N端B细胞表位缺失的兔出血症病毒VP60蛋白的表达及其免疫原性

本研究将A3C单抗识别的VP60蛋白NTA区域作为识别标记,设计一系列编码VP60 NTA区域重叠多肽的基因序列并连接于pGEX-4T-1载体,确定A3C单抗识别的精确表位。然后构建重组质粒Bacmid-VP60△A3C,将Bacmid-VP60△A3C转染Sf9昆虫细胞,得到重组杆状病毒rBac-VP60△A3C。RT-PCR、HA、IFA和Western Blot鉴定结果表明,重组蛋白VP60△A3C在Sf9细胞中高效表达,电镜观察显示其形态和结构与兔出血症病毒VP60蛋白类似。将重组蛋白VP60△A3C以每只200μg免疫2月龄RHDV血清阴性的新西兰兔,免疫后14 d,以兔出血症病毒WF株攻毒新西兰兔。结果表明,免疫组无死亡,而对照组全部死亡。本研究结果为制备表位缺失的兔出血症亚单位疫苗奠定了基础。

肠道病毒C组96型VP1蛋白线性B细胞表位筛选与鉴定

目的鉴定肠道病毒C组96型(enterovirus C96,EV-C96)VP1蛋白的线性B细胞表位。方法采用IEDB网站提供的在线分析工具分析、预测EV-C96 VP1蛋白的线性B细胞表位,结合其二级结构、β-转角、抗原性、亲水性等多项参数,筛选出优势候选表位;应用间接ELISA法检测候选表位与EV-C96免疫血清的反应性以及与21种其他常见手足口病病原血清的交叉反应性;应用微量中和试验测定表位抗体的中和效价;采用序列比对分析表位的序列保守性;应用结构对齐分析表位的结构特异性。结果通过生物信息学筛选出EVC96 VP1蛋白7个候选表位(P1~P7);ELISA法检测发现P7(氨基酸序列位置为282~304)与EV-C96多克隆抗体有强反应性,与其他常见EV多克隆抗体不发生明显反应;微量中和试验显示,P7抗体的中和效价低于1∶2;序列及结构分析结果显示,P7的氨基酸序列在EV-C96型内具有较高保守性,与其他EV相应位点氨基酸序列的结构有明显差异。结论P7表位为EV-C96特异的非中和性B细胞表位,可作为开发EV-C96检测试剂盒的候选抗原表位。

HLA-DRB1^(*)11:01与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系探讨

目的我们前期研究显示,无论在汉族人群还是黎族人群中,HLA-DRB1^(*)11∶01均是与机体自发清除HCV相关联的HLA-Ⅱ类基因,因此,本研究的目的是探讨HLA-DRB1^(*)11∶01基因与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系。方法对广东地区常见的HCV 6a慢性感染者HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组和阴性组的E1E2和NS3基因进行病毒选择压力以及病毒群体扩张的分析。采用覆盖我国常见HCV基因型保守区的CD4+T细胞表位的重叠肽段刺激HCV自发清除组和慢性感染组,通过ELISPT实验,根据每孔的斑点形成细胞数以及在不同组出现的频次评估HLA-DRB1^(*)11∶01基因与CD4+T细胞表位的关系。结果广东地区常见的HCV 6a感染者HLA-DRB1^(*)11∶01阴性组E1E2和NS3的阳性选择位点以及位于CD4+T细胞表位的位点数均大于HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组;两组HCV 6a感染者在广东地区均具有群体扩张趋势,且HLA-DRB1^(*)11∶01阴性组的扩张趋势明显高于HLA-DRB1^(*)11∶01阳性组。HCV自发清除组对其中5条肽段(C-52 E2691-707、C-119 NS31545-1560、C-134 NS4A1669-1684、C-154 NS4B1912-1927和C-159 NS4B1929-1944)刺激的应答率较高,HCV慢性感染组对其中的2条肽段(C-111 NS31497-1512和C-130 NS31650-1665)刺激的应答率较高。当考虑HLA-DRB1^(*)11∶01分型时,在慢性感染组和自发清除组HLA-DRB1^(*)11∶01阳性和HLA-DRB1^(*)11∶01阴性PBMCs产生的HCV特异性免疫应答均无统计学差异。结论研究揭示了HLA-Ⅱ类基因HLA-DRB1^(*)11∶01与HCV感染的病毒选择压力及与CD4+T细胞表位的关系,同时,获得HCV泛基因型CD4+T细胞抗原候选表位,为研发适合HCV泛基因型的T细胞疫苗提供基础数据。

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞、B细胞表位双拷贝基因与大肠杆菌LTB、STⅠ肠毒素基因融合表达产物的免疫应答

合成O型口蹄疫病毒VP1蛋白中与细胞免疫（21～40表位肽）及体液免疫（141～160表位肽）相关的基因序列2020VP1，运用基因工程技术构建了含有肠毒素大肠杆菌LTB、STⅠ基因及双拷贝2020VP1的融合表达载体r2020-B-2020-STⅠ，转化宿主菌BL21（DE3）RIL后的表达产物经SDS—PAGE分析，结果显示重组融合蛋白的分子量约为45kDa，表达量较高。ELISA实验结果显示，融合蛋白能与霍乱毒素（cholera toxin）CTB抗体特异结合。动物实验表明，融合蛋白能够诱发兔体产生较强的FMDV中和抗体，免疫豚鼠在低浓度FMDV刺激下能够产生特异性T淋巴细胞增殖反应，说明融合蛋白能诱导机体产生FMDV特异性细胞及体液免疫反应；同时，融合蛋白免疫雌鼠能够抵抗大肠杆菌强毒株攻击，免疫兔体能够产生STⅠ中和抗体，且融合蛋白不具STⅠ毒性，证明融合蛋白具有良好的LTB、STⅠ免疫原性。实验结果表明，此融合蛋白具有开发成为口蹄疫及肠毒素腹泻联合疫苗的应用价值。

旋毛虫抗原分子克隆及其T细胞和B细胞表位预测

目的克隆旋毛虫肌幼虫肘，21000抗原蛋白基因（Ts21），预测其T细胞和B细胞表位。方法旋毛虫（河南地理株）感染小鼠后收集肌幼虫，提取肌幼虫总RNA，应用RT-PCR技术获取目的基因Ts21，构建重组质粒pUC18—Ts21并测序，应用生物信息分析软件预测其T细胞和B细胞表位。结果成功构建克隆载体pUC18-Ts21。旋毛虫M21000抗原的T细胞表位位于第9—23、135—150位氨基酸位点；B细胞表位位于第31-35、53—56、98—104、124—130、133—157、160-172位氨基酸位点。结论成功克隆了旋毛虫河南地理株肌幼虫肘，21000抗原的编码基因，T细胞和B细胞表位预测结果表明该抗原蛋白具有较好的抗原性，可作为旋毛虫病免疫诊断和预防的候选抗原。

O型口蹄疫病毒VP1 T细胞与B细胞表位基因双拷贝串联表达产物的免疫应答

以一株O型口蹄疫病毒(FMDV)外壳蛋白VP1基因为模板,合成与细胞免疫及体液免疫相关抗原表位肽基因:21-40肽(20AA)和141-160肽(20AA)基因序列,运用基因工程技术构建了含有串联结构21-40(20AA)～141-160(20AA)～21-40(20AA)～141-160(20AA)的2020-2020VP1融合基因表达载体r2020-2020,转化宿主菌BL21(DE3)RIL后诱导表达,表达产物经SDS-PAGE及Western Blot分析显示重组融合蛋白的分子量约为18Ku.动物实验表明,较小剂量的融合蛋白就能诱导豚鼠产生特异性T淋巴细胞增殖反应及抗FMDV中和抗体,证明该融合蛋白可同时激活细胞免疫及体液免疫反应,具有开发成为抗FMDV疫苗的应用价值.

卡氏肺孢子虫MSG抗原片段细胞表位的预测

[目的]预测卡氏肺孢子虫主要表面抗原(MSG)片段的B细胞和T细胞抗原表位。[方法]运用Sig-nalp3.0、EMBOSS等网络服务器推测卡氏肺孢子虫MSG抗原片段的B细胞和T细胞抗原表位,分析预测结果。[结果]MSG抗原片段存在3个潜在的B细胞抗原表位及6个潜在的T细胞抗原表位。B细胞抗原表位在氨基酸序列的位置为69-79、96-101、133-140aa3个区域内或其附近;T细胞抗原表位在氨基酸残基的位置为7-22、28-43、20-35、40-55、53-68、86-101aa。[结论]MSG抗原表位的预测为有目的的克隆基因片段,研究高效的表位疫苗奠定基础。

结核分枝杆菌Rv2986c T、B细胞表位分析

预测并分析结核分枝杆菌Rv2986c的CD4+T、CD8+T和B细胞表位分布情况。方法在NCBI数据库上查询并获得Rv2986c的氨基酸序列,用BLAST分析其与结核分枝杆菌复合群及人类蛋白的同源性。利用Net MHC数据库预测并分析目的蛋白的CD4+T细胞表位的分布情况;利用SYFPEITHI、Net MHC、BIMAS和IEDB数据库预测并分析目的蛋白的CD8+T细胞表位的分布情况。然后,综合CD4+T与CD8+T细胞表位预测情况,筛选出优势T细胞表位肽段。利用IEDB和ABCpred数据库分析目的蛋白的B细胞抗原表位,筛选出优势B细胞表位肽段。通过预测与分析,初步筛选出CD4+T细胞的强结合候选表位10个,弱结合候选表位245个,CD8+T细胞候选表位3个;综合CD4+T与CD8+T细胞表位预测结果,最终筛选出1个优势T细胞表位肽段。综合IEDB和ABCpred数据库分析得出8条优势B细胞抗原表位。预测出来的T、B细胞候选表位将为结核病的特异性诊断及新的抗结核多表位疫苗的研究奠定基础。

旋毛虫21 KDa排泄分泌抗原二级结构及T细胞和B细胞表位预测

应用SYFPEITHI和Propred程序和多种预测方案对旋毛虫21 KDa排泄分泌抗原的T细胞表位、二级结构、疏水性、柔韧性、表面可能性、两性区以及B细胞表位进行预测．旋毛虫21KDa排泄分泌抗原存在2个较强的T细胞表位区，分别为第9～23位和第135-150位氨基酸位点；潜在的B细胞表位存在于从第28个氨基酸残基开始的广大区域内．预测结果为旋毛虫病诊断和新型疫苗研制提供候选抗原．

牡蛎过敏原Crag1的二级结构及其B细胞和T细胞表位分析

目的分析牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构及其B、T细胞表位,为探索基于抗原表位的免疫治疗奠定基础。方法从Uniprot数据库中获得牡蛎过敏原Cra g 1的氨基酸序列,通过DNA Star Protean软件,采用Garnier-Robson方法和Chou-Fasman方法分析其二级结构;采用Kyte-Doolittle法、Karplus-Schulz法、Emini法、Jameson-Wolf法综合分析Cra g 1主要的B细胞抗原表位。使用SYFPEITHI和NetMHC-Ⅱ在线网站分析T细胞抗原表位。结果牡蛎过敏原Cra g 1的二级结构主要为α-螺旋,其B细胞表位接近覆盖Cra g 1氨基酸全序列;而T细胞优势表位位于第89～103、108～122、129～143位肽段。结论本研究分析牡蛎过敏原Cra g 1的B、T细胞优势表位,为日后Cra g 1的基础免疫学研究,如疫苗的研制、诊断试剂的制备和其抗原性改造等提供了理论依据。

沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原的二级结构及B、T细胞表位分析

目的 分析沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原的二级结构及B、T细胞表位。方法 采用计算机在线预测网站PSIPRED V3.3对沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原蛋白的二级结构进行预测和分析;采用BCEpred和ABCpred网络软件对沙眼衣原体主要外膜蛋白B细胞表位进行预测和分析;采用SYFPEITHI在线软件对沙眼衣原体主要外膜蛋白的MHC-Ⅰ类HLA-A 0201限制性T细胞表位进行预测和分析。结果 沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原蛋白的二级结构中无规则卷曲结构占32.49%、α螺旋结构占41.62%、β-折叠结构占19.80%。沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原的B细胞表位氨基酸序列位点分别为41~50、92~101、51~60、306~315、260~269和160~169,MHC-Ⅰ类HLA-A 0201限制性T细胞表位氨基酸序列位点分别为201~209、379~387、3~11、126~134和177~185。结论沙眼衣原体主要外膜蛋白抗原的二级结构中无规则卷曲结构、α螺旋结构所占比例高,有6个B细胞表位和5个T细胞表位。

重组优势T、B细胞表位的猪圆环病毒2型Cap蛋白的原核表达及免疫原性研究

为探究猪圆环病毒2型(PCV2)优势T、B细胞表位对Cap蛋白免疫原性的影响,本研究将前期研究筛选到的PCV2 Rep和Cap蛋白中的T、B细胞表位,分别构建pET-rB-Cap、pET-rT-Cap和pET-rT-B-Cap重组质粒,并转化到大肠杆菌BL21中,经IPTG诱导表达后,采用SDS-PAGE和western blot检测3种重组蛋白:rB-Cap、rT-Cap和rT-B-Cap。结果显示,上述3种重组蛋白均高效表达且具有良好的反应原性。将70只4周龄~6周龄的BALB/c雌鼠随机分为7组,分别免疫不同的重组蛋白或者全病毒灭活疫苗,并对其产生的免疫原性进行检测。结果显示,各实验组小鼠的血清抗体水平均显著高于PBS组(p<0.01),其中rT-B-Cap组小鼠抗体水平显著高于PCV2全病毒灭活疫苗组和rCap组(p<0.01)。综上所述,PCV2 Cap蛋白同时串联T、B优势抗原表位时的免疫原性显著提高。本研究为PCV2多表位疫苗及基于Cap蛋白的亚单位疫苗的研究提供了新的途径。

禽流感病毒T细胞表位与体外重建鸡MHCⅠ类分子结合试验

为探讨体外重建的MHCⅠ复合体BF2-linker-β2 m鉴定病毒抗原肽系统能否在体外结合抗原多肽,以及不同类的MHCⅠ类分子结合相同和不同抗原多肽表位能力的差异,本研究采用人工合成的禽流感病毒的3条多肽,猪口蹄疫病毒的2条多肽,以及来源于草鱼呼肠孤病毒的2条多肽分别与4类体外重建的串联鸡MHCⅠ类分子复合体BF2-linker-β2 m进行了体外结合试验。BF2-linker-β2 m与不同的病毒抗原九肽按照1∶10的摩尔比进行混合,作用后取反应混合物离心除去未与MHCⅠ类分子结合的抗原多肽;然后取BF2-linker-β2 m分别与抗原多肽形成的复合体,利用酸洗法将结合的多肽自MHCⅠ类分子的抗原多肽结合槽中洗脱,洗脱后的蛋白和多肽混合物离心收集洗脱的多肽溶液,随后利用C18柱对洗脱的多肽进行去盐、脱酸处理;将多肽样品冻干,用基质溶解后直接点样进行一级质谱(MS)和二级质谱(MSMS)测定,结果表明,3类体外重建的BF2-linker-β2 m可与禽流感病毒多肽KILTIYSTV和LLLAIVSLV结合,而不与禽流感病毒多肽TIGECPKYV以及猪口蹄疫病毒和草鱼呼肠孤病毒的4条多肽结合。证实由于MHCⅠ类分子的多态性导致复等位基因的MHCⅠ类分子结合病毒抗原表位的能力存在差异;病毒的T细胞抗原表位是MHCⅠ类分子限制性的;KILTIYSTV和LLLAIVSLV是禽流感病毒的候选表位。

SARS病毒基因组所编码的E蛋白的二级结构和B细胞表位预测

目的 预测SARS病毒E蛋白的B细胞表位和二级结构。方法 以SARS病毒基因组序列为基础 ,采用Gar nier Robson方法、Chou Fasman方法和Karplus Schultz方法预测E蛋白质的二级结构 ;用Kyte Doolittle方案预测蛋白质的亲水性 ;用Emini方案预测蛋白质的表面可能性 ;用Jameson Wolf方案预测氨基酸的抗原性指数。综合评判 ,预测SARS病毒E蛋白的B细胞表位。结果 在SARS病毒E蛋白N 端的第 1～ 6、13～ 19、39～ 4 3、4 7～ 6 4区段和第 73～ 76区段有 β 折叠中心 ;第 6～ 12区段和第 6 7～ 6 9区段可能形成转角或无规则卷曲 ,是柔性区域。E蛋白N端第 2～ 13区段和第 6 1～ 74区段为B细胞优势表位区域。结论 用多参数预测SARS病毒E蛋白的二级结构和B细胞表位 。

人DAO氨基酸序列片段B-细胞表位的多参数预测

目的预测人二氨氧化酶 ( DAO)氨基酸序列片段 ( aa No.5 2 4- 6 18)的 B-细胞表位。方法应用 6种参数和方法进行综合分析 ,包括 Hopp & Woods亲水性参数、抗原性参数、可及性参数、β-转角、万氏及吴氏综合预测方法。结果显示 B-细胞识别的表位可能在 5 43- 5 5 3和 5 6 9- 5 95残基或其附近 ,5 6 9- 5 95残基 4种参数和方法的预测值均高于 5 43- 5 5 3残基 ,这两个被预测的表位均含有β-转角和不规则卷曲结构。结论本研究为应用合成肽抗原制备抗人

日本血吸虫22.6kDa抗原T细胞表位的重组、表达及初步鉴定

目的 鉴定日本血吸虫中国大陆株 2 2 .6kDa抗原 (Sj2 2 .6 )的T细胞表位。 方法 用计算机软件预测Sj2 2 .6分子的T细胞表位 ,设计并合成其编码核苷酸 ,定向克隆入融合表达载体pET 32c( + ) ,转化大肠杆菌BL2 1感受态细胞 ,经酶切及测序鉴定出重组克隆。阳性克隆经IPTG诱导表达 ,表达产物用NTA柱纯化。用纯化后的表位肽融合蛋白体外刺激C3H小鼠脾单个核细胞 ,3 H TdR掺入法检测其增殖。 结果 用计算机软件预测获得Sj2 2 .6抗原的 4个候选表位肽 ,并成功克隆入pET 32c( + )。其重组体均可表达分子量约 2 0kDa的融合蛋白 ,用NTA柱纯化后经 1 2 %聚丙烯酰胺凝胶电泳 (SDS PAGE)显示单一条带。其中P4、P5、P6融合蛋白能有效刺激小鼠脾单个核细胞增殖。 结论 从Sj2 2 .6抗原中初步鉴定出P4、P5、P6

肠道病毒71型六安地区分离株VP1基因的生物信息学分析及B细胞表位预测

目的对肠道病毒71型(EV71)VP1基因编码衣壳蛋白进行系统结构与功能预测,为制备EV71疫苗和诊断抗原的研究提供理论基础。方法基于编号为1404-Luan(CHN)-08的EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白的氨基酸序列,应用ProtParam、SigalP、TMPRED、Sosui、SOPMA、Phyre、Bepipred等生物信息学方法预测其信号肽、跨膜区、疏水性、二级结构、三级结构等性质和潜在的B细胞表位。结果 EV71六安地区分离株VP1基因编码蛋白没有信号肽,无跨膜区,是一个亲水性蛋白;VP1蛋白二级结构以无规则卷曲和β-片层为主,含有少量的α-螺旋,少见β-转角;VP1的三级结构中4～121氨基酸部分在蛋白表面形成一环状结构(VPl GH loop);EV71 VP1潜在的B细胞表位共有6个可能的抗原表位。其中,预测分值最高的线性表位区域位于157～177位氨基酸残基。结论成功预测了EV71六安地区分离株VP1二级结构、三级结构和B细胞表位,为制备EV71基因工程疫苗和诊断抗原的开发提供了理论基础。

人乳头瘤病毒16型L1蛋白B细胞表位预测

目的预测人乳头瘤病毒16型L1（HPV-16 L1）蛋白的B细胞表位。方法先从NCBI的蛋白质数据库中获得HPV-16 L1蛋白的氨基酸序列,再采用DNAStar中的Protean模块分析HPV-16型L1蛋白的二级结构、柔韧性、亲水性、表面可及性以及抗原性,然后结合吴玉章等建立的氨基酸抗原性指数方法计算其平均抗原指数（AI）,综合分析上述多个参数,预测其可能的B细胞表位区域,并用在线BLAST进行同源性匹配分析。结果综合分析多个参数,预测得出HPV-16 L1蛋白的B细胞表位可能位于第51～58、87～97、214～220、290～296、335～341、351～366、408～418、430～442和475～496肽段,进一步的同源性匹配分析显示肽段51～58、335～341、351～366、408～418、430～442以及475～496为其B细胞表位优势区域,其中肽段51（PIKKPNNN）58、351（SETTYKNTNFKEYLRH）366、408（PPPGGTLEDTY）418和430（KHTPPAPKEDPLK）442的氨基酸序列为HPV-16型L1蛋白所特有,而肽段475（KAKPKFTLGKRKATPTTSSTST）496与HPV-16 E1蛋白具有同源性、335（DTTRSTN）341的氨基酸序列与很多其他型别的HPV的L1蛋白具有同源性。结论综合多种方案预测得到HPV-16 L1的多个B细胞表位优势区域。

SARS病毒S蛋白的B细胞表位预测

目的 预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位。方法 基于SARS蛋白基因组序列 ,采用Kyte Doolittle的亲水性方案 ,Emini方案和Jameson Wolf抗原指数方案 ,辅以对S蛋白的二级结构中的柔性区域的分析 ,预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位。结果 推测最有可能的B细胞表位位于S蛋白N端第 91～ 98区段、第 112 1～ 115 3区段和第 185～ 193区段内或它们的附近。其它 ,如S蛋白N端第 10 5 0～ 10 5 9、75 2～ 765、41～ 5 0、666～ 674、2 64～ 2 87、3 40～ 3 48、40 8～ 416区段和第 42 4～ 43 9区段内或附近也可能存在B细胞表位。结论 用多参数预测SARS病毒S蛋白的B细胞表位 。

猪内源性反转录病毒囊膜蛋白基因的克隆及其蛋白二级结构和B细胞表位预测

猪内源性反转录病毒(PERV)是与猪-人异种移植病原安全性密切相关的一类病毒。env基因编码病毒的囊膜蛋白,它与病毒的亚型分类、宿主感染范围、细胞的嗜性以及对宿主细胞的感染机制、诱导宿主产生中和抗体等密切相关。本研究利用RT-PCR的方法,从五指山小型猪外周血淋巴细胞中扩增PERV的囊膜蛋白基因并进行测序,随后用生物信息学相关软件和方法,对PERV-Env蛋白二级结构及B细胞表位进行预测。经综合分析评价,结果发现PERV-Env蛋白有18个可能的B细胞优势抗原表位区域,7个可能的糖基化位点。该分析预测结果不但有利于PERV疫苗的设计、单抗及诊断试剂研制,而且将有助于分析Env蛋白的功能及PERV对人源细胞的感染机制。