分别用猫后睾吸虫、粪类圆线虫、日本血吸虫、细粒棘球虫、卫氏并殖吸虫等可感染人类、虫卵形态易混淆、种属关系较近的寄生虫的DNA进行特异性实验;将含有目的片段的阳性质粒梯度稀释后进行PCR扩增,确定检测方法的灵敏性;利用建立的方法对吉林省白城市周边人粪样品进行检测,验证方法的可行性。结果利用细胞色素c氧化酶亚基1基因设计的引物仅对华支睾吸虫(或虫卵)DNA有扩增条带,而其他对照以及阴性对照均未有明显扩增条带,对华支睾吸虫虫卵阳性质粒DNA检测敏感性可达到2.47×10^(2)copies/μl,建立的方法能够对实际粪便中的华支睾吸虫虫卵进行有效扩增,与传统图片镜检法比较二者检测结果一致。结论PCR方法特异性强,灵敏度高,可以快速、准确检测人粪便中的华支睾吸虫虫卵,可以为华支睾吸虫病的快速诊断提供技术支持。

基于COⅠ序列的阿胶原材料及其混伪品的DNA条形码鉴定研究

目的:采用细胞色素C氧化酶亚基1(cytochrome C oxidase subunit 1,COⅠ)基因片段序列鉴定的方法鉴别中药阿胶的原料驴皮及其混伪品马皮、骡皮、牛皮。方法:优化DNA提取试剂盒的通用方法进行总DNA的提取,针对马科动物驴的基因序列变异位点优化COⅠ通用引物及PCR扩增条件,PCR扩增产物双向测序,测得的序列与GenBank下载的基因序列Blast比对分析样品的基原;采用Mega 6.0软件计算序列的碱基组成、种内和种间K2P(Kimura-2-parameter)的遗传距离,采用邻接法(neighbor-joining method)构建系统树,进一步对驴皮及其混伪品进行基原鉴别。结果:22份来自马科和牛科动物的驴、马、牛的皮样品的基因序列与GenBank序列Blast比对结果一致性均大于99%。采用邻接法构建的系统树结果显示驴、马、牛的皮样品具有较好的单系性,均分别独立聚为1个分支,可以显著区分;牛科和马科动物样品的K2P种间平均遗传距离均远大于种内平均遗传距离。结论:利用优化后的COⅠ片段扩增引物及PCR反应程序可作为鉴别阿胶原料DNA条形码物种鉴定的有效方法,为阿胶原料的真伪鉴别提供了科学的鉴定方法。