细胞荧光转化灶单位实验体外滴定狂犬病病毒毒力方法的优化

目的用细胞荧光转化灶单位实验[Fluorescence Focus Units(FFU)Assay]替代小鼠50%致死量(50% Lethal Does,LD50)法检测狂犬病病毒毒力,优化、改进现有的检测方法 ,从而降低检测成本。方法将狂犬病病毒固定毒株3倍系列稀释后感染乳金黄地鼠肾细胞,通过荧光标记的抗狂犬病病毒核蛋白单克隆抗体染色检测病毒感染的荧光灶,同时将病毒颅内接种10～12g昆明小鼠,通过观察记录小鼠发病死亡数,计算引起半数小鼠死亡的病毒剂量即LD50。结果 FFU和LD50存在一定的数量关系,且成正相关,相关系数为0.99。lgFFU值与LD50值之间有统计学意义,重复性好。结论 FFU实验体外滴定狂犬病病毒毒力方法可取代LD50法,更有利于推广、实施。

微小RNA-101通过USP22抑制人肝癌MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能

目的研究微小核糖核酸(miR)-101对人肝细胞癌(肝癌)MHCC97H细胞的上皮-间质转化功能的影响及其相关机制。方法 MHCC97H肝癌细胞株分别转染miR-101 mimics和negative control mimic,分别作为M101组、NCM组,并设立未转染对照(control)组,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测各组细胞miR-101含量。Transwell实验检测3组细胞迁移能力和侵袭能力。Western-blot法检测3组细胞vimentin、α-catenin、E-cadherin和USP22表达水平。双荧光素酶实验检测miR-101与USP22的关系。结果 M101组miR-101的表达水平明显上调,表达水平约为control组的761倍(P<0.05)。M101组迁移细胞数量明显低于control组的[(15.7±1.6)个比(94.1±1.8)个,P<0.05]。M101组侵袭细胞数量明显低于control组的[(9.1±0.4)个比(51.6±0.9)个,P<0.05]。M101组细胞vimentin蛋白表达量明显降低,α-catenin及E-cadherin蛋白表达量明显升高,USP22蛋白表达量明显降低。双荧光素酶检验结果显示USP22为miR-101的下游靶基因。结论 miR-101可能通过降低下游靶基因USP22水平影响EMT相关蛋白表达,抑制MHCC97H肝癌细胞的上皮-间质转化功能。

GC32细胞对三种虫媒病毒的敏感性研究

用胃癌细胞株ＧＣ３２，对乙型脑炎、基孔肯雅、兰加特病毒进行敏感性研究。并用ＢＨＫ２１细胞作对照，发现ＧＣ３２细胞对两种病毒的敏感性与对照细胞ＢＨＫ２１极为接近。ＢＨＫ２１和ＧＣ３２细胞对基孔肯雅、乙型脑炎和兰加特的免疫荧光实验，于感染后４８ｈ或７２ｈ都出现＋＋＋～＋＋＋＋的阳性结果。两种细胞对基孔肯雅和乙型脑炎病毒都形成空斑，ＢＨＫ２１细胞对基孔肯雅和乙型脑炎病毒的空斑形成单位分别为５．６５和５．３６；ＧＣ３２对基孔肯雅和乙型脑炎病毒的空斑形成单位分别为６．４８和５．６１。实验表明，ＧＣ３２细胞可以作为有关病毒实验的理想细胞株。

细胞荧光转化灶法检测狂犬病病毒滴度

目的应用细胞荧光转化灶（fluorescence focus units assay,FFU）法检测狂犬病病毒滴度。方法将狂犬病病毒稀释后接种BSR细胞,培养22~24 h,用FITC标记的抗狂犬病病毒特异性抗体进行染色,计数病毒感染细胞的荧光灶数,计算病毒滴度。采用乳鼠半数致死量（median lethal dose,LD50）法和建立的方法分别测定14批狂犬病病毒滴度,分析两者间的相关性;取同一份病毒液,于不同时间点检测3次,每个时间点重复检测6次,验证方法的重复性;取3份滴度不同的病毒液,由2个操作者在不同时间重复测定3次,验证方法的中间精密性;将同一份病毒液按2倍梯度稀释,共9个稀释度,分别检测病毒滴度,重复测定3次,确定该方法的线性范围。应用建立的方法检测38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度。结果乳鼠LD50法测定14批狂犬病病毒的-Lg LD50值范围为4.20~8.19,FFU法Lg FFU值范围为3.76~7.69,两种方法检测结果趋势相同,线性回归相关系数R-Sq（调整）=96.1%,存在良好的正相关性;同一个时间点检测6次及不同时间点检测3次的CV值均小于2.00%;两个操作者在不同时间重复测定3次的CV值均小于8.00%,两个操作者之间的检测结果差异无统计学意义（P〉0.05）;样品浓度与Lg FFU呈良好的线性关系,R-Sq（调整）=99.3%,线性范围为2.26~6.12。38批CTNCEC株狂犬病病毒滴度平均Lg FFU在3.63~7.69之间,SD值在0.021~0.57之间,CV值小于10.00%。结论建立的细胞FFU法准确性、重复性、中间精密度好,该方法可用于检测狂犬病病毒滴度。

碱性成纤维细胞生长因子和转化生长因子β受体在人巩膜成纤维细胞内的表达

目的 了解人眼巩膜成纤维细胞是否表达碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)受体FGFR1和转化生长因子(TGF- β)受体TβRⅠ和TβRⅡ。方法 角膜移植后的4只眼球,应用定点解剖及游走促进法进行巩膜成纤维细胞的分离培养,建立细胞系,采用免疫荧光染色法检测bFGF受体FGFR1和TGF- β受体TβRⅠ和TβRⅡ蛋白的表达。结果 分别应用FGFR 1、TβRⅠ和TβRⅡ的特异多克隆抗体染色,整个细胞表面或细胞核周呈现特异性黄绿色荧光,受体位于细胞胞膜上。肉眼观察TβRⅠ和TβRⅡ呈强阳性表达,FGFR 1表达较弱于TβRⅠ和TβRⅡ。结论 人巩膜成纤维细胞表达bFGF受体FGFR1和TGF β受体TβRⅠ、TβR的功能性蛋白,巩膜是bFGF和TGF- β发挥作用的一个部位。外源的bFGF和TGF -β通过与巩膜成纤维细胞上的上述相应受体结合发挥作用,是影响实验性近视发生发展的机制之一。

沙漠小球藻转人乳铁蛋白的电转优化

对沙漠小球藻建立高效的遗传转化方法,对电击转化的条件和相关参数进行优化。作者以人乳铁蛋白基因作为电转条件优化的参考基因,采用单因素实验确定转染效率的电转化条件,然后进行电转化正交实验,得到最优的电转化组合。结果表明:最优的电转化组合是电压1 400 V、培养周期8 d、渗透剂浓度0.2 mol/L、渗透时间为0 h、质粒质量浓度为6 ug/mL、电击缓冲液浓度为0.4 mol/L,其细胞致死率为51.30%、荧光百分率为52.54%、PCR阳性平均百分率为42.30%。

尿激酶型纤溶酶原激活物及其抑制物-1表达与脑微血管改变的实验研究

目的探讨脑缺血再灌注病灶周围区脑微血管改变及与尿激酶型纤溶酶原激活物(uPA)、纤溶酶原激活物抑制物1(PAI1)表达的关系。方法应用光镜、电镜、免疫组织化学、原位分子杂交等技术,观察局灶脑缺血2h再灌注1、7、14、21d病灶周围区脑微血管结构改变及uPA、PAI1表达情况。结果脑缺血2h再灌注7、14d病灶周围区见新生微血管内皮细胞,且uPA、PAI1表达明显增加,uPA阳性单位7、14d分别为6.8±3.9、5.8±2.1,PAI1阳性单位7、14d分别为12.8±2.6、10.7±3.1。结论脑缺血再灌注后期病灶周围区有脑微血管内皮细胞再生,uPA、PAI1可能参与了微血管重建。